Suzbijanje oštećenja bubrega povezanog s upalom nakon transplantacije korištenjem novog PrC-210 hvatača slobodnih radikala u štakora
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2,Maya M. Coumbe Gitter3i William E. Fahl1,3,*
Sažetak:
Alograftbubregtransplantaciju, koja pokreće stanično i antitijelima posredovano odbacivanje domaćinabubreg, glavni je uzrok oštećenja bubrega tijekom transplantacije. Ovdje smo pitali hoće li PRC-210 suzbiti oštećenja koja se vide kod presađivanja alografta bubrega. Bubrezi smeđeg norveškog (BN) štakora perfundirani su in situ (UW otopina) sa ili bez dodatka 30 mM PrC-210 i zatim odmah transplantirani u Lewis (LEW) štakore. 20 sati kasnije analizirani su transplantirani BN bubrezi i plazma LEWrat.Bubreghistologija i razine bubrega/seruma nekoliko citokina povezanih s upalom, mjerene su da bi se procijenila patologija bubrega povezana s neusklađenošću i PrC-210zaštitna učinkovitost. Dvadeset sati nakon presađivanja alografta: (i) značajno histološko oštećenje bubrežnih tubula i infiltracija mononuklearnih upalnih stanica uočeni su u alograftu bubrega; (ii)bubregfunkcionalni pokazatelji (kreatinin i BUN) bili su značajno povišeni; (iii) primijećene su značajne promjene u ključnim citokinima, tj. TIMP-1, TNF-alfa i MIP-3A/CCL20, te u razinama kaspaze aktivirane bubrezima. U PRC-210-tretiranim bubrezima i štakorima primateljima, (i) histološko oštećenje bubrega (Banffova ocjena) i mononuklearna infiltracija smanjeni su na netretirane osnovne razine; (ii) kreatinin i BUN bili su značajno smanjeni; i (iii) promjene aktivirane kaspaze i citokina značajno su smanjene, neke u pozadini. Zaključno, rezultati sugeriraju da bi PrC-210 mogao pružiti široko primjenjivu zaštitu organa za mnoga stanja transplantacije alografta; mogao bi zaštititi presađene bubrege tijekom i nakon svih faza procesa transplantacije - od donacije organa, preko transporta, ponovne implantacije i postoperativne upale - kako bi se akutno i kronično odbacivanje svelo na minimum.
Kejwords: bubregalograft; odbacivanje bubrega; ishemija
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
maca ginseng cistanche
1. Uvod
Završni stadij zatajenja bubrega uzrokuje više od 1,2 milijuna smrti godišnje u svijetu [1].Bubregtransplantacija je poželjna terapija za bolesnike sa završnom fazom bubrežne bolesti. Više od 90 000 transplantacija bubrega obavi se svake godine u cijelom svijetu.
Proces transplantacije, sam po sebi, uzrokuje značajne ozljede stanica i organabubreg, što smanjuje dugoročno preživljavanje organa. Tri primarna oštećenja bubrega tijekom transplantacije alografta su (i) oštećenje uzrokovano reaktivnim kisikom i dušikom (ROS i RNS) tijekom hladne ishemije ('hladno skladištenje) [2], (ii) oštećenje izazvano ROS-om nakon implantacije ('re-perfuzijska ozljeda') [3], i (iii) upala nakon alografta-transplantacije, koja pokreće urođeni imunološki odgovor i odbacivanje posredovano antitijelima (ABMR) [4].
Neutrofili i makrofagi migriraju u oštećeni transplantat unutar 6 h od reperfuzije i stimuliraju sintezu kemokina u rezidentnim dendritskim stanicama koje zatim aktiviraju T limfocite i regrutiraju adaptivne imunološke stanice. Nakon što se te imunološke stanice infiltriraju u epitelne stanice proksimalnih tubula, proizvode mijeloperoksidazu u neutrofilima i nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidazu u makrofazima, a obje pridonose lokalnoj proizvodnji slobodnih radikala. Ovi upalni procesi dovode do aktivacije puta komplementa i daljnjeg preoblikovanja i lize stanica ububregalograft [5]. ABMR se može pojaviti kao rezultat bilo kojeg, ili oba, prethodno formiranog aloantitijela protiv presatka ili kroz de novo razvoj antitijela specifičnog za davatelja (dnDSA) [5-7]. Akutni (min/dani), prijelazni u kronični (dani/tjedni), upalni odgovor unutar alografta bubrega, uz kontinuiranu proizvodnju ROS-a i upalnih citokina, može uspostaviti ozbiljan, samoodržavajući odgovor koji uzrokujebubregzatajenje organa.
Za bolje razumijevanje staničnih i molekularnih putova uključenih u patogenezububregupale i odbacivanja alografta, razvili smo i karakterizirali model štakora koji replicira većinu kliničkih kriterija urođenog imunološkog odgovora, ABMR i gubitka organa bubrega [8]. Ovaj je model korišten za procjenu brojnih novih post-alografskih strategija transplantacije.
