Sažetak

Poremećaji hiperpigmentacije kože, poput melazme, pjegica i postupalne hiperpigmentacije (PIH), često su potaknuti ultraljubičastim-B (UVB) zračenjem, kožnim ozljedama i lokalnom upalom kože. Pretjerano taloženje melanina narušava izgled kože i negativno utječe na psihičko stanje bolesnika. Konvencionalna sredstva za depigmentaciju kao što je hidrokinon primarno ciljaju tirozinazu jednostrukim djelovanjem i nose dobro dokumentirane sigurnosne rizike. Višeciljane prirodne botaničke mješavine pojavile su se kao obećavajuće alternative za moderne funkcionalne kozmetičke formulacije.

Feniletanoidni glikozidi (PhG) su prepoznatljivi bioaktivni sastojci izolirani izCistanche deserticola, poznata ljekovita biljka iz sušnih pustinjskih krajeva. Glabridin (Gla), prenilirani izoflavan ekstrahiran izGlycyrrhiza glabra, nadaleko je poznat kao prirodni spoj koji posvjetljuje kožu visoke snage. Ovo istraživanje sustavno je istraživalo sinergističko djelovanje PhG-a u kombinaciji s glabridinom protiv hiperpigmentacije. In-vitro biokemijski testovi uključujući inhibiciju tirozinaze, DPPH i ABTS⁺ testove hvatanja slobodnih radikala primijenjeni su za preliminarni probir omjera mase. Nadalje su konstruirana tri stanična modela: model pigmentacije stanica mišjeg melanoma B16F10 ozračen UVB-om; upalni model HaCaT keratinocita stimuliran lipopolisaharidom (LPS); HaCaT model oksidativnog stresa izazvanog AAPH. Kvantificirani su pokazatelji koji pokrivaju unutarstaničnu aktivnost tirozinaze, sadržaj melanina, otpuštanje proupalnih citokina (IL-6, TNF-), aktivnost enzima superoksid dismutaze (SOD) i katalaze (CAT). Izračun indeksa kombinacije (CI) proveden je kako bi se kvantitativno identificirala sinergistička interakcija između dvaju botaničkih ekstrakata.

Među ispitanim omjerima, omjeri masa m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 i 10:1 pokazali su istaknutu sinergiju supresije tirozinaze i antioksidansa. Pri ukupnoj koncentraciji od 0,4 g/L u fiziološkoj otopini s fosfatnim puferom (PBS) pH 6,8, stope inhibicije tirozinaze dosegle su 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1) i 88,06 % (10:1). Odgovarajući postoci hvatanja radikala DPPH bili su 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %; ABTS⁺ kapacitet hvatanja kationskih radikala postigao je 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. Pri radnoj koncentraciji od 25 ug/mL, sve tri formulacije spoja nisu pokazale značajnu citotoksičnost prema B16F10 i HaCaT staničnim linijama. Skupina s mješavinom 1:1 generirala je vrhunsku sveobuhvatnu učinkovitost: rezidualna intracelularna aktivnost tirozinaze pala je na 23,80 %, relativni sadržaj melanina smanjio se na 30,90 %. Štoviše, PhGs/Gla (1:1) izvršio je najjaču supresiju izlučivanja IL-6 i TNF-a i maksimalno obnovio aktivnost antioksidativnih enzima SOD i CAT. Eksperimentalni rezultati potvrdili su da PhGs upareni s glabridinom postižu sinergističke rezultate protiv hiperpigmentacije putem trostrukih puteva: inhibicijom biosinteze melanina, ublažavanjem upale kože i suzbijanjem oksidativnog stresa. Maseni omjer 1:1 pruža optimalnu integriranu biološku učinkovitost. Ova studija pruža eksperimentalne dokaze koji podupiru primjenuCistanchekompozitni materijali feniletanoidni glikozidi-glabridin u razvoju sirovina za izbjeljivanje kože biljnog podrijetla za clean-beauty.

Ključne riječi: Cistanche deserticolafeniletanoidni glikozidi; glabridin; sinergistički učinak; protiv hiperpigmentacije; antioksidans; protuupalno; kozmetičke botaničke sirovine

1. Uvod

Pretjerano nakupljanje melanina u epidermalnim slojevima rezultira heterogenim fenotipovima pigmentacije kože, uključujući melazmu, efelide i postinflamatornu hiperpigmentaciju (PIH). Višestruki vanjski i unutarnji pokretački čimbenici doprinose patološkoj prekomjernoj proizvodnji melanina. UVB ultraljubičasto zračenje predstavlja primarni okolišni okidač; traume kože i kronične lokalne upalne reakcije dodatno pojačavaju pigmentne poremećaje. Dobro je utvrđeno da unakrsni razgovor između epidermalnih keratinocita i melanocita dominira progresijom pigmenta. Nakon vanjske stimulacije, aktivirani keratinociti oslobađaju reaktivne kisikove vrste (ROS) i proupalne medijatore. Ove signalne molekule difundiraju i djeluju na susjedne melanocite, regulirajući katalitičku aktivnost tirozinaze, ubrzavajući sintezu melanina i potičući transport melanosoma prema keratinocitima, stvarajući konačno vidljive pigmentirane lezije na površini kože. U skladu s tim, učinkovita intervencija za hiperpigmentaciju ne može se usredotočiti samo na inhibiciju tirozinaze. Multimodalne terapijske strategije trebale bi istovremeno pokrivati ​​inhibiciju melanogeneze, protuupalnu intervenciju i neutralizaciju oksidativnog stresa.

