Sažetak

Pozadina: Bubreg je vrlo složen organ s više funkcija koje su ključne za zdravlje. Bolest bubrega nastaje kada su bubrezi oštećeni i ne rade ispravno. Analiza jedne stanice moćna je tehnika koja pruža uvid bez presedana u normalne i abnormalne tipove bubrežnih stanica i promijenit će naše razumijevanje mehanizama uobičajenih bolesti bubrega.

Sažetak: Naše razumijevanje patogeneze bolesti bubrega ograničeno je nepotpunom molekularnom karakterizacijom tipova stanica odgovornih za funkciju bubrega. Primjena jednostanične tehnologije u istraživanju bubrega otkrila je staničnu heterogenost, profile ekspresije gena i molekularnu dinamiku u razvoju i napredovanju bubrežne bolesti. Jednostanična analiza bubrežnih organoida i tkiva alografta pružila je nove uvide u bubrežnu organogenezu, mehanizme bolesti i terapijske ishode. Sveukupno, bolje razumijevanje heterogenosti bubrežnih stanica i molekularne dinamike bubrežne bolesti poboljšat će dijagnostičku točnost i pomoći u identificiranju novih terapijskih strategija u nefrologiji.

Ključna poruka: U ovom preglednom članku sažimamo nedavna jednostanična istraživanja bolesti bubrega i raspravljamo o utjecaju jednostanične tehnologije na osnovna i klinička istraživanja bubrega.

Ključne riječi

Jednoćelijska tehnologija; Bolest bubrega; Imunološka stanica; Organoid bubrega; Alograft;Cistanche koristi.

Uvod

Bubrezi su dva organa u obliku graha odgovorna za filtriranje otpada, viška vode i drugih nečistoća u krvi te za proizvodnju urina. Bubrezi također reguliraju pH, razine soli i kalija te krvni tlak; kontrolirati proizvodnju crvenih krvnih stanica; i aktivirati oblik vitamina D koji pomaže tijelu apsorbirati kalcij. do danas, procjenjuje se da 850 milijuna ljudi diljem svijeta pati od bolesti bubrega, uključujući kroničnu bubrežnu bolest (CKD), akutnu ozljedu bubrega, zatajenje bubrega i mnoga druga stanja. Bolest bubrega nastaje kada su bubrezi oštećeni i ne mogu obavljati svoje funkcije. Oštećenje može biti uzrokovano dijabetesom, visokim krvnim tlakom i nizom drugih kroničnih (dugotrajnih) stanja. Bolest bubrega može dovesti do drugih zdravstvenih problema, uključujući osteoporozu, oštećenje živaca, pothranjenost i bolesti srca. Trenutne strategije liječenja za pacijente ostaju transplantacija bubrega ili dijaliza, koji su skupi.

Razne stanice u bubregu, uključujući epitelne, tilakoidne, endotelne i neuronske stanice, kao i mreže imunoloških stanica, međusobno djeluju kako bi održale normalnu funkciju bubrega. Dublje razumijevanje heterogenosti zdravih bubrega i procesa koji leže u pozadini bubrežne bolesti poboljšat će molekularnu i histopatološku fenotipsku definiciju bubrega i podržati razvoj novih klasifikacija bolesti. Jednostanična tehnologija potencijalno je korisna u identificiranju staničnih podtipova, stanja i promjena učestalosti tijekom pojave i progresije bubrežne bolesti. Posljednjih godina, s brzim razvojem visokoučinkovite tehnologije sekvenciranja jednostanične RNA (scRNA-seq), konstruiran je sveobuhvatan stanični atlas normalnog bubrega za istraživanje bubrežne precizne medicine. Projekt precizne medicine bubrega (KPMP) razvijen je globalno za dobivanje biopsija ljudskih bubrega, stvaranje atlasa bubrežnog tkiva, definiranje subpopulacija bolesti i konačno identificiranje ključnih stanica, putova i ciljeva za nove terapije. Nadovezujući se na jednostanični transkripcijski skup podataka povezanih s bubrezima, istraživači su također analizirali profile ekspresije gena ACE2, TMPRSS2 i SLC6A19 u podtipovima bubrežnih stanica, što je ključno za razumijevanje patogeneze teškog akutnog respiratornog sindroma coronavirus 2. U ovom pregledu, usredotočit ćemo se na (1) razvoj i primjenu jednostanične tehnologije, (2) korištenje scRNA-seq za proučavanje razvoja i progresije bubrežnih bolesti, (3) molekularno mapiranje imunoloških stanica u bubrežnim bolestima, ( 4) primjena scRNA-seq na organe slične bubrezima i (5) uporaba scRNA-seq za dubinsko proučavanje bubrežnih alografta (Slika 1).

