Swertiajaponin inhibira pigmentaciju kože dvostrukim mehanizmom za suzbijanje tirozinaze 2. dio
Mar 21, 2023
Cistancheje uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžuje život". Njegova glavna komponenta je cistanozid, koji ima različite učinke poput antioksidansa, protuupalnih i poticanja imunoloških funkcija. Mehanizam između cistanche i izbjeljivanja kože leži u antioksidativnom učinku cistanche glikozida.
Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju katalizira tirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva sudjelovanje kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan čimbenik koji utječe na proizvodnju melanina.Cistanchesadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu, čime inhibira proizvodnju melanina.
Kliknite na Cistanche Tubulosa za poboljšanje izbjeljivanja kože
Zatraži više:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
U Dodatku,cistanchetakođer ima funkciju poticanja proizvodnje kolagena, što može povećati elastičnost i sjaj kože i pomoći u obnavljanju oštećenih stanica kože.
CistancheFeniletanol glikozidi imaju značajan učinak regulacije naniže na aktivnost tirozinaze, a pokazalo se da je učinak na tirozinazu kompetitivna i reverzibilna inhibicija, što može pružiti znanstvenu osnovu za razvoj i korištenje sastojaka za izbjeljivanje u Cistancheu.
Stoga,cistancheima ključnu ulogu uizbjeljivanje kože. Može inhibirati proizvodnju melanina kako bi se smanjila promjena boje i tupost; i potiče proizvodnju kolagena za poboljšanje elastičnosti i sjaja kože. Zbog raširenog prepoznavanja ovih učinaka cistanche, mnogi proizvodi za izbjeljivanje kože počeli su sadržavati biljne sastojke kao što je Cistanche kako bi zadovoljili potražnju potrošača, čime se povećala komercijalna vrijednost Cistanche u proizvodima za izbjeljivanje kože.
Ukratko, uloga cistanhe u izbjeljivanju kože je ključna. Njegov antioksidativni učinak i učinak stvaranja kolagena mogu smanjiti diskoloraciju i tupost, poboljšati elastičnost i sjaj kože i tako postićiučinak izbjeljivanja. Također, široka primjena Cistanche u proizvodima za izbjeljivanje kože pokazuje da se njegova uloga u komercijalnoj vrijednosti ne može podcijeniti.
Swertiajaponin inhibira UVB-induciranu MAPK aktivaciju
Pokazalo se da oksidativni stres stimulira melanogenezu regulacijom transkripcijskog faktora povezanog s mikroftalmijom (MITF), transkripcijskog faktora koji inducira ekspresiju gena tirozinaze [4, 14]. Proučavali smo može li antioksidativni učinak swertiajaponina regulirati aktivnost MITF-a. Podaci Western blottinga pokazali su da je izloženost UVB zrakama povećala fosforilirani MITF, aktivni oblik MITF-a, dok ga je tretman swertiajaponinom od 10 µM smanjio (Slika 6A). Dosljedno, povećanje razine proteina tirozinaze posredovano UVB-om smanjeno je liječenjem swertiajaponinom (Slika 6A). Budući da se pokazalo da oksidativni stres aktivira MITF preko mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK) [15, 16], ispitano je može li swertiajaponin kontrolirati MAPK signalizaciju. Izloženost UVB zrakama dramatično je povećala fosforilaciju ERK, JNK i p38 (Slika 6B), što je povezano s UVB-induciranom proizvodnjom ROS i ONOO u stanicama B16F10 (Slika 5C- 5D). Liječenje swertiajaponinom samo od 10 µM smanjilo je razine proteina MAPK (Slika 6B). Ovaj je rezultat u skladu s antioksidativnom aktivnošću swertiajaponina jer je smanjenje staničnog oksidativnog stresa izazvanog UVB zračenjem bilo jasno samo pri 10 μM swertiajaponina (Slika 5C-5D).