Tradicionalni sintetski aktivni sastojci za posvjetljivanje kože kao što je hidrokinon isporučuju učinkovitost depigmentacije uglavnom izravnom supresijom tirozinaze. Unatoč tome, mehanizmi s jednom metom ograničavaju praktičnu izvedbu, a dugotrajna lokalna primjena hidrokinona može izazvati iritaciju kože, kontaktni dermatitis i potencijalne sigurnosne opasnosti, ograničavajući opseg uporabe kozmetičke kvalitete. Prirodni biosastojci biljnog podrijetla privlače sve veći interes kozmetičkih formulatora i potrošača zbog svojih blagih profila i višestrukog farmakološkog djelovanja. Složene mješavine različitih botaničkih ekstrakata sposobne su proizvesti sinergijske biološke učinke, povećavajući ukupnu učinkovitost uz smanjenje zahtjeva za učinkovitom dozom, što otvara nove tehničke smjernice za istraživanje kozmetičkih sirovina protiv pigmentacijeGoogle

Cistanche deserticola, obično nazvan "pustinjski ginseng", klasična je tonična biljka u tradicionalnoj kineskoj medicini. Suvremena fitokemijska istraživanja otkrivaju da feniletanoidni glikozidi (PhGs) čine njegovu glavnu farmakološki aktivnu frakciju, uključujući ehinakozid i akteozid kao reprezentativne spojeve. Objavljena farmakološka istraživanja pokazuju da PhG-ovi posjeduju snažnu antioksidacijsku sposobnost, protuupalnu bioaktivnost i umjereni inhibicijski potencijal tirozinaze, što ukazuje na perspektivu primjene u dermatološkim materijalima za njegu kože. Glabridin je karakterističan izoflavonoidni spoj izoliran izGlycyrrhiza glabrakorijen, u kozmetičkoj industriji poznat kao "zlato za izbjeljivanje". Snažno potiskuje melanogenezu i istodobno modulira kožne upalne kaskade. Iz teorijske perspektive tradicionalne medicine,Cistanchehrani esenciju bubrega i tonizira yang, dok korijen sladića tonizira slezenu i čisti toplinske toksine. Kombinirana uporaba u skladu je s načelima kompatibilnosti spojeva biljnih dermatoloških terapija.

Mehanička hipoteza tvrdi da kombinacija PhGs-glabridina može regulirati pigmentaciju kože putem višeciljnih i višeputnih načina: zajedničko inhibiranje katalitičke funkcije tirozinaze kako bi se prekinuo izvor stvaranja melanina; gašenje nakupljanja reaktivnih vrsta kisika; obuzdavanje prekomjernog otpuštanja proupalnog čimbenika, kako bi se prekinulo pojačanje signala posredovano ROS-om i citokinima za aktivaciju melanocita. Do danas je nekoliko istraživačkih radova sustavno izvještavalo o sinergističkoj procjeni protiv hiperpigmentacije za ovu binarnu smjesu.

Ovaj rad ima za cilj istražiti kombinirane biološke učinke izmeđuCistanchefeniletanoidni glikozidi i glabridin. Prvi su provedeni biokemijski in-vitro inhibicijski eksperimenti enzima i uklanjanje radikala. Za višedimenzionalnu procjenu učinkovitosti konstruirana su tri reprezentativna stanična modela koji oponašaju taloženje pigmenta, upalu kože i oksidativno oštećenje. Metodologija indeksa kombinacije primijenjena je za kvantificiranje interakcija sinergije ili antagonizma. Cilj nam je bio odrediti optimalni omjer mase spoja, razjasniti funkcionalne mehanizme trostrukog načina rada i pružiti podršku eksperimentalnim podacima za razvoj prirodnih sinergističkih kozmetičkih sirovina za posvjetljivanje kože.

2. Materijali i metode

2.1 Reagensi, sojevi stanica i laboratorijski instrumenti

B16F10 stanična linija mišjeg melanoma (STCC20013G-1) kupljena je od Saierbio Co., Ltd. Besmrtni ljudski epidermalni keratinocit HaCaT (iCell-h066) dobiven je od iCell Bioscience Inc.Cistanchefeniletanoidne glikozide (PhGs) i glabridin (Gla) komercijalno je isporučio Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Gljiva tirozinaza, arbutin, L-tirozin, L-DOPA, DPPH, ABTS diamonijeva sol, L-askorbinska kiselina (vitamin C), AAPH, LPS, Triton X‑100, DMSO i drugi kemijski reagensi analitičke kvalitete nabavljeni su od glavnih dobavljača biokemijskih reagensa. Potrošni materijal za kulturu stanica uključivao je DMEM medij s visokim sadržajem glukoze, fetalni goveđi serum, miješanu otopinu penicilina i streptomicina. Kompleti ELISA testa koji ciljaju na humani IL-6, TNF-, CAT i kompleti za otkrivanje ukupnog SOD-a nabavljeni su od odgovarajućih biotehnoloških proizvođača.