Kliknite ovdje za preuzimanjeučinci Cistanche na bubrege

Razvoj i primjena jednostanične transkriptomske tehnologije

Jedna stanica je osnovna jedinica života. Tehnike analize jedne stanice revolucionirale su našu sposobnost identificiranja sastava stanice, praćenja molekularne dinamike i otkrivanja patoloških mehanizama. Rana globalna jednostanična analiza ekspresije gena provedena je korištenjem mikronizova i qPCR tehnika. Tietjen i sur. koristili su jednostanične mikronizove za praćenje profila molekularne ekspresije pojedinačnih neurona i progenitorskih stanica i za definiranje signalnih putova u različitim razvojnim fazama. Osim toga, analiza ekspresije jedne stanice identificirala je nekoliko podtipova stanica u razvoju koji imaju nove gene gušterače, pružajući nove uvide u razvoj gušterače. Ova klasa razvila je jednostanične qPCR tehnike i primijenila ih na proučavanje ključnih regulatornih gena u razvoju mišjih blastocista i diferencijaciji hematopoetskih linija.

S pojavom tehnologije sekvenciranja sljedeće generacije, scRNA-seq je pokazao jasne prednosti u razlikovanju različitih izoformi, ekspresije alela i novih transkripata u pojedinačnim stanicama po nižoj cijeni. 2009. godine, Tang i sur. izvijestio je o prvom jednostaničnom sekvenciranju cijelog transkriptoma mRNA, pokazujući složenost transkripcijskih varijanti u pojedinačnim mišjim oocitima ili oocitima. smart-seq was 2012 razvijen je za otkrivanje transkripata pune duljine u pojedinačnim stanicama, a primjenom na rijetke stanice, istraživači su identificirali kandidate za biomarkere za cirkulirajuće tumorske stanice melanoma. Godinu dana kasnije, predstavljen je Smart-seq2 s poboljšanom obrnutom transkripcijom, pokrivenošću čitanja, pristranošću i preciznošću. nedavni razvoj u Smart-seq3 uvelike je poboljšao njegovu osjetljivost u otkrivanju tisuća jednostaničnih transkripata pri rezoluciji alela i izoforme. Za razliku od metoda pojačanja temeljenih na PCR-u, CEL-seq hvata učinkovite jednostanične transkriptome multipleksnim linearnim pojačanjem. Studija koja je koristila CEL-seq za proučavanje ranog embrionalnog razvoja Cryptobacterium hidradenoma otkrila je svoje ponovljive i osjetljive rezultate pri rezoluciji jedne stanice. Prva automatizirana platforma scRNA-seq je Fluidigm C1, koja koristi mikrofluidni sustav za hvatanje pojedinačnih stanica u 96 ili 384 komore, nakon čega slijedi stanična liza, reverzna transkripcija i PCR amplifikacija.