Dva trenutno priznata pristupa za smanjenje akutnog i dugotrajnog imunološkog odgovora protivbubregalotransplantat su: (i) povećati šanse za pronalaženje unakrsno podudarnog donora, i (ii) ukloniti već postojeća protutijela protivbubregalograft korištenjem protokola desenzibilizacije [9,10].
U radu opisanom u ovom rukopisu, pitali smo bi li treći pristup za suzbijanje akutne i dugotrajne ozbiljnosti upale bio koristan. Primjenili smo hvatač slobodnih radikala s trenutnim djelovanjem, PRC-210, oba u implantirani alograftbubregi štakoru primatelju, kako bi se utvrdilo može li se suzbiti ROS oštećenje povezano s upalom. Iako koncept suzbijanja ROSin-a povezanog s upalombubregtransplantacija nije novost, ovdje se koristi novi PRC-210 ROSscavenger s trenutnim djelovanjem. I trenutno i kronično uklanjanje i inaktivacija slobodnih radikala koji stvaraju upalu i generiraju se unutar novopresađenog alograftabubregwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95 posto oštećenja DNK u nezaštićenih kontrola [16]. U dvije prethodne studije transplantacije bubrega kod glodavaca [16,17], pokazalo se da PRC-210 suzbija oštećenje bubrega izazvano ROS-om izazvano tijekom (i) 30 h hladnog skladištenja [17] i (ii) reperfuzijske ozljede nakon implantacije [16 ] na pozadinske razine, čime se uklanjaju dva značajna izvora ozljede presađenih bubrega. Također se pokazalo da molekula PRC-210 suzbija ozljede izazvane slobodnim radikalima u nekoliko drugih postavki organa [15,18]. Stoga smo pretpostavili da bi PrC-210 također trebao biti u stanju zaštititi alograft od oksidativnog stresa koji nastaje OBA (i) staničnim i (ii) procesima odbacivanja posredovanim antitijelima koji proizvode slobodne radikale kao nusprodukt.
Kako bismo istražili ovu hipotezu, razvili smo novi model štakora koji je izbjegao indukciju velikih ishemijskih i reperfuzijskih događaja i primijenio PrC-210 i prije i poslije implantacije. Bubrezi smeđih štakora isprani su UW otopinom koja je sadržavala PrC-210 i odmah transplantirani u singenične primatelje Lewis štakora. Vrijeme hladne ishemije je gotovo eliminirano. Odmah nakon implantacije, te 8 sati nakon togabubregimplantata, štakori primatelji primali su sistemske injekcije PrC-210 u dozama koje bi omogućile kontinuirano hvatanje slobodnih radikala unutar transplantatabubreg. Transplantirani bubrezi i krvna plazma zatim su sakupljeni 20 sati nakon transplantacije kako bi se omogućilo mjerenje PrC-210-dodijeljene (i) supresije upalnih nusproizvoda i (ii)bubregzaštita.
maca ginseng cistanche
2. Materijali i metode
2.1. Životinje
Odrasli (200-250 g) mužjaci Lewis i BN štakora kupljeni su od Enviga (Indian-Napolis, IN, SAD) i smješteni u ustanovi za brigu o životinjama na Sveučilištu Wisconsin u Madisonu, WI, SAD. Svi postupci provedeni su u skladu s Pravilima o brizi i korištenju životinja na Sveučilištu Wisconsin. Održavanje zdravlja životinja, uključujući uginuće životinja, sobnu temperaturu, 12-satne cikluse svjetla/mraka i čišćenje kaveza, između ostalih sanitarnih dužnosti, svakodnevno je obavljalo osoblje za brigu o životinjama. Hrana i voda bili su dostupni ad libitum. Ovo istraživanje prospektivno je odobrio Medicinski fakultet i Odbor za institucionalnu skrb i korištenje životinja za javno zdravstvo na Sveučilištu Wisconsin (Protokol za životinje br. M005204). Sve skupine sadržavale su 4-6 životinja.
2.2. Materijali
Sinteza PrC-210 HCl aminotiola, pretkliničke molekule, opisana je zasebno [19,20]. PrC-210 HCl kristali (3-(metilamino)-2-(metil monometil)propan-1- tiol) pohranjuju se u atmosferi dušika na -20 ◦C, pa čak i uz rutinu odmrzavanja, upotrebe i ponovnog skladištenja, kristalni PrC-210 potpuno je stabilan dulje od 4 godine prema analizi masene spektrometrije. Ostali kemijski reagensi nabavljeni su od Sigma Aldrich (St. Louis, MO, SAD). UW Otopina za očuvanje organa kupljena je od Bridge to Life, Columbia, SC, SAD.