Ključna laboratorijska oprema sadržavala je Multiskan FC čitač mikropločica pune valne duljine, Heracell 371 CO₂ inkubator (Thermo Fisher); KQ‑200VDB ultrazvučni čistač; vodena kupelj konstantne temperature; DHG‑9246A pećnica za brzo sušenje; KN4006B UVB ultraljubičasti instrument za zračenje s izlaznom zračenjem od 8 mW/cm².

2.2 Priprema otopine uzorka

Zalihe otopina PhG i glabridina pripremljene su u pH 6,8 PBS puferu ili 50 % (v/v) otapalu etanol-voda, serijski razrijeđene na radne koncentracije: 0,001 g/L, 0,005 g/L, 0,025 g/L, 0,1 g/L, 0,4 g/L, 0,8 g/L, 1,2 g/L, 1,6 g/L, 2,0 g/L. Devet kompozitnih skupina konfigurirano je pri fiksnoj ukupnoj masenoj koncentraciji od 0,4 g/L s različitim masenim udjelima m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, označenim kao PhGs/Gla (40:1) za PhGs/Gla (1:40).

Za testove staničnih eksperimenata, uzorci praha otopljeni su u mediju DMEM bez seruma kako bi se pripremila serija otopina radne koncentracije.

2.3 Biokemijska in-vitro ispitivanja

2.3.1 Test inhibicije tirozinaze

50 µL otopine uzorka, 50 µL pH 6,8 PBS i 50 µL 1 g/LL-tirozin otopine supstrata uzastopno je dodano u svaku jažicu na mikroploči s 96 jažica. Predinkubacija je trajala 10 minuta u vodenoj kupelji od 37 stupnjeva. Zatim je dodano 50 μL otopine tirozinaze gljive (200 U/mL) od 0,4 g/L, a inkubacija je nastavljena na 37 stupnjeva 10 minuta. Arbutin je funkcionirao kao supstanca pozitivne kontrole, slijepa kontrola je prihvatila pH 6,8 PBS pufer. Vrijednost apsorpcije izmjerena je pod valnom duljinom od 490 nm na čitaču mikropločica. Formula za izračun stope inhibicije tirozinaze:

Stopa inhibicije tirozinaze (%)={1 − [(A_reaction − A_reaction‑control) / (A_blank − A_blank‑control)]} × 100 %

Gdje je: A_reakcija: apsorbancija koja sadrži uzorak, supstrat, PBS i tirozinazu; A_reaction-control: apsorbancija uzorka, supstrata i PBS-a bez enzima; A_prazno: apsorbancija supstrata, PBS i tirozinaze; A_prazna kontrola: apsorbancija samo za supstrat i PBS pufer.

2.3.2 DPPH određivanje hvatanja slobodnih radikala

DPPH prah je otopljen u bezvodnom etanolu da se pripremi 0,2 mmol/L DPPH radne tekućine. PhGs, glabridin i referentna tvar vitamina C otopljeni su u otapalu 50 % etanol-voda da se dobiju temeljne otopine gradijenta koncentracije. Uzorci binarne smjese s devet omjera mase ravnomjerno su pomiješani. Svaka jažica primila je 100 μL tekućine uzorka plus 100 μL DPPH radne otopine. Nakon temeljitog miješanja, mikroploča je držana podalje od svjetla na sobnoj temperaturi 30 minuta. Očitavanje apsorpcije zabilježeno je na λ = 517 nm. Vitamin C je djelovao kao pozitivna kontrola, svaka eksperimentalna skupina ponovljena je u 3 biološka ponavljanja. Formula stope uklanjanja DPPH-a:

Stopa čišćenja DPPH (%)={1 − [(A₁ − A3) / A₂]} × 100 %

A₁: apsorbancija uzorka + DPPH radna tekućina; A₂: apsorbancija 50 % etanola + DPPH radna tekućina; A3: apsorbancija otopine uzorka pomiješane s otapalom od 50 % etanola.