Od 2015. jednoćelijsko istraživanje u potpunosti je ušlo u eru visoke propusnosti, niske cijene i automatizacije uz kontinuiranu dostupnost Drop-seq, inDrop, 10× Genomics, Seq-well, Microwell-seq i SPLiTseq. Drop-seq i inDrop razdvajaju pojedinačne stanice u kapljice veličine nanolitra i miješaju ih s jedinstvenim crtičnim kodom za označavanje svake ćelije. S druge strane, Cyto-seq, Seq-well i Microwell-seq omogućuju visokopropusno sekvenciranje jednostanične mRNA hvatanjem stanice i zrnca crtičnog koda u mikrojažici. Naša je grupa konstruirala prvi atlas mišjih stanica i krajolik ljudskih stanica na razini jedne stanice koristeći Microwell-seq. U novije vrijeme, veća propusnost i jednostavnije metode nazivaju se SPLiT-seq i sci-RNA-seq za scRNA-seq. Ove metode koriste samu stanicu ili jezgru kao reakcijsku komoru za stanice označene crtičnim kodom kroz nekoliko krugova dijeljenja skupa. Sve su stanice zatim podvrgnute cDNA PCR amplifikaciji i sekvencioniranju. Cao i sur. koristio je sci-RNA-seq3 za analizu transkriptoma približno 2 milijuna mišjih organogenih stanica i 4 milijuna ljudskih fetalnih stanica, pružajući globalni pogled na razvojne procese sisavaca. Druge jednostanične tehnologije koje pokrivaju genomske, proteomske i epigenomske analize također su procvjetale; međutim, oni su izvan dosega ovog rada.

Pojava i progresija bubrežne bolesti

Bubreg mogu zahvatiti mnoge uobičajene i ozbiljne bolesti, uključujući akutnu ozljedu bubrega, glomerulonefritis, uzlazne infekcije (pijelonefritis) i rak. Općenito, naše razumijevanje patogeneze bolesti bubrega ograničeno je nepotpunom molekularnom karakterizacijom tipova stanica odgovornih za funkcije specifične za organe. Kako bi zatvorili ovaj jaz u znanju, naša grupa i Park et al. konstruirali su transkripcijski atlas zdravog mišjeg bubrega koristeći scRNA-seq. Glavni podtipovi epitelnih stanica bubrežne jedinice uključivali su stanice peteljke, proksimalne tubularne epitelne stanice, Henleov prsten, distalne tubule i stanice sabirnih kanalića. Studija je identificirala novi migratorni tip stanica za prikupljanje populacija duktalnih stanica, potvrđujući prethodna otkrića interkonverzije između interkaliranih stanica i glavnih stanica u studijama scRNA-seq. Osim toga, Ransick et al. analizirali bubrege odraslih mužjaka i ženki i izradili anatomski atlas elemenata mišjeg bubrega na razini jedne stanice. Naša je grupa također izvršila Microwell-seq analizu ljudskog fetalnog i odraslog bubrežnog tkiva. Uz epitelne stanice, endotelne stanice, stromalne stanice i imunološke stanice unutar tkiva, identificirali smo ranije neopisane tipove somatskih stanica s-tipa u fetalnom bubregu i novi tip migratorne stanice u bubregu odrasle osobe. Jednostanično molekularno profiliranje bubrežnog vaskularnog sustava otkrilo je specijalizirane profile ekspresije građevnih nefrona i otkrilo patogenezu bubrežne bolesti. Nadalje, sve vrste glomerularnih stanica identificirane su iz zdravih miševa i različitih modela bolesti analizom grupiranja jednostaničnih transkriptoma, a novi geni i regulacijski putovi povezani s bolešću otkriveni su u modelima bolesti, kao što je put nilskog konja aktiviran u podocitima nakon nefrotoksičnog imunološkog ozljeda.

Bubrežna fibroza je obilježje KBB-a i pogađa više od 10 posto svjetske populacije. U modelu heterogene koegzistencije bubrežne fibroze, Kramann et al. koristili su scRNA-seq kako bi potvrdili da monociti doprinose malom udjelu miofibroblasta, ali da većina miofibroblasta potječe iz mezenhimalnih stanica. Nakon toga, Kuppe et al. [37] analizirali su transkriptom približno 135 000 stanica iz proksimalnih i neproksimalnih tubula i dodatno potvrdili da različiti izoformi MSC-a najviše doprinose fibrozi bubrega kod ljudi. Nadalje, u komparativnoj analizi zdravih i fibrotičnih bubrežnih monocita, gen specifičan za miofibroblast, goli homolog keratinocita 2 (NKD2), identificiran je kao potencijalna terapijska meta za humanu bubrežnu fibrozu. Na temelju 402 biopsije bubrega, fibrinogen u mokraći je predviđen kao neinvazivni biomarker u bolesnika s kroničnom bubrežnom bolesti.