2.3. Kirurški i eksperimentalni postupak
Postupak transplantacije korišten u ovim pokusima prikazan je na slici 1. Kod štakora donora BN, nakon dvostrukog podvezivanja aorte, podvezivanja desne bubrežne arterije i vene i kirurškog presjeka lijeve bubrežne vene, lijevi štakorbubregje perfundiran in situ korištenjem 5 mL UW otopine sobne temperature (tijekom razdoblja od 15 s). Perfuzat je bio ili sama UW otopina (za skupine "0 h" i "20 h bez tretmana") ili UW otopina u koju je dodana kristalna PrC-210, kako bi se postiglo 30 mM [17], dodan je, odmah otopljen, a zatim je pH podešen na pH početne UW otopine od 7,4 dodavanjem 0,0619 µL 5N NaOH po µmolu PrC-210 HCL soli (FW: 220). Poluživot PrC-210 tiola (aktivnog oblika) je približno 3,5 h u fiziološkim pH otopinama kao što je UW otopina i ljudska krv [14]. Nakon in situ perfuzije, lijevi BNbubregje kirurški uklonjen i zatim zašiven tupom anastomozom krvnih žila i uretera u upražnjeno mjesto lijevog bubrega štakora primatelja LEW. Desni LEWbubregpodvezana je i uklonjena neposredno prije. Pet minuta nakon kirurškog zatvaranja LEW štakora, štakor je primio sustavnu dozu PrC{{0}} (121 ug PrC-210 HCl po gm tjelesne težine, što je jednako 0).24 X Maksimalna tolerirana doza) intraperitonealnom injekcijom. Kao što je shematski prikazano na slici 1, štakor je također primio intraperitonealne injekcije doza PrC-210 (0,24 MTD) plus 4 h i plus 8 h nakon transplantacije. Štakori su eutanazirani plus 20 sati nakon transplantacije, ibubregai uzorci plazme su prikupljeni za analizu. Bilo je najmanje pet štakora u svakoj tretiranoj skupini.
2.4. Mjerenja BUN i kreatinina u serumu
BUN i kreatinin izmjereni su u uzorcima seruma pomoću Catalyst One AnalyzerTechnology (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, SAD).
2.5. Imunoenzimski testovi
Analize su provedene kako je opisano u protokolima kompleta ELISA (štakor TIMP-1, kat. br. RTM- 100; štakor MIP3-A, kat. br. DY540; štakorski TNF-alfa, kat. br. RTA{ {5}}; R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD). Ukratko, razrjeđenja štakorske plazme dodana su prethodno obloženim pločama, inkubirana 2 h na 37 °C. Antitijela konjugirana s biotinom, specifična za analizirani protein, dodana su i inkubirana 1 h na 37 °C, isprana, konjugirana s avidinom Dodana je peroksidaza hrena, nakon čega je uslijedilo ispiranje i dodavanje TMB supstrata. Reakcija je inkubirana 10-30 minuta, zaustavljena sumpornom kiselinom i očitana na 450 nm.
2.6. Proteome Profiler Rat Cytokine Array
Ispitivanja su provedena uglavnom kao što je opisano u protokolu proizvoda. Ukratko, plazma je inkubirana s nitroceluloznim membranama prošaranim antitijelima za hvatanje i kontrolu. Nakon inkubacije, membrane su isprane i inkubirane sa streptavidinom HRP. U odstupanju od protokola, upotrijebili smo SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, SAD; kat. br. 34094) za kemiluminescentnu detekciju, budući da je davao jači signal. Mrlje su vizualizirane na FotoDyne gel doc sustavu.
2.7. Histologija
Fiksiran formalinom (10 posto formalina), umetnut parafinom,bubregaizrezani su na dijelove od 5 um. Stakalca su deparafinizirana, rehidrirana iz ksilena kroz niz stupnjeva etanola u vodu, a zatim tretirana kako je opisano u nastavku. Slajdovi su skenirani pomoću objektiva 20- u Aperio Digital Pathology Slide Scanner. Sve H&E slajdove pregledao je dr. Weixiong Zhong, MD, PhD, transplantacijski patolog, i ocijenio ih za PTC, glomerulitis (g), vaskulitis (v)/intimalni arteritis, intersticijsku upalu (I) i C4d bojenje, prema Banffu 2009. [21].
Zasebno, slajdovima je dodijeljen slijepi broj, a digitalne slike bubrežnih tubula koje se ne preklapaju snimljene su na sučelju između medule i korteksa sa svakog H/E slajda. Vodilo se računa da se ne uključe lumeni velikih krvnih žila i glomeruli. Automatska kvantifikacija crvenih i plavih piksela u svakom 10-bubregslika je izvedena korištenjem prilagođene makronaredbe napisane u softveru ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
pristupljeno 13. travnja 2021.). Crveni pikseli odražavali su proksimalnu tubularnu debljinu uključujući rub četke. Jezgre su kvantificirane u plavom kanalu. Omjer plavih jezgrinih piksela i crvenih tubula dao je rezultat upalne infiltracije za infiltraciju bijelih krvnih zrnaca u posttransplantacijibubrega. Rezultati su prosječni i iscrtani korištenjem Graphpad Prism.