2.3.3 ABTS⁺ Test hvatanja kationskih radikala

7,4 mmol/L temeljne otopine ABTS i 2,6 mmol/L otopine kalijevog persulfata jednako su pomiješane, inkubirane u tamnom okruženju 12 h kako bi se proizveo stabilni ABTS⁺ radni reagens. Otopine uzoraka konfigurirane su prema protokolima opisanim u odjeljku 2.3.2. 40 μL otopine uzorka i 160 μL ABTS⁺ radne tekućine pipetirano je u jažice mikropločice. Nakon inkubacije zaštićene svjetlom tijekom 6 minuta na sobnoj temperaturi, apsorbancija je izmjerena na 734 nm. ABTS⁺ formula za brzinu hvatanja radikala:

Stopa uklanjanja ABTS⁺ (%)={1 − [(A₁ − A3) / A₂]} × 100 %

A₁: apsorbancija otopine uzorka plus ABTS⁺ radna otopina; A₂: apsorbancija deionizirane vode pomiješane s ABTS⁺ radnim reagensom; A₃: vrijednost apsorbancije za otopinu uzorka pomiješanu s otapalom čiste deionizirane vode.

2.4 Postupci kulture stanica

Stanice melanoma B16F10 i keratinociti HaCaT uzgajani su u DMEM mediju s visokim sadržajem glukoze dopunjenom s 10 % fetalnog goveđeg seruma i 1 % penicilin-streptomicina. Parametri inkubatora: 37 stupnjeva, 5 % volumnog udjela CO₂, relativna vlažnost 70 %. Pasaža stanica i osvježenje medija izvedeni su u skladu s gustoćom rasta stanica promatranom pod invertnim optičkim mikroskopom. Stanice u fazi logaritamskog rasta sakupljene su za naknadno nasađivanje na pločice s 96 jažica.

2.5 Uspostava triju staničnih funkcionalnih modela

2.5.1 Model B16F10 pigmentacije izazvan UVB-om

Nakon 1 h predtretmana s odgovarajućim uzorkom medija, površina sloja stanica prekrivena je PBS puferom. Intenzitet UVB zračenja postavljen je na 8 mW/cm², udaljenost zračenja 3 cm, trajanje zračenja 110 s. Normalna skupina primila je identičan medij bez intervencije UVB zračenja. Kontrolna skupina modela dobila je predtretman PBS-om nakon čega je uslijedilo izlaganje jednakim dozama UVB zraka bez dodavanja uzorka.

2.5.2 Model inflamatorne aktivacije HaCaT posredovan LPS-om

Stanice HaCaT prethodno su inkubirane s medijem DMEM uzorka za testiranje tijekom 24 sata. Nakon toga je dodana otopina lipopolisaharida LPS da se postigne konačna koncentracija od 20 ug/mL, a kokultura je trajala još 24 sata. Stanice modelne skupine bile su izazvane LPS-om bez prethodne obrade uzorka. Normalna skupina održavala je uobičajenu potpunu srednju kultivaciju.

2.5.3 HaCaT model oksidativnog stresa izazvan AAPH

Stanice su dobile 24-satnu predinkubaciju uzorka. AAPH reagens dodan je u medij kulture, konačna koncentracija 25 mmol/L, nastavak inkubacije 24 sata. Model-kontrolna skupina stimulirana je AAPH bez intervencije uzorka. Normalna kontrolna skupina rasla je pod uobičajenim uvjetima medija.

Sve skupine staničnih modela sadržavale su tri jažice s tehničkim replikacijama.

2.6 Test citotoksičnosti (CCK-8 metoda)

Stanična suspenzija podešena je na gustoću 1 × 10⁴ stanica/mL i inokulirana u mikropločice s 96 jažica. Nakon prianjanja stanica, primijenjen je medij s uzorkom koncentracije gradijenta, a inkubacija je nastavljena 24 h, 48 h, 72 h. Reagens za detekciju CCK-8 pomiješan sa svježim medijem DMEM (volumenni udio 10 %) zamijenio je stari medij, inkubacija je trajala 60 minuta. Čitač mikropločica izmjerio je apsorbanciju na valnoj duljini od 450 nm. Formula za izračun relativnog postotka održivosti stanica:

Preživljavanje stanica (%)=[(A_uzorak − A_prazno) / (A_0 − A_prazno)] × 100 %

A_uzorak: apsorbancija jažice koja sadrži stanice, reagens CCK-8 i medij uzorka; A_prazno: apsorbancija za medij kulture plus CCK‑8 bez nasađenih stanica; A_0: apsorbancija stanica i CCK-8 reagensa uzgojenih sa praznim medijem (bez testnih uzoraka).

2.7 Kvantifikacija unutarstanične aktivnosti tirozinaze

Nakon 48 h obrade uspostavljanja modela, stanični supernatant je odbačen. Stanični monosloj ispran je dva puta s pH 7,4 PBS. 50 μL 1 % otopine za lizu Triton X-100 dodana je po jažici. Mikroploča je zamrznuta na -80 stupnjeva u hladnjaku 30 minuta, zatim odmrznuta na sobnoj temperaturi za potpuno pucanje stanične membrane. Tretman pred zagrijavanjem na 37 stupnjeva trajao je 5 minuta. Supstrat L‑DOPA (10 mmol/L, 10 μL) je dopunjen. Mikroploča je inkubirana 1 sat unutar CO₂ inkubatora. Apsorpcija je detektirana na 475 nm za izračunavanje relativne intracelularne aktivnosti tirozinaze.