Standardizirani Cistanche

Dijabetičku nefropatiju (DN) karakterizira istovremeno oštećenje glomerula i tubularnog intersticija. Međutim, relativno se malo zna o tome kako se stanični status i učestalost mijenjaju s pojavom bolesti i napredovanjem ekspresije gena. Kako bi razjasnili promjene u ekspresiji gena glomerularnih stanica u DN miša, Fu et al. proveo scRNA-seq analizu i identificirao nekoliko novih potencijalnih markera glomerularnih stanica, uključujući Magi2, Robo2, Ramp3 i Fabp4. U dijabetičkoj nefropatiji (DKD), regulacija angiogenih i migracijskih putova je promijenjena u endotelnim stanicama, dok su translacijski i proteinski stabilni regulacijski putovi visoko obogaćeni u tilakoidnim stanicama. Sve u svemu, promjene u molekularnoj dinamici endotelnih i tilakoidnih stanica pomoći će u identificiranju važnih patofizioloških čimbenika koji pridonose progresiji DN. Chung i sur. prikazao je jednostanični transkriptom glomerula u mišjem modelu dijabetes melitusa. Ekspresija gena bila je promijenjena u tilakoidu i podocitima ob/ob miševa u usporedbi s kontrolama. Proliferativni putovi inducirani su u tilakoidnim stanicama, a putovi povezani sa staničnim odumiranjem inducirani su u podocitima, u skladu s promjenama u omjerima broja stanica. Opsežna analiza objavljenih skupova podataka scRNA-seq za DKD identificirala je 17 ključnih gena, obogaćujući naše razumijevanje molekularnih mehanizama koji leže u osnovi patogeneze DKD-a. Uz to, nepristrano jednojezgreno sekvenciranje RNA (snRNA-seq) kriokonzerviranih uzoraka bubrega dijabetičara dalo je 23 980 transkriptoma iz tri kontrolna i tri rana DN uzorka. Rezultati su pokazali promjene specifične za stanični tip u ekspresiji gena što ukazuje na povećano izlučivanje kalija u ljudskom DN. Prethodna studija koja je uspoređivala scRNA-seq i snRNA-seq u bubrezima odraslih miševa pokazala je da potonji imaju učinkovitiju sposobnost hvatanja. Na primjer, glomerularne podocite, tilakoidne stanice i endotelne stanice uhvatio je snRNA-seq umjesto scRNA-seq. Primjena snRNA-seq minimizira pseudo-učinke enzimske probave i može se provoditi na zamrznutim uzorcima, što će dovesti do šire primjene za ubrzanje proučavanja patoloških mehanizama kod različitih bubrežnih bolesti.

Precizan stanični transkriptom može otkriti podrijetlo tumorskih stanica bubrega i transkripcijske putanje koje podržavaju malignu transformaciju. mladi i sur. definirao normalne i kancerozne tipove ljudskih bubrežnih stanica iz kataloga od 72 501 jednostaničnih transkriptoma. Identificirajući specifične normalne stanične korelate stanica raka bubrega (RCC), studija je pružila dokaze za hipotezu da su Wilmsove tumorske stanice aberantne fetalne stanice i da RCC mogu potjecati od malo poznatog podtipa proksimalnih tubularnih stanica. Stoga scRNA-seq pruža skalabilnu eksperimentalnu strategiju za karakterizaciju ljudskih stanica raka bubrega s preciznom kvantitativnom staničnom molekularnom rezolucijom.

Molekularni atlas imunoloških stanica kod bolesti bubrega

Imunološke stanice temeljna su komponenta ljudskih tkiva i igraju važnu ulogu u fiziološkom i patološkom metabolizmu. Doista, sposobnost imunološkog sustava da prepozna patogene ili signale opasnosti ili maligne stanice je ključna. Primjena jednostanične tehnologije u proučavanju bubrežnih imunoloških stanica ima potencijal omogućiti bolje razumijevanje uloge imunološkog sustava u patogenezi zdravih bubrega i bolesti, kao i identificirati nove terapijske strategije. Ovi napori počinju mapirati složeni imunološki krajolik unutar bubrega i otkrivaju odnos između imunoloških stanica koje žive u tkivima i njihovih međusobno aktiviranih susjeda.