2.8. Aktivirana aktivnost enzima kaspaze
Aktivirana aktivnost kaspaze 3 i 7bubreghomogenat supernat je određen korištenjem Apo-ONE fluorescentnog supstrata (Promega, Madison, WI, SAD) [16]. Nakratko, odmrznutobubregapomiješani su s 8-strukim viškom pufera za lizu koji je sadržavao 50 mM Na HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 posto glicerola i homogeniziran na 4 O C tijekom 30 s Omni homogenizatorom tkiva . Homogenat bubrega je centrifugiran na 4°C (16,000- g) u Eppendorf mikrocentrifugi 20 minuta. Supernati su odmah ispitani na aktivnost kaspaze i sadržaj proteina Bradfordovom metodom uz korištenje goveđeg serumskog albumina kao standarda. Test aktivirane kaspaze izveden je na sljedeći način: 5 uL supernata (~40 ug supernata proteina) razrijeđeno je do ukupnog volumena od 50 uL s gornjim puferom za lizu, pomiješano je s 50 uL nerazrijeđenog Apo-ONE supstrata u jažici crne, neprozirne ploče s 96 jažica za početak 60-minutne reakcije. Ploče su mućkane na 200 RPM na 37 °C 60 min. Cijepanje peptida supstrata DEVD kaspaze izmjereno je pomoću čitača fluorescentnih ploča BMG Clariostar pri valnoj duljini ekscitacije od 499 nm i valnoj duljini emisije od 521 nm. U svaki eksperiment uključen je standard kaspaze.
2.9. Mitohondriji bubrega štakora
Pročišćena mitohondrijska frakcija pripravljena je iz homogeniziranog štakorabubregastandardnom tehnikom centrifugiranja [22]. Pročišćeni mitohondriji su suspendirani u 0.15 M Tris HCl puferu, pH 7,4.
Kako bismo utvrdili da li dodavanje egzogenog PrC{{0}} potiskuje ROS-induciranu fragmentaciju mitohondrijske DNA [22], u reakcijski volumen od 25 uL (u PCR epruveti), dodali smo: 1{{29} } uL pročišćenih mitohondrija, 5 uL PrC-210 razrjeđenja ili vode (PrC-210 je dodan 10 minuta prije Fe plus plus plus ADP plus H2O2 ●OH generatora), i 10 uL koji sadrži FeCl2 (2,5 mM; FW: 127), adenozin 5'-difosfat natrijeva sol (10 mM; FW: 427) i H2O2 (0,003 posto konačne koncentracije). Nakon 20 minuta na 37 °C, 10 uL reakcije pomiješano je s 5 uL 6- boje za punjenje gela koja sadrži 0,3 posto SDS; epruvete su ostavljene u vodi na 60 °C 1 minutu, 10 ul je zatim stavljeno u jažicu 1 postotnog agaroznog TAE gela, a nakon 60 minuta na 60 volti, gelovi su obojeni i fotografirani. Učinjena su najmanje tri ponavljanja za svaku točku ispitivanja kako bi se omogućila statistička usporedba.
2.10. Statistička analiza
Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti plus /一 spolno prenosive bolesti. Studentovi t-testovi korišteni su za određivanje statističke razlike i p vrijednosti pomoću softvera GraphPad Prism 7.03. p-vrijednosti manje od 0,05 smatrane su značajnima.
3. Rezultati
3.1. PrC-210 Supresija patologije alografta bubrega
20 sati nakon transplantacije, histologija transplantiranog BNbubrega(Slika 2A–D) liječeni samo UW otopinom jasno su pokazali povećane Banffove rezultate za tubulitis i peritubularni kapilaritis (crvene i žute strelice); zbirni patološki rezultati prikazani su na ploči E. BNbubregaperfundiran PrC{{0}}koji sadrži UW otopinu i prima postimplantacijske intraperitonealne sistemske doze PrC-210 (Slika 2D) pokazao je jasno potisnutu upalnu patologiju bubrega i potisnute Banffove rezultate za tubulitis i peritubularni capillaritis jednak Banff rezultatima "0 h" kontrolne BN skupine (Slika 2E). Primjena PrC-210 dovela je do značajnog smanjenja kreatina (p=0.032) i BUN (p=0.046) markera oštećenja bubrega.
3.2. Aktivirane razine kaspaze u bubrezima nakon transplantacije
Razine aktivirane kaspaze u BNbubreghomogenati su značajno smanjeni u BN alograftububregakoji nisu bili izloženi tretmanu PrC{{0}} tijekom 20 sati nakon transplantacije (Slika 5). Perfuzija BN bubrega s PrC-210-koji sadrži UW otopinu i transplantacija u Lewis štakore koji su primili sistemske doze PrC-210 rezultirala je istom aktiviranom aktivnošću kaspaze kao ona viđena u kontrolnim bubrezima "0 h".