2.8 Mjerenje unutarstaničnog sadržaja melanina

Za detekciju sadržaja melanina usvojena je metoda cijepanja NaOH. Nakon intervencije na modelu od 72 sata, supernatant kulture je uklonjen, stanice su dvaput isprane pomoću PBS pufera. 100 μL 1 mol/L vodene otopine NaOH koja sadrži 10 % DMSO. Mikroploča je inkubirana u pećnici na 90 stupnjeva 60 minuta za potpuno otapanje melanina. Apsorbancija je očitana na 490 nm kako bi se izračunao relativni postotak sadržaja melanina.

2.9 Detekcija čimbenika upale i pokazatelja enzima antioksidansa

Nakon 48 h obrade modela, HaCaT stanice su sastrugane i sakupljene, centrifugirane da se prikupi stanični supernatant. Komercijalni ELISA setovi korišteni su za kvantitativno određivanje koncentracija IL-6 i TNF-proupalnih citokina. Za testiranje antioksidativnog enzima, stanične pelete podvrgnute su ponovljenim ciklusima smrzavanja-odmrzavanja kako bi se postigla fragmentacija stanica. Uvjeti centrifugiranja: 12 000 okr/min, 4 stupnja, 10 min. Frakcija supernatanta je sakupljena kako bi se ispitala vitalnost SOD i sadržaj enzima CAT prema operativnim specifikacijama kompleta.

2.10 Analiza indeksa kombinacije (CI).

Chou-Talalayjev algoritam kombiniranog indeksa (CI) implementiran je za procjenu sinergističke/aditivne/antagonističke interakcije između PhG i glabridina unutar testova inhibicije tirozinaze i antioksidansa:

CI=D₁/DX₁ + D₂/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 predstavlja antagonističku interakciju; CI ≈ 1 znači aditivni učinak; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Statistička analiza

Ishodi eksperimentalnog mjerenja izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (srednja vrijednost ± SD). Softver GraphPad Prism 9.5.0 izvršio je statistički izračun. Jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) korištena je za usporedbu više grupa. P-vrijednost< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Rezultati i rasprava

3.1 In vitro inhibitorna učinkovitost tirozinaze uzoraka PhG, glabridina i binarne smjese

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhGs.

Pri ukupnoj koncentraciji od 0,4 g/L za spoj PBS otopine, PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) dali su stopu inhibicije tirozinaze od 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. I omjeri 5:1 i 1:1 nadmašili su učinkovitost inhibicije jednokomponentnih PhG (36,92 %) i jednokomponentnog glabridina (92,71 %) pri odgovarajućoj ukupnoj masenoj koncentraciji. Skupina 1:1 postigla je veličinu inhibicije usporedivu s arbutinom pozitivne kontrole. Prema rezultatima izračuna CI-vrijednosti: m(PhGs):m(Gla) u rasponu od 40:1 do 1:1 generirani CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, manifestirajući antagonističku interakciju.

Fenolne hidroksilne skupine čine središnji funkcionalni dio za inhibicijski kapacitet tirozinaze. PhG-ovi sadrže orto-dihidroksifenilne strukturne fragmente sposobne kelirati bakrene ione unutar katalitički aktivnog džepa tirozinaze, kompetitivno ometajući vezanje enzima supstrata. Kostur izoflavana glabridina nosi 2-OH i 4-OH skupine na svom B-prstenu, strukturno analogno L-tirozin / L-DOPA aromatskom hidroksil-supstituiranom prstenu, omogućujući kompetitivno zauzimanje domene enzimskog aktivnog mjesta. Nakon miješanja spojeva, kumulativna količina fenol-hidroksila raste; u međuvremenu, dvije molekule mogu se pričvrstiti na različita mjesta vezanja proteina tirozinaze, zajedno pojačavajući inhibitornu učinkovitost.

3.2 Antioksidacijska aktivnost testnih uzoraka za hvatanje radikala

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridin. PhG-ovi su bogati kafeoilnom skupinom i 3,4-dihidroksifeniletanolnim dijelovima, s konjugiranim sustavima dvostrukih veza koji jačaju učinak neutralizacije slobodnih radikala. Glabridin flavonoid okvir također opskrbljuje hidroksilne skupine i proširenu arhitekturu konjugiranog prstena za stabilizaciju nesparenih elektrona iz reaktivnih vrsta kisika.

Tri obećavajuće skupine spojeva PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) pokazale su izvrsne performanse čišćenja DPPH‑ i ABTS⁺‑. Stopa uklanjanja ABTS⁺‑ dosegla je gotovo 100 %, što ukazuje na gotovo potpunu eliminaciju kationskih slobodnih radikala. Različiti omjeri mase proizvode različita stanja molekularne interakcije između dviju molekula, što dovodi do razlika u statusu izloženosti hidroksilnih skupina i rezultira divergencijom sinergijske veličine antioksidansa.