U 2018. primjena scRNA-seq u bubrežnom tkivu miša pružila je sveobuhvatan pejzaž imunoloških stanica uključujući rezidentne makrofage, neutrofile, B i T limfocite i NK stanice. Godinu dana kasnije, uspostavljena je jednostanična studija bez presedana prostorno-vremenske organizacije imunoloških stanica ljudskih bubrega. Mreže mijeloidnih i limfoidnih imunoloških stanica koje se nalaze u tkivima identificirane su u fetalnim i odraslim bubrezima, a studije su identificirale postnatalno stečene transkripcijske programe koji potiču obranu od infekcije. Osim toga, predviđa se da će unakrsni razgovor između zrelih epitelnih stanica bubrega i imunoloških stanica regrutirati antibakterijske makrofage i neutrofile u najosjetljivije regije bubrega. Sveukupno, sveobuhvatni imunološki krajolik bubrega pridonosi proučavanju patogenih mehanizama i identifikaciji terapijskih ciljeva kod imunoloških i zaraznih bolesti bubrega.

Lupusni nefritis (LN) potencijalno je fatalna autoimuna bolest za koju su trenutne terapije neučinkovite i često toksične. Molekularni i stanični procesi koji dovode do oštećenja bubrega i heterogenost LN ostaju nejasni. scRNA-seq koristili su Arazi et al. identificirati 21 subpopulaciju mijeloičnih, T, prirodnih ubojica i B stanica specifičnih za bolest u pacijenata s LN-om. Slično, Der et al. primijenili scRNA-seq na tkiva biopsije bubrega i kože pacijenata s LN-om. Zabilježeno je da su rezultati odgovora tubularnih epitelnih stanica na interferon tipa I viši u bolesnika s LN nego u zdravih kontrolnih osoba. Osim toga, upalne i fibrozne značajke tubularnih stanica bile su povezane s neučinkovitošću liječenja. U DKD-u, analiza scRNA-seq pokazala je značajno veći broj imunoloških stanica u dijabetičnim glomerulima nego u kontrolnim. Ove studije sugeriraju da su profili ekspresije gena imunoloških stanica u urinu, koži i bubrezima visoko povezani, što sugerira da biopsije urina i kože mogu biti potencijalni izvor dijagnostičkih i prognostičkih markera za bubrežnu bolest.

Nedavne studije pokazale su ulogu imunoloških stanica u modelima bubrežne bolesti s rezolucijom jedne stanice. Modeli jednostrane ureteralne opstrukcije naširoko se koriste za bubrežnu intersticijsku fibrozu, gdje makrofagi i upalne stanice infiltriraju bubrežni intersticij, što dovodi do značajnih promjena u bubrežnoj hemodinamici i metabolizmu. scRNA-seq je korišten u modelima reverzibilne unilateralne ureteralne opstrukcije za disekciju krajolika mijeloičnih stanica tijekom progresije i regresije fibroze. Conway i sur. otkrivena heterogenost u mijeloidnim stanicama, s dinamičkim promjenama u relativnim udjelima subpopulacija, monociti se regrutiraju rano u ozljedi, Ccr2 plus makrofagi nakupljaju se kasno u ozljedi, a novi klaster Mmp12 plus makrofaga igra ulogu u procesu popravka. Kod bolesti bubrega i transplantacije, ishemijsko-reperfuzijska ozljeda (IRI) povezana je s upalom i regrutiranjem leukocita. eksperimentalni modeli IRI korišteni su za procjenu funkcionalne uloge 2 skupine urođenih limfoidnih stanica u bubregu, a podaci sugeriraju da te stanice imaju redundantne funkcije u oštećenju bubrega. Primjenom scRNA-seq na IRI model bubrežnog presatka, Kremann et al. otkrili su da je kasnija CXCR5 plus infiltracija leukocita rezultirala povišenim sistemskim razinama CXCL13. Kirita i sur. također su primijenili knRNA-seq na IRI mišji model. karakterizirati detaljne stanične odgovore nakon ozljede i identificirati različito proupalno i profibrotično stanje stanica proksimalnih tubula. Mokraćna kiselina, konačni oksidacijski produkt metabolizma purina, usko je povezana s upalom bubrega u nekoliko modela bolesti. Na primjer, NLRP3 (NOD-, LRR- i strukturna domena 3 koja sadrži pirin) osjeća signale viška mokraćne kiseline, a upalne vezikule se aktiviraju u hiperurikemijskoj nefropatiji. Međutim, specifični imunološki mehanizmi koji leže u pozadini oštećenja bubrega uzrokovanog hiperurikemijom nisu poznati. Očekuje se da će se konstrukcija upalnog tjelesnog krajolika na razini jedne stanice u modelu oštećenja bubrega izazvanog hiperurikemijom realizirati u bliskoj budućnosti.