3.3. Razine upalnih citokina nakon alografta BN bubrega
U eksperimentima probira,bubreghomogenizirati supernate iz 0 h kontrola i 20 h bez tretmanabubregapregledani su nizom citokina Proteome Profiler 29 kako bi se otkrile promijenjene razine ekspresije citokina i kemokina povezane s upalom 20 sati nakon transplantacije. Kao što je prikazano na dva umetka mikroniza na slici 6, promjene su uočene u TIMP-1, TNF-alfa i MIP-3a/CCL20. Pojedinačne ELISA ploče su zatim korištene za kvantificiranje ovih promjena u bubrežnim homogenatima i serumima, sada uključujući i štakore tretirane s PrC-210. I razine TIMP-1 i TNF-alfa bile su povećane 20 sati nakon transplantacije, au oba slučaja, njihove su razine bile smanjene u prisutnosti PrC-210 (Slika 6A-C). Razine MIP-3a/CCL20 porasle su nakon 20 h, ali su porasle znatno više kod štakora tretiranih PrC-210- (Slika 6D).
3.4. PrC-210 Zaštita mitohondrija bubrega štakora
Održana funkcija mitohondrija tijekom i nakonbubregpresađivanje je potrebno za preživljavanje presađenog organa. ROS koji nastaje tijekom ishemije povezane s transplantacijom, ishemije-reperfuzije i postimplantacijske upale mogu utjecati na rad mitohondrija bubrega i preživljavanje. Zbog važne mitohondrijske uloge, izolirali smo mitohondrije iz bubrega štakora i odredili može li PrC-210 u dostižnim farmakološkim koncentracijama zaštititi te organele od ROS insulta.
Na slici 7, pročišćeni štakorbubregmitohondriji su inkubirani s ●OH generatorom [23]. Nakon kratke reakcije, vidjeli smo značajnu ROS fragmentaciju mitohondrijske DNA štakorskog bubrega. Nakon ROS insulta, alikvot mitohondrija je otopljen u puferu za punjenje gela koji je sadržavao SDS, a mitohondrijska DNA je odvojena i "određena veličina" pomoću kromatografije na agaroznom gelu (Slika 7). ROS insult jasno je smanjio srednju veličinu mitohondrijske DNK štakorskog bubrega (linija b), a dodavanje PrC-210 u mitohondrije spriječilo je lomljenje DNK (staze c–g) u PrC-210 način ovisan o koncentraciji.
maca ginseng cistanche
4. Rasprava
Alograftbubregtransplantacija, koja izaziva odbacivanje bubrega posredovano stanicama i antitijelima domaćina, uvelike pridonosi kratkoročnim i dugoročnimbubregoštećenje tijekom transplantacije, a povezana odgođena funkcija presatka vidljiva je u do 50 posto presađenih bubrega. Proveli smo ovu studiju kako bismo utvrdili hoće li PrC-210 biti učinkovit u suzbijanju ozbiljnosti oštećenja izazvanog transplantacijom alografta bubrega u modelu štakora koji u velikoj mjeri eliminira ishemijsko vrijeme transplantacije i s njim povezani oksidativni stres. Naša je pretpostavka bila da bi nam ovaj pristup trebao omogućiti da vidimo utjecaj PrC-210 na posttransplantacijski upalu uz minimalnu interferenciju ishemije.
Povećanje TNF-alfa i značajna mononuklearna infiltracija pokazuju da transplantacija alografta bubrega izaziva izraženu akutnu upalu u 20 sati nakon transplantacije, a to je bilo u korelaciji s oštećenjem tubularnih stanica bubrega viđenim ububreghistologija (Banff Scores). TNF-alfa uglavnom proizvode aktivirani makrofagi i stanični je signalni protein uključen u akutnu upalu. Usko je povezan s patogenezom akutnog i kroničnog odbacivanja alografta [24].
Za razliku od gore navedenih nalaza u neliječenoj BNbubrega, PrC-210 davan kao dio UW otopine i sistemski primijenjen u štakora nakon transplantacije smanjio je i razinu TNF-alfa i bubrežnu infiltraciju mononuklearnih stanica, što su oba znaka smanjene akutne upale. PrC-210 je smanjio oštećenje bubrega kao što se vidi u rezultatima histološke ozljede bubrega (Banff rezultati) na neliječene pozadinske razine i snizio je razine oba funkcionalna rezultata bubrežne patologije, kreatinina i BUN.
Upala neliječenih BN bubrega bila je povezana s povećanjem TIMP-1 i MIP-3A/CCL20. Usporedbe radi, vidjeli smo da je liječenje PrC-210 značajno smanjilo razinu TIMP-1 i značajno povećalo razinu MIP-3A/CCL20.
Tkivni inhibitor metaloproteinaze-1 (TIMP-1) važan je regulator sinteze i razgradnje izvanstaničnog matriksa (ECM). Prekomjerno nakupljanje ECM-a glavni je patološki mehanizam razvoja fibroze tijekom i nakon akutne ozljede bubrega. U biti nema izražaja TIMP-1 u normalibubregtkiva [25], zapažanje koje je potvrđeno na našoj slici 6A, B, ali poznato je da se TIMP-1 eksprimira u oštećenim bubrezima, uglavnom u epitelnim stanicama bubrežnih tubula, bazalnoj membrani bubrežnih tubula i citoplazmi intersticija Stanice. Povećana ekspresija TIMP-1 bila je u pozitivnoj korelaciji s istodobnim pogoršanjem bubrežne funkcije [26]. Štakori tretirani s PrC-210 pokazali su duboko smanjenje razina TIMP-1 (p=0.001), kako u homogenatu bubrega tako iu plazmi; to implicira da PrC-210 ima snažan zaštitni učinak protiv reorganizacije izvanstaničnog matriksa bubrega izazvane transplantacijom.