3.3 Procjena citotoksičnosti PhG, glabridina i miješanih pripravaka

Ispitivanje citotoksičnosti CCK-8 pokazalo je da PhG unutar opsega koncentracije od 62,5 ~ 500 ug/mL i glabridina od 6,25 ~ 25 ug/mL nisu doveli do očitog smanjenja održivosti staničnih linija B16F10 i HaCaT. U uvjetima koncentracije ukupne mase od 25 ug/mL, tri skupine omjera spojeva PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) održale su visoku vitalnost stanica, ne pokazujući citotoksični učinak koji se može otkriti protiv oba soja stanica. Stoga je 25 ug/mL odabrano kao sigurna radna koncentracija za kasniju procjenu stanične funkcije. Za skupine s jednim lijekom, PhGs niske-/srednje-/visoke doze definirane su kao 125 ug/mL, 250 ug/mL, 500 ug/mL; glabridin niske-/srednje-/visoke doze: 6,25 ug/mL, 12,5 ug/mL, 25 ug/mL.

3.4 Utjecaj na unutarstaničnu aktivnost tirozinaze i sadržaj melanina u UVB-stimuliranim B16F10 stanicama

Nakon tretmana UVB zračenjem, model-skupina B16F10 pokazala je statistički značajno povećanje unutarstanične aktivnosti tirozinaze i nakupljanja melanina (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

Pri jedinstvenoj ukupnoj koncentraciji od 25 ug/mL, skupine spojeva pokazale su superiorne biološke rezultate u odnosu na jednokomponentne analoge. Između tri omjera, PhGs/Gla (1:1) postigao je optimalan učinak: rezidualna intracelularna aktivnost tirozinaze samo 23,80 %, relativni sadržaj melanina pao je na 30,90 %. Statistička usporedba otkrila je značajnu razliku u usporedbi sa skupinama spojeva 5:1 i 10:1. Omjer 1:1 pokazao je istaknuto sinergističko pojačanje za obuzdavanje biosinteze melanina unutar stanica melanocita.

UVB-zračenje izaziva kaskadu melanogene signalizacije svojstvenu melanocitima, regulirajući ekspresiju transkripcijskog faktora MITF i dodatno inducirajući prekomjernu ekspresiju proteina tirozinaze. Rezultati naših staničnih eksperimenata potvrdili su da PhG u kombinaciji s glabridinom mogu učinkovito preokrenuti UVB-induciranu aktivaciju tirozinaze i smanjiti stvaranje melanina.

3.5 Protuupalni učinak na HaCaT keratinocite izazvane LPS-om

Stimulacija LPS-om snažno je povećala izlučivanje proupalnih citokina IL-6 i TNF-a u skupini HaCaT modela (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). Formulacija 1:1 generirala je maksimalno smanjenje oslobađanja IL-6 i TNF-a, nadmašujući inhibicijski učinak dobiven zasebnom primjenom PhG-a ili glabridina.

Objašnjenje molekularnog mehanizma: PhGs fenolno-hidroksilni dio čisti slobodne radikale koji izazivaju upalu; štoviše, PhG mogu interferirati unutarstanične signalne kaskade NF‑κB i MAPK kako bi obuzdali transkripciju proupalnog gena. Glabridin inhibira fosforilaciju stresom aktivirane kinaze JNK i p38, blokirajući nizvodnu transdukciju upalnog signala. Pojedinačna tvar može samo djelomično potisnuti aktivaciju puta upalnog signala. Binarna kombinacija istovremeno intervenira na više čvorova unutar upalne signalne mreže, postižući sinergijsko protuupalno djelovanje.

Kožna upala služi kao ključni uzvodni pokretač za pojavu PIH-a. Upalni citokini koje luče keratinociti djeluju kao parakrini signalni glasnici, potičući susjedne melanocite da ubrzaju proizvodnju melanina i prijenos melanosoma. Učinkovito ublažavanje epidermalne upale ključno je za sprječavanje i poboljšanje hiperpigmentacijskih lezija. Stoga, protuupalna prednost spoja PhGs-glabridin daje dodatnu vrijednost za primjenu kozmetičkog materijala protiv pigmentacije.

3.6 Kapacitet regulacije enzima antioksidansa u uvjetima oksidativnog stresa izazvanog AAPH

AAPH model-skupina oksidativnog stresa pokazala je očigledan pad unutarstanične vitalnosti enzima antioksidansa SOD i CAT (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Koža izložena ultraljubičastom zračenju stvara veliku količinu reaktivnih vrsta kisika. Višak ROS-a ne samo da izravno oksidira biomolekule povezane sa sintezom melanina, već također aktivira višestruke melanogene signalne putove. Endogeni antioksidativno-enzimski sustav (SOD, CAT) predstavlja glavnu obrambenu barijeru za uklanjanje unutarstaničnog ROS-a. Kada oksidativni stres prevlada nad intrinzičnim antioksidativnim kapacitetom, akumulacija ROS-a ubrzava napredovanje pigmentacije. Spoj PhGs-glabridin ne samo da izravno hvata slobodne radikale putem fenol-hidroksilne kemijske reakcije, već također popravlja funkciju staničnog antioksidativnog enzimskog sustava, ublažavajući oštećenja uzrokovana oksidativnim stresom iz dvije dimenzije. Različiti omjeri mase mijenjaju obrazac molekularne interakcije između dviju prirodnih molekula, što dovodi do razlike u konačnoj učinkovitosti regulacije antioksidansa.