Iako je swertiajaponin glavni spoj cijele biljke Swertia japonica koja se koristi kao japanski lijek, naša studija nije pokazala uvjerljive dokaze o sigurnosti swertiajaponina za njegovu primjenu na ljudskoj koži. Međutim, swertiajaponin nije pokazao citotoksičnost u staničnim linijama Hs27 (ljudski fibroblast), HaCat (ljudski keratinocit) i B16F10 (mišji melanom) u našem eksperimentalnom okruženju. Štoviše, nije bilo vidljivih znakova citotoksičnosti, uključujući stvaranje staničnih ostataka ili odvajanje stanica temeljeno na mikroskopskom promatranju kada je swertiajaponin tretiran u modelu ljudske kože koncentracijama koje nisu pokazale citotoksičnost u staničnim linijama. S obzirom na to da su sigurnosni problemi glavna briga spojeva za izbjeljivanje kože koji su trenutno dostupni, potrebna su daljnja in vivo istraživanja kako bi se ispitala njihova fiziološka sigurnost.
Zajedno, swertiajaponin je inhibirao akumulaciju melanina do zadovoljavajuće granice iu modelima stanica i ljudske kože dvostrukim mehanizmima za suzbijanje tirozinaze izravnim vezanjem i kompetitivnom inhibicijom tirozinaze i suzbijanjem MAPK/MITF signalizacije posredovane oksidativnim stresom (Slika 7). Uzimajući u obzir štetne učinke i nedostatak dugotrajne učinkovitosti poznatih sredstava za izbjeljivanje kože kao što su kojična kiselina i arbutin [17], swertiajaponin bi se mogao sigurnije primijeniti za suzbijanje pigmentacije kože i bio bi novi dodatak kozmetičkim proizvodima za izbjeljivanje.
MATERIJALI I METODE
Određivanje aktivnosti tirozinaze korištenjem tirozinaze gljiva
Swertiajaponin i kojična kiselina (50 μM) stavljeni su u 96-mikroploču s jažicama (Nunc, Danska) u puferu tirozinaze (200 μL) koji sadrži tirozinazu gljiva (1000 U), 1 mM otopinu L-tirozina i 50 mM fosfata pufer (pH 6,5) [5]. Ploča je inkubirana na 37 stupnjeva 15 minuta i dopakinon je procijenjen spektrofotometrijom (450 nm). Na temelju mjerenja, IC50 je izračunat korištenjem log-linearnih krivulja i njihovih jednadžbi.
Docking simulacija swertiajaponina i tirozinaze
AutoDock Vina korišten je za in silico simulaciju spajanja protein-ligand. Trodimenzionalna struktura tirozinaze korištena je u kristalnoj strukturi Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X). Unaprijed definirano mjesto vezanja tirozina primijenjeno je kao džep za spajanje. Nakon što su provedene simulacije povezivanja između tirozinaze i swertiajaponina ili kojične kiseline, korišten je softver LigandScout 3.0 za predviđanje veznih ostataka između različitih spojeva i tirozinaze.
Kinetička analiza inhibicije tirozinaze swertiajaponinom
L-DOPA je pripremljena u koncentracijama od 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 i 0.0625 mM, i swertiajaponin je pripremljen na 20, 40 i 80 µM. Otopina reakcijske smjese pripremljena je u 96-ploči s jažicama, u koju je uneseno 20 μL supstrata tirozinaze (L-DOPA), 10 μL vodene otopine tirozinaze gljive (200 U) i 50 mM pufera kalijevog fosfata (pH 6.5) su dodani. Brzina proizvodnje dopakroma u reakcijskoj smjesi izmjerena je na valnoj duljini od 450 nm pomoću čitača mikroploča. Stopa inhibicije tirozinaze swertiajaponina je zatim izračunata korištenjem Lineweaver-Burk analize dijagrama. Michaelisova konstanta (Km) i maksimalna brzina (Vmax) također su izračunate Lineweaver-Burk dijagramima s različitim koncentracijama L-DOPA supstrata [3].
Kultura stanica i test vijabilnosti
Stanice melanoma B16F10 kupljene su od Korea Cell Line Bank. Stanice su uzgajane u Dulbecco modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) s 5 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1 posto penicilina, streptomicina, L-glutamina i natrijevog piruvata. Stanice su održavane na 37 stupnjeva u vlažnoj atmosferi 95 posto zraka/5 posto CO2. Za analizu stanične viabilnosti, stanice su nasađene u 96-pločice s jažicama. Stanice melanoma B16F10 tretirane su swertiajaponinom u različitim koncentracijama tijekom 48 sati. Ez-Cytox (10 μL) je dodan u svaku jažicu i inkubiran 2 sata. Nastali kristali formazana izmjereni su spektrofotometrijom na 450 nm. Viabilnost stanica izračunata je korištenjem stanica bez tretmana swertiajaponinom kao kontrolne skupine.