Kemokin MIP-3a/CCL20 aktivira receptor CCR6, koji se posebno izražava na regulatornim T-stanicama (Tregs). CCL20 eksprimiraju tubularne endotelne i intersticijske stanice, a također je pojačan u bubrezima s akutnom ozljedom bubrega. CCL20–CCR6 put igra vitalnu ulogu u regrutiranju T-stanica u bubregu posredovanom Tregom, a opisano je da Tregovi imaju pozitivnu ulogu ububregpopravak, tolerancija na transplantaciju i preživljavanje bubrega. Blokiranje puta CCL20–CCR6 protutijelima, kao i korištenje miševa s manjkom CCR6- u akutnojbubregeksperimenti s ozljedama, pokazali su da povećavaju težinu zatajenja bubrega i smrtnost [27]. Ovo sugerira da klinički, poboljšanje puta CCL20-CCR6 i aktivacija Treg-a mogu biti mogući terapijski put za ograničavanje akutnog i kroničnogbubregozljeda [28]. U našoj studiji (Slika 6D), razina MIP-3a/CCL20 bila je značajno viša u štakora koji su primali PrC-210- nego u štakora koji nisu bili tretirani. Nagađamo da je to jedan od razloga za (i) znatno manje regrutiranje mononuklearnih stanica u bubrege (Slika 3C) i (ii) značajno smanjeno oštećenje bubrega (Slika 2) u štakora liječenih PrC-210- .
Normalna mitohondrijska funkcija bubrega i, što je još važnije, oštećenje tijekom koraka pohrane bubrega, implantacije i upale nakon implantacije značajne su determinante oštećenja ROS-a i zatajenja bubrega tijekom transplantacije. Stoga je bilo značajno da se pokazalo da PrC-210 daje potpunu supresiju fragmentacije mitohondrijske DNA (Slika 7) pri koncentracijama (2-4 mM) koje su postignute u plazmi miševa i štakora koji su davani ili intraperitonealno ili oralne sistemske 0.5 MTD doze PrC-210 koje su se tolerirale bez mjerljive toksičnosti [29].
U našim ranijim studijama vezanim uz transplantaciju bubrega [16,17], vidjeli smo značajna povećanja aktivirane kaspaze u bubrezima koji su bili izloženi "hladnoj ishemiji" i "ishemično-reperfuzijskoj" ozljedi. Ovi inzulti bubrega izazvani ishemijom smanjeni su u pozadini tretmanom s PrC-210 (Slika 8). U studijama ovog rukopisa (Slika 5), u kojima su hladna ishemija i ishemija-reperfuzija u biti eliminirane trenutnom transplantacijom, nije bilo povećanja aktivirane kaspaze u presađenim bubrezima. Umjesto toga, aktivirana kaspaza bila je značajno smanjena na plus 20 h u kontrolama "bez liječenja lijekovima", a tretman PrC-210 potpuno je eliminirao ovo smanjenje kaspaze u plus 20 h štakora i održao razinu kaspaze stabilnom. Naše tumačenje ovih zanimljivih rezultata je da nema značajnijeg utjecaja slobodnih radikala izazvanih ishemijom kroz ROS i RNS na posttransplantacijububrega, nema povezane stanične smrti i markera apoptoze poput aktiviranih kaspaza. Umjesto toga, u ovim presađenim bubrezima alografta, upalni signali iz novoizraženih cito- i kemokina sada reguliraju metabolizam stanica, što uključuje utjecaj na put apoptoze. Literatura opisuje da prekomjerna ekspresija TIMP-1 dovodi do supresije apoptoze [26]. Naši rezultati kaspaze (Slika 5) podupiru ovaj opisani učinak TIMP-1 i impliciraju da je TIMP-1 važan u regulaciji patofiziologije oštećenja stanica nakon transplantacije alografta bubrega. Kao potvrda ranije PrC-210 supresije ekspresije TIMP-1 (Slika 6A, B), PrC-210 tretman potpuno je uklonio promjenu kaspaze, održavajući razine kaspaze na istoj razini viđenoj u kontrolni bubrezi "0 h". Budući da smanjene razine PrC-210 serumskog TIMP-1 na plus 20 h (Slika 6B) točno odražavaju značajnu supresiju alografta: (i) apoptoza (Slika 5), (ii) histološka patologija (Slike 2 i 3) i (iii) infiltracija upalnih stanica (Slika 3), očekujemo da će praćenje serumskih razina TIMP-1 u primatelja alografta ljudskog bubrega biti logičan način za praćenje kliničke učinkovitosti PrC-210 u budućim kliničkim ispitivanjima .