3.7 Sveobuhvatna rasprava o mehanizmu sinergijske anti-hiperpigmentacije

Patološki proces hiperpigmentacije kože tvori složenu signalnu mrežu: UVB zračenje djeluje i na melanocite i na okolne keratinocite. Keratinociti otpuštaju ROS i proupalne citokine. Ovi bio-signali dalje aktiviraju melanocite, reguliraju aktivnost tirozinaze, potiču biosintezu melanina i olakšavaju transport melanosoma prema epidermalnim keratinocitima, što konačno dovodi do vidljivog taloženja pigmenta na površini kože. Prema tome, inhibicija tirozinaze s jednim ciljem ne može u potpunosti preokrenuti patološku pigmentaciju. Strategija višestruke intervencije trebala bi integrirati inhibiciju melanogeneze, protuupalnu i antioksidacijsku zaštitu.

Naši eksperimentalni rezultati pokazali su da PhG u kombinaciji s glabridinom ostvaruju multimodalnu intervenciju protiv hiperpigmentacije:

Izravno potiskuje katalitičku aktivnost tirozinaze unutar melanocita kako bi se inhibirao izvor biosinteze melanina;

Inhibira prekomjerno izlučivanje proupalnih citokina iz keratinocita, prekidajući signal parakrine upalne stimulacije prema melanocitima;

Uklonite višak reaktivnih vrsta kisika i obnovite aktivnost endogenog SOD/CAT antioksidativnog enzima, ublažavajući pojačavanje pigmenta posredovano oksidativnim stresom.

Omjer m(PhGs):m(Gla) = 1:1 pokazao je optimalnu sveobuhvatnu sinergističku izvedbu u biokemijskoj inhibiciji enzima, hvatanju radikala, modelu pigmenta melanocita, modelu upale keratinocita i modelu oksidativnog stresa. Ovaj omjer nadmašio je skupine 5:1 i 10:1 u gotovo svim pokazateljima testiranja. Sinergija može potjecati iz komplementarnih molekularno-strukturnih karakteristika: PhG-ovi i glabridin posjeduju različite okvire fenolnog skeleta, u interakciji s različitim ciljnim proteinima (tirozinaza, upalne signalne kinaze, putevi povezani s antioksidativnim enzimima). Nakon miješanja spojeva, status izloženosti fenol-hidroksilu je optimiziran kroz međumolekularnu interakciju, poboljšavajući ukupnu biološku aktivnost.

Iz praktične perspektive kozmetičke industrije, sinergijski botanički spojevi sirovina donose dvije velike prednosti. Prvo, sinergistički učinak omogućuje smanjenje potrebne doze za svaki pojedini aktivni sastojak, smanjujući troškove formulacije; drugo, višestruki funkcionalni profil odgovara složenom patološkom mehanizmu klinički uočene hiperpigmentacije kože kao što su PIH i melazma, nudeći teorijsku osnovu za razvoj visoko učinkovitih kozmetičkih formula za prirodno posvjetljivanje kože.

4. Zaključak

Ovo istraživanje sustavno je procijenilo sinergističku bioaktivnost protiv hiperpigmentacijeCistanche deserticola-izvedenofeniletanoidni glikozidi (PhGs) u kombinaciji s glabridinom (Gla). Biokemijski in-vitro probir i tri reprezentativna stanična modela korišteni su za višedimenzionalnu karakterizaciju učinkovitosti. Glavni eksperimentalni zaključci sažeti su kako slijedi:

Unutar in-vitro biokemijskih testova za inhibiciju tirozinaze i hvatanje slobodnih radikala, formulacije spojeva m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 pokazale su povoljan inhibicijski učinak i sinergističku interakciju. Pod ukupnom koncentracijom od 0,4 g/L u pH 6,8 PBS, stope inhibicije tirozinaze dosegle su 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1), 88,06 % (10:1). Stope hvatanja DPPH-radikala: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. ABTS⁺‑stope hvatanja radikala: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

U sigurnoj radnoj koncentraciji od 25 ug/mL, PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) DMEM otopine nisu pokazale citotoksičnost protiv B16F10 stanica melanoma i HaCaT ljudskih keratinocita. Među ovim skupinama, PhGs/Gla (1:1) postigao je najbolju integriranu učinkovitost: unutarstanična aktivnost tirozinaze smanjena je na 23,80 %, sadržaj melanina smanjen na 30,90 %. Generirao je najjaču inhibiciju oslobađanja IL-6, TNF-upalnih citokina i maksimalnu obnovu vitalnosti SOD i CAT antioksidativnih enzima. Skupina s omjerom mase 1:1 pokazala je očiti sinergistički učinak poboljšanja bolji od skupina s jednim agensom i drugih skupina s omjerom spojeva.