Imunološka infiltracija postoji unutar bubrežnih tumora i pod utjecajem je mikrookruženja tumora. Prethodno istraživanje pokazalo je da populacije makrofaga koji infiltriraju tumor eksprimiraju vaskularni endotelni faktor rasta A i uključeni su u složeni VEGF signalni put u tkivu RCC-a. Ova studija pokazuje da scRNA-seq može riješiti tumorigenezu i identificirati navodne patofiziološke mehanizme i stanične signalne mreže koje mogu poslužiti kao mete za terapiju lijekovima. Sve u svemu, studija naglašava napredak u scRNAseq koji pruža uvid u imunološki sustav i stanične mreže koje djeluju u zdravim i bolesnim bubrezima.

Biljna cistanča

Primjena scRNA-seq na organoide bubrega

Uz proučavanje oboljelih bubrežnih tkiva, bubrežni organoidi postali su ključni alat za proučavanje organogeneze i mehanizama bolesti te imaju potencijal ubrzati razvoj terapija kao izvora alternativnih tkiva. Paralelno, napredak u scRNA-seq doveo je do detaljnije analize različitih staničnih subpopulacija i promjena ekspresije gena u organima sličnim bubrezima.

Sve u svemu, bolje razumijevanje embrionalnog razvoja bubrega na razini jedne stanice potrebno je za usmjeravanje sazrijevanja organa sličnih bubrezima. Studije jednostanične transkriptomije bubrega ljudskog fetusa identificirale su 22 tipa stanica i odgovarajuće markerske gene.

Usporedba različitih razvojnih faza pokazuje kontinuitet molekularne dinamike stanica stopala. Još jedna jednostanična analiza provedena je na bubregu ljudskog fetusa i organima sličnim bubrezima izvedenim iz embrionalnih matičnih stanica. Usporedna analiza jednostaničnih razvojnih putanja u bubregu otkrila je slične profile ekspresije gena in vivo i in vitro, osim za podocite u kasnom stadiju, što ukazuje na nepotpuni proces sazrijevanja organa sličnih podocitima. Eksperimenti transplantacije dalje sugeriraju da se tilakoid i vaskularni lumen mogu optimizirati korištenjem organoidnih modela. Nedavna studija koja je koristila mezenhimalne i ureteralne pupoljke sličnih stanicama stražnjeg dijela bubrega za stvaranje bubrežnih organoida pokazala je da scRNA-seq poboljšava sazrijevanje proksimalnih tubula i smanjuje populaciju stanica izvan cilja. scRNA-seq analizu organoida bubrega izvedenih iz ljudskih pluripotentnih matičnih stanica (PSC) proveli su Subramanian et al. i Wu et al. U usporedbi s jednostaničnim skupovima podataka o bubrezima ljudskog fetusa i odrasle osobe, različiti organi slični bubrezima pokazali su uglavnom ponovljive tipove stanica, ali s različitim udjelima stanica zbog prisutnosti stanica koje nisu ciljane. Osim toga, analiza mreže faktora transkripcije otkrila je putove diferencijacije bubrežnih organoida, naglašavajući snagu jednostanične tehnologije u karakterizaciji i vođenju diferencijacije organoida.