U našem dosadašnjem radu [16,17], pokazali smo da PrC-210 može zaštititi presađene bubrege i od hladnoće ishemije i od ishemije-reperfuzije. U ovoj studiji sada vidimo da PrC-210 također štiti alograftske bubrege od neishemičnih upalnih inzulta koji se javljaju nakon implantacije bubrega. PrC-210 značajno smanjuje razine akutnih upalnih citokina, kao što je TNF-alfa, i potiskuje ekspresiju TIMP-1 kemokina. Za oba ova događaja, i potencijalno, uz dodatnu ekspresiju CCL20, očekivalo bi se da će: (i) smanjiti oštećenje alografta bubrega, (ii) potisnuti novačenje T-stanica u bubregu, i (iii) potisnuti aktivaciju urođenih i adaptivni imunološki sustav. Na slici 8 sažimamo ove nalaze kako bismo poduprli ulogu koju smatramo da PrC- 210 može imati u transplantaciji bubrega kod ljudi; suzbija: (i) oštećenje pozadine izazvano hladnom ishemijom reaktivnim kisikovim vrstama (ROS) i reaktivnim dušikovim vrstama (RNS) [17],
(ii) ishemijsko-reperfuzijsko oštećenje ROS-a u pozadini [16], i (iii) oštećenje upalom alografta znatno, u nekim slučajevima, u pozadini. Budući da je primarni mehanizam djelovanja PrC-210 za PrC-210 uklanjanje slobodnih radikala kisika i dušika, to implicira da ti slobodni radikali značajno doprinose oštećenju bubrega koje se vidi u neishemijskim stanjima, tj. upala povezana s transplantatom proučavana u ovom rukopisu.
Ukratko, ovo sugerira da bi PrC-210 mogao pružiti široko primjenjivu zaštitu organa za mnoga stanja transplantacije alografta; mogao bi zaštititi presađene bubrege tijekom i nakon svih faza procesa transplantacije - od donacije organa, preko transporta, ponovne implantacije i postoperativne upale - kako bi se akutno i kronično odbacivanje svelo na minimum.
Cistanche tubulosa sprječava bolesti bubrega, kliknite ovdje za uzorak
Doprinosi autora:U izvođenju istraživanja i analizi podataka sudjelovali su NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV i MMCG; TRG i NAW sudjelovali su u dizajnu istraživanja i analizi podataka; WEF i TRG su sudjelovali u dizajnu istraživanja, izvedbi istraživanja, analizi podataka i pisanju rada. Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.
Financiranje:Ovo istraživanje financirao je Institut za klinička i translacijska istraživanja UW i dodijelio UL1TR002373 UW ICTR-u od NIH/NCATS, Američkog društva transplantacijskih kirurga (133 AAA1552), Američkog koledža kirurga (133 AAB2176) i dodijelio potporu WEF-u (# R03CA176799).
Izjava Institucionalnog odbora za reviziju: Ovo istraživanje je prospektivno odobrio Odbor za institucionalnu skrb i korištenje životinja Medicinskog fakulteta i javnog zdravstva na Sveučilištu Wisconsin (Protokol za životinje br. M005204).
Izjava o dostupnosti podataka:Podaci studije u potpunosti su dostupni u ovom rukopisu. Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Reference
1. Wang, H.; Naghavi, M.; Allen, C.; Barber, RM; Bhutta, ZA; Casey, DC; Charlson, FJ; Chen, AZ; Coates, MM; Coggeshall, M.; et al. Globalni, regionalni i nacionalni očekivani životni vijek, mortalitet iz svih uzroka i mortalitet specifičan za 249 uzroka smrti, 1980. – 2015.: sustavna analiza za studiju Globalnog tereta bolesti 2015. Lancet 2016., 388, 1459–1544. [CrossRef]
2. Treat, E.; Chow, E.; Peipert, JD; Waterman, A.; Kwan, L.; Massie, AB; Thomas, AG; Bowring, MG; Leeser, D.; Flechner, S.; et al. Isporuka bubrega živih davatelja i ishodi primatelja transplantata. arapski. Arheol. Epigr. 2017, 18, 632–641. [CrossRef] [PubMed]
3. Težina, SC; Bell, PR; Nicholson, ML Bubrežna ishemija-reperfuzijska ozljeda. Br. J. Surg. 1996., 83, 162–170. [PubMed]
4. Sellarés, J.; De Freitas, DG; Mengel, M.; Reeve, J.; Reinecke, G.; Sis, B.; Hidalgo, LG; Famulski, K.; Matas, A.; Halloran, PF Razumijevanje uzroka neuspjeha presađenog bubrega: dominantna uloga odbacivanja i nepridržavanja posredovanih protutijelima. Am. J. Transplant. 2012, 12, 388–399. [CrossRef]