Sadržaj melanina u stanicama B16F10
Razina melanina mjerena je prethodno opisanom metodom uz male modifikacije [18]. Stanice B16F10 ostavljene su da rastu do 70-80 posto konfluencije u 6-pločama s jažicama. Stanice su prethodno tretirane swertiajaponinom ili kojičnom kiselinom tijekom 2 sata. Nakon toga, MSH ili UVB tretirani su medijem koji je sadržavao swertiajaponin ili kojičnu kiselinu i inkubirani daljnjih 48 h. Nakon ispiranja s PBS-om, stanice su odvojene pomoću tripsina i otopljene u 90 μL 1 N otopine NaOH koja je sadržavala DMSO (5 posto). Nakon inkubacije na 60 stupnjeva tijekom 1 sata, sadržaj melanina određen je mjerenjem apsorbancije na 405 nm. Komercijalno dostupna UV komora (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Koreja) korištena je za izlaganje UVB stanica B16F10.
Western blotting
Uzorci proteina izolirani iz B16F10 stanica (30 ug) odvojeni su elektroforezom na natrijevom dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu upotrebom 10-12 postotnih akrilamidnih gelova i prebačeni na membrane od poliviniliden fluorida, koje su zatim odmah stavljene u pufer za blokiranje ( 5 posto nemasnog mlijeka) u 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl i 0,1 posto Tween 20. Membrana je isprana u TBS-Tween puferu 30 minuta i zatim inkubirana sa specifičnim primarnim protutijelima (1:1{ {24}} razrjeđenje) naznačeno u legendi slika na 4 stupnja preko noći. Nakon ispiranja s TBS-Tween puferom, membrana je inkubirana s anti-mišjim antitijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (Santa Cruz, 1:10,000), anti-zečjim antitijelom (Santa Cruz, 1:10, 000), ili anti-kozje antitijelo (Santa Cruz, 1:10,000) na 25 stupnjeva tijekom 1 h. Imunoblotovi su vizualizirani korištenjem Western Bright Peroxide otopine (Advansta, CA, SAD) i ChemiDoc Touch sustava za oslikavanje (Bio-Rad, SAD) prema uputama proizvođača. Antitijela korištena u ovoj studiji su sljedeća: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tirozinaza (stanična signalizacija-104976), pMITF (Abcam{{40) }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (Stanična signalizacija-921L), p38 (Stanična signalizacija-9212S), pERK (Stanična signalizacija-4370L ), ERK (Stanična signalizacija-9201L), pJNK (Stanična signalizacija-9251L), JNK (Stanična signalizacija-9252S) i -aktin (Santa Cruz-47778) .
Mjerenje ROS i ONOO- razina
Antioksidativno djelovanje swertiajaponina ispitano je pomoću fluorescentnog 2,7-diklorodihidrofluorescein diacetata (DCFDA) za ROS i dihidro rodamina (DHR) 123 za ONOO-. Ukratko, za određivanje razine ROS-a, DCFDA (25 µM) dodan je staničnom homogenatu za konačni volumen od 250 ul. Za mjerenje razine ONOO-, 10 ul staničnih homogenata dodano je u otopinu rodamina (50 mM natrijevog fosfatnog pufera, 90 mM natrijevog klorida, 5 mM dietilentriaminpentaoctene kiseline [DTPA] i DHR123). Za oba testa, fluorescencija je mjerena svakih 5 minuta tijekom 30 minuta na čitaču fluorescentnih ploča, s valnim duljinama ekscitacije i emisije postavljenim na 485 odnosno 530 nm.
Nakupljanje melanina u modelu ljudske kože
Održiva, rekonstituirana, trodimenzionalna ljudska epiderma (Neoderm-ME, Tego Science) korištena je za ispitivanje antimelanogenog učinka swertiajaponina na modelu ljudske kože. Model ljudske kože prethodno je tretiran DMSO-om (nosač) ili swertiajaponinom tijekom 1 sata i uzgajan u mediju za održavanje koji je osigurala tvrtka tijekom 5 dana s tretmanom DMSO-om ili swertiajaponinom. Mikroskopska analiza obavljena je od 1. do 5. dana kako bi se promatrala pigmentacija kože. Mikroskopske slike analizirane su softverom Image J kako bi se polukvantificiralo tamnjenje kože. Za bojanje po Fontana-Massonu, uzorci kože su fiksirani u 4 posto paraformaldehida preko noći na sobnoj temperaturi, a uzorke je analizirala komercijalno dostupna tvrtka (Garam Meditech, Južna Koreja).