Zaključno, organi slični ljudskim bubrezima koristan su izvor za rudarske modele bolesti, potencijalne regulatorne mehanizme, visokoučinkoviti probir lijekova i konačno regenerativne terapije. Ove studije naglašavaju potencijalnu upotrebu scRNA-seq u bubrežnim modelnim sustavima za razjašnjavanje in vivo fizioloških i patoloških procesa i daju smjernice za buduća istraživanja u dijagnostici i liječenju bubrežnih bolesti.

Uvid u alografte bubrega pomoću scRNA-seq

Alogena transplantacija bubrega jedan je od najučinkovitijih kliničkih tretmana završnog stadija bubrežne bolesti. Jednostanična tehnologija nudi mogućnost točne i precizne karakterizacije tipova i statusa bubrežnih stanica korištenjem uzoraka ljudske biopsije nakon alogene transplantacije. Prvo objavljeno izvješće o uzorcima biopsije transplantacije bubrega analiziralo je 8746 jednostaničnih transkriptoma i definiralo različite upalne odgovore. Monociti su formirali neklasičnu skupinu CD16 plus i klasičnu skupinu CD16-; endotelne stanice pokazale su stanje mirovanja i 2 stanja odbacivanja posredovana protutijelima. Ovi nalazi doprinose našem boljem razumijevanju imunološkog odbacivanja kod transplantacije bubrega. U komparativnoj studiji bubrežnih monocita iz primatelja i donatora, uzorci bubrežne biopsije pokazali su značajno različitu transkripcijsku ekspresiju gena. U primatelja su primijećeni makrofagi aktivirani upalom i citotoksično izražene T stanice. Slično, Liu et al. analizirali su stanice iz kroničnog odbacivanja bubrežnog presatka i podudarili zdrave odrasle bubrege na razini jedne stanice. Nenadzirana analiza grupiranja otkrila je da povećani broj imunoloških stanica i miofibroblasta u skupini s kroničnim odbacivanjem bubrežnog transplantata može pridonijeti bubrežnom odbacivanju i fibrozi. Naime, nedavna studija prikazala je prvi jednostanični atlas urina odrasle osobe i identificirala SOX9 plus populacije bubrežnih matičnih/progenitorskih stanica u urinu. Progenitorske stanice uspješno su se razmnožavale i diferencirale in vivo, poprimajući neka svojstva tubularnih stanica i pružajući potencijalno koristan izvor za buduću terapiju transplantacije bubrega. Sve u svemu, scRNA-seq tehnologija pruža nove i pronicljive uvide u odbacivanje ljudskog bubrežnog transplantata, u konačnici poboljšavajući dijagnostičku točnost i ubrzavajući usvajanje tumačenja molekularne biopsije.

Cistanche suplementi

Zaključak

U posljednjem desetljeću, scRNA-seq je postao nezamjenjiv alat za analizu diferencijalne ekspresije gena na cijelom transkriptomu za proučavanje fiziološke biologije i identificiranje abnormalnosti molekularne regulacije u bolesti. Za razliku od tradicionalnih diskretnih fenotipova, molekularna karakterizacija na razini jedne stanice može pružiti sustavni standard za karakterizaciju fenotipova bubrežne bolesti. Primjena jednostanične tehnologije u zdravom tkivu bubrega ili kliničkim uzorcima biopsije bubrega daje sveobuhvatan molekularni atlas bubrega i proširuje naše razumijevanje nefrologije. Renal Single Cell Atlas bit će sastavni dio međunarodnog rada Atlasa ljudskih stanica, čiji je cilj proizvesti sveobuhvatnu i sustavnu referentnu kartu ljudskog tijela. Očekuje se da će u budućim studijama jednostanične analize ultra-visoke propusnosti i prostorne transkriptome proširiti naše razumijevanje bubrega. Integracija multi-omics podataka dodatno će poboljšati personaliziranu dijagnozu i liječenje bubrežnih bolesti.

REFERENCE

1. Kriz W, Bankir L. Standardna nomenklatura za strukture bubrega. Bubrežna komisija Međunarodne unije fizioloških znanosti (IUPS). Kidney Int. 1988. siječnja; 33(1):1–7.

2. Kurts C, Panzer U, Anders HJ, Rees AJ. Imunološki sustav i bubrežna bolest: osnovni pojmovi i kliničke implikacije. Nat Rev Immunol. Listopad 2013;13(10):738–53.