Binarna mješavina PhGs i glabridina ima učinak protiv hiperpigmentacije kože putem trostrukih puteva: potiskivanjem biosinteze melanina, ublažavanjem epidermalne upale i suzbijanjem oštećenja izazvanih oksidativnim stresom. Optimalni sinergistički omjer mase m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Ova studija pruža eksperimentalne dokaze i tehničku podršku za razvoj prirodnih višenamjenskih kozmetičkih sirovina biljnog podrijetla za primjenu u posvjetljivanju kože i borbi protiv pigmentacije.

Priznanja

Ovaj je rad financijski podržala Nacionalna zaklada za prirodne znanosti Kine (potpora br. . 82160772). Zahvaljujemo Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research na potpori eksperimentalne platforme.

Reference

[1] Nautiyal A, Wairkar S. Upravljanje hiperpigmentacijom: Trenutačni tretmani i nove terapije [J]. Istraživanje pigmentnih stanica i melanoma, 2021., 34(6):1000-1014.

[2] Yardman-Frank JM, Fisher D E. Pigmentacija kože i njezina kontrola: Od ultraljubičastog zračenja do matičnih stanica [J]. Eksperimentalna dermatologija, 2021, 30(4):560-571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M, et al. Liječenje melazme: sustavni pregled [J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022., 33(4):1816-1837.

[4] Hossain MR, Ansary TM, Komine M, et al. Različiti upalni putovi izazvani podražajima uzrokuju pigmentaciju kože[J]. Međunarodni časopis za molekularne znanosti, 2021., 22(8):3970.

[5] Song X, Ni M T, Zhang Y, et al. Usporedba inhibicijskih sposobnosti epigalokatehin-3-galata i galokatehin galata protiv tirozinaze i njihovih kombiniranih učinaka s kojičnom kiselinom [J]. Kemija hrane, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad T F, et al. Ciljanje tirozinaze kod hiperpigmentacije: trenutni status, ograničenja i buduća obećanja [J]. Biokemijska farmakologija, 2023, 212:115574.

[7] Cicero AL, Delevoe C, Gilles-Marsens F, et al. Egzosomi koje oslobađaju keratinociti moduliraju pigmentaciju melanocita[J]. Nature Communications, 2015., 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto J M. Intrinzična i vanjska regulacija melanogeneze i pigmentacije ljudske kože [J]. Međunarodni časopis za kozmetičku znanost, 2018., 40(4):328-347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U, et al. Mehanički pristup toksičnosti i procjeni rizika teških metala, hidrokinona i mikroorganizama u kozmetičkim kremama [J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du X S, Zhang L, et al. Reakcija iritacije kože izazvana hidrokinonom mogla bi se postići aktiviranjem mastocita preko receptora X2[J] povezanog s G proteinom povezanog s masom. Experimental Dermatology, 2023, 32(4):436-446.

[11] Meng H, Liu X K, Li JR, et al. Bibliometrijska analiza učinaka ginsenga na kožu [J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022., 21(1):99-107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H, et al. Napredak u biomedicinskim funkcijama prirodnih tvari za izbjeljivanje u liječenju bolesti pigmentacije kože [J]. Pharmaceutics, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J, et al. Sinergistička njega kože polifenola Lonicera japonica i etanolnog ekstrakta Vaccinium vitis‑idaea L.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40(3):627-637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W, et al. Primjena kompleksa hlapivog ulja Salvia miltiorrhiza i ekstrakta maslačka u kozmetici [J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562-568.

[15] Chen JR, Zhu XY, Cui HY, et al. Varijacije aktivnih sastojaka i analiza antioksidativnih aktivnosti Cistanche deserticola iz različitih pasmina i dijelova u pokrajini Xinjiang [J]. Znanost i tehnologija prehrambene industrije, 2024., 45(21):227-233.

[16] Xiao L Y, Yao J, Miao Y Y, et al. Tubulozid B, izoliran iz Cistanche tubulosa, obećavajuće sredstvo protiv aktivacije M1 makrofaga sinergističkim ciljanjem na Mob1 i ERK1/2[J]. Biomedicina & Pharmacotherapy, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Studija o transdermalnoj isporuci feniletanoidnih glikozida Herba cistanches i inhibicijskim učincima na sintezu melanina u B-induciranoj pigmentaciji u smeđeg zamorca[D]. Urumqi: Medicinsko sveučilište Xinjiang, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. Sinergističko izbjeljivanje, antioksidativno i protuupalno djelovanje kompleksa glabridina, resveratrola i poldatina [J]. Flavour Fragrance Cosmetics, 2024(3):99-107,233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. Studija i primjena metode Chou-Talalay za kombinaciju lijekova protiv tumora [J]. Kineski časopis za modernu primijenjenu farmaciju, 2013., 30(4):449-453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Sredstva za izbjeljivanje kože: Perspektiva inhibitora tirozinaze iz medicinske kemije [J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2017., 32(1):403-425