5. Siedlecki, A.; Irish, W.; Brennan, DC Odgođena funkcija presatka kod transplantacije bubrega. arapski. Arheol. Epigr. 2011, 11, 2279–2296. [CrossRef]
6. Hidalgo, LG; Campbell, PM; Sis, B.; Meinecke, G.; Mengel, M.; Chang, J.; Sellars, J.; Reeve, J.; Halloran, PF; Hidalgo, LG; et al. De NovoDonor-specifična protutijela u vrijeme transplantacije bubrega Biopsija povezana s mikrovaskularnom patologijom i kasnim otkazivanjem presatka. arapski. Arheol. Epigr. 2009, 9, 2532–2541. [CrossRef]
7. Loupy, A.; Hill, GS; Jordan, SC Utjecaj donor-specifičnih anti-HLA protutijela na kasno zatajenje alografta bubrega. Nat. vlč. Nefrol. 2012, 8, 348–357. [CrossRef]
8. Huang, G.; Wilson, NA; Reese, SR; Jacobson, LM; Zhong, W.; Djamali, A. Karakterizacija transfuzijom izazvanog akutnog odbacivanja posredovanog protutijelima u štakorskom modelu transplantacije bubrega. arapski. Arheol. Epigr. 2014, 14, 1061–1072. [CrossRef] [PubMed]
9. Jordan, SC; Pescovitz, MD Presenzibilizacija: problem i njegovo upravljanje. Clin. J. Am. Soc. Nefrol. 2006, 1, 421–432. [CrossRef] [PubMed]
10. Stegall, M.; Gloor, J.; Winters, J.; Moore, S.; DeGoey, S. Usporedba plazmafereze u odnosu na desenzibilizaciju visokim dozama IVIG-a u primatelja bubrežnog alotransplantata s visokim razinama specifičnih aloantitijela davatelja. arapski. Arheol. Epigr. 2006, 6, 346–351. [CrossRef] [PubMed]
11. Peebles, DD; Soref, CM; Fahl, WE ROS-čistač i radioprotektivna učinkovitost novog PrC-210 aminotiola. Zračiti. Res. 2012., 178, 57–68. [CrossRef]
12. Soref, CM; Hacker, TA; Fahl, MI Novi oralno aktivan aminotiolni radioprotektor bez nuspojava mučnine i hipotenzije u svojim najvećim radioprotektivnim dozama. Int. J. Radiat. Oncol. 2012, 82, e701-e707. [CrossRef]
13. Techapiesancharoenkij, N.; Fiala, JL; Navasumrit, P.; Croy, RG; Wogan, GN; Groopman, JD Sulforafan, kemopreventivno sredstvo protiv raka, inducira puteve povezane s biosintezom membrane kao odgovor na oštećenje tkiva aflatoksinom B1. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2015, 282, 52–60. [CrossRef] [PubMed]
14. Jermušek, F.; Benedict, C.; Dreischmeier, E.; Brand, M.; Under, M.; Jeffery, JJ; Ranallo, FN; Fahl, WE Značajno suzbijanje oštećenja DNK izazvanog CT zračenjem u normalnim ljudskim stanicama radioprotektorom PrC-210. Zračiti. Res. 2018, 190, 133–141. [CrossRef] [PubMed]
15. Haker, TA; Diarra, G.; Fahl, BL; Natrag, S.; Kaufmann, E.; Fahl, WE Značajno smanjenje stanične smrti ishemije i reperfuzije kod infarkta miokarda kod miševa upotrebom PrC-210 ROS-hvatača s trenutnim djelovanjem. Pharmacol. Res. Perspektiva. 2019, 7, e00500. [CrossRef]
16. Bath, NM; Fahl, WE; Redfield, RR Značajno smanjenje smrti stanica mišje ishemije-reperfuzije bubrežne ishemije korištenjem trenutnog djelovanja PrC-210 reaktivnog hvatača kisikovih vrsta. Presaditi. Direktno. 2019, 5, e549–e555. [CrossRef] [PubMed]
18. Verhoven, BM; Karim, AS; Bath, NM; Fahl, CJS; Wilson, NA; Redfield, RR; Fahl, WE Značajno poboljšanje hladnog skladištenja bubrega štakora korištenjem UW otopine za očuvanje organa dopunjene PrC-210 hvatačem slobodnih radikala s trenutnim djelovanjem. Presaditi. Direct 2020, 6, e578. [CrossRef]
18. Giese, APJ; Guarnaschelli, JG; Ward, JA; Choo, DI; Riazuddin, S.; Ahmed, ZM Radioprotektivni učinak aminotiola PrC-210 na ozračeno unutarnje uho zamorca. PLoS ONE 2015, 10, e0143606. [CrossRef]
19. Copp, RR; Peebles, DD; Fahl, WE Sinteza i aktivnost regulacije rasta prototipa člana nove obitelji aminotiolnih radioprotektora. Bioorganic Med. Chem. Lett. 2011, 21, 7426-7430. [CrossRef]
20. Fahl, WE; Peebles, D.; Copp, RR Amino tiolni spojevi i pripravci za upotrebu u kombinaciji s terapijom raka. US patent 7,314,959, 12. travnja 2004.