Statistička analiza
Svi podaci prikazani su kao srednja vrijednost ± SEM. Različite skupine uspoređene su jednosmjernom analizom varijance nakon koje je slijedio Dunnettov post-test. P < 0.05 smatra se statistički značajnim.
SUKOB INTERESA
Ne postoje sukobi interesa koje treba prijaviti.
FINANCIRANJE
Ovaj je rad podržao Grant K17281 s Korejskog instituta za istočnjačku medicinu, Ministarstvo obrazovanja, znanosti i tehnologije (MEST), Republika Koreja.
REFERENCE
1. Bradford PT. Rak kože u boji kože. Dermatol Nurs. 2009.; 21: 170-7, 206.
2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Kemijski i instrumentalni pristupi liječenju hiperpigmentacije. Pigment Cell Res. 2003.; 16: 101-10.
3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(Benzo[d]tiazol-2-ilamino)-5- (supstituirani benziliden) derivati tiazol-4(5H)-ona kao novi inhibitori tirozinaze. Biol Pharm Bull. 2015.; 38: 1227-33.
4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P, et al. (Z)-5-(2,4-dihidroksi benziliden) tiazolidin- 2,4-dion sprječava melanogenezu izazvanu UVB zračenjem i stvaranje bora suzbijanjem oksidativnog stresa u HRM-u{{7} } miševi bez dlake. Oxid Med Cell Longev. 2016.; 2016: 2761463.
5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR, et al. (2R/S,4R)-2-(2,4-dihidroksi fenil) tiazolidin- 4-karboksilna kiselina sprječava stvaranje bora izazvano UV zračenjem inhibiranjem upale posredovane NF-kappaB. J Dermatol Sci. 2015.; 79: 313-6.
6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonoli iz Heterothece uključuju: inhibitornu aktivnost tirozinaze i strukturne kriterije. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.
7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identifikacija ostataka aktivnog mjesta uključenih u vezanje kofaktora metala i prepoznavanje stereospecifičnog supstrata u tirozinazi sisavaca. Implikacije za katalitički ciklus. Biokemija. 2002; 41: 679-86.
8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoidi kao inhibitori tirozinaze gljiva: studija gašenja fluorescencije. J Agric Food Chem. 2006.; 54: 935-41.
9. Orhan IE, Khan MT. Derivati flavonoida kao snažni inhibitori tirozinaze - pregled nedavnih otkrića između 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014.; 14: 1486-93.
10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Studije o sastojcima Swertia japonica. II. Izolacija i struktura novog flavonoida, swertiajaponina. Chem Pharm Bull (Tokio). 1967.; 15: 1567-72.
11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Učinci ekstrakta Swertia japonica i njegovog glavnog spoja swertiamarina na pražnjenje želuca i gastrointestinalni motilitet u miševa. Fitoterapija. 2011.; 82: 827-33.
12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Inhibicijski učinak 2-metil-nafto[1,2,3-de]kinolin-8-ona na transport melanosoma i pigmentaciju kože. Sci Rep. 2016.; 6: 29189.
13. Cotelle N. Uloga flavonoida u oksidativnom stresu. Curr Top Med Chem. 2001.; 1: 569-90.
14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Mlado lišće trske (Phragmites communis) suzbija melanogenezu i oksidativni stres u stanicama melanoma B16F10. Biomed Pharmacother. 2017.; 93: 165-71.
15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signalni putovi u melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016.; 17.
16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihidromiricetin iz Ampelopsis grossedentata inhibira melanogenezu putem regulacije MAPK, PKA i PKC signalnih putova. Chem Biol Interact. 2016.; 258: 166-74.
17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Ekstrakt micelija Ganoderme formosanum kao vrlo snažan inhibitor tirozinaze. Sci Rep. 2016.; 6: 32854.
18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 stimulira ekspresiju gena tirozinaze i melanogenezu u diferenciranim melanocitima. Pigment Cell Res. 2001.; 14: 328-36.