3. Luyckx VA, Al-Aly Z, Bello AK, Bellorin Font E, Carlini RG, Fabian J, et al. Ciljevi održivog razvoja relevantni su za zdravlje bubrega: najnovije informacije o napretku. Nat Rev Nephrol. 2021. siječnja; 17 (1): 15–32.

4. Clark AR, Greka A. Snaga jednog: napredak u jednostaničnoj genomici u bubregu. Nat Rev Nephrol. Veljača 2020;16(2):73–4.

5. Han X, Wang R, Zhou Y, Fei L, Sun H, Lai S, et al. Mapiranje atlasa mišjih stanica mikrojažicom-seq. Ćelija. Veljača 2018.;172(5):1091–107.e17.

6. Park J, Shrestha R, Qiu C, Kondo A, Huang S, Werth M, et al. Jednostanična transkriptomija mišjeg bubrega otkriva potencijalne stanične mete bolesti bubrega. Znanost. Svibanj 2018.; 360(6390):758–63.

7. Hochane M, van den Berg PR, Fan X, Bérenger-Currias N, Adegeest E, Bialecka M, et al. Transkriptomika jedne stanice otkriva dinamiku ekspresije gena razvoja bubrega ljudskog fetusa. PLoS Biol. Veljača 2019;17(2): e3000152.

8. Han X, Zhou Z, Fei L, Sun H, Wang R, Chen Y, et al. Izgradnja krajolika ljudske stanice na razini jedne stanice. Priroda. svibanj 2020.; 581(7808):303–9.

9. Liao J, Yu Z, Chen Y, Bao M, Zou C, Zhang H, et al. Jednostanično RNA sekvenciranje ljudskog bubrega. Sci Podaci. 2020. siječanj;7(1):4.

10. Precizna medicina u nefrologiji. Nat Rev Nephrol. 2020. studeni;16(11):615.

11. Chen QL, Li JQ, Xiang ZD, Lang Y, Guo GJ, Liu ZH. Lokalizacija gena SARS-CoV-2 povezanih sa staničnim receptorima u bubregu analizom transkriptoma jedne stanice. Kidney Dis. 2020. srpanj;6(4):258–70.

12. Tietjen I, Rihel JM, Cao Y, Koentges G, Zakhary L, Dulac C. Jednostanična transkripcijska analiza neuronskih potomaka. Neuron. Travanj 2003.;38(2):161–75.

13. Chiang MK, Melton DA. Analiza jednostaničnog transkripta razvoja gušterače. Dev Cell. 2003. ožujak;4(3):383–93.

14. Guo G, Huss M, Tong GQ, Wang C, Li Sun L, Clarke ND, et al. Rješavanje odluka o sudbini stanice otkriveno analizom ekspresije gena jedne stanice od zigote do blastociste. Dev Cell. Travanj 2010;18(4):675–85.

15. Guo G, Luc S, Marco E, Lin TW, Peng C, Kerenyi MA, et al. Mapiranje stanične hijerarhije analizom pojedinačne stanice repertoara stanične površine. Matične stanice stanica. Listopad 2013;13(4):492–505.

16. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: revolucionarni alat za transkriptomiju. Nat Rev Genet. 2009. siječnja;10(1):57–63.

17. Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N, et al. mRNA-Seq analiza cijelog transkriptoma jedne stanice. Nat metode. 2009. svibanj;6(5):377–82.

18. Ramsköld D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, Faridani OR, et al. MRNA-seq pune duljine iz jednostaničnih razina RNA i pojedinačnih cirkulirajućih tumorskih stanica. Nat Biotechnol. 2012. kolovoz;30(8):777–82.

19. Picelli S, Björklund ÅK, Faridani OR, Sagasser S, Winberg G, Sandberg R. Smart-seq2 za osjetljivo profiliranje transkriptoma pune duljine u pojedinačnim stanicama. Nat metode. 2013. studeni; 10 (11): 1096–8.

20. Hagemann-Jensen M, Ziegenhain C, Chen P, Ramsköld D, Hendriks GJ, Larsson AJM, et al. Brojanje jednostanične RNA pri rezoluciji alela i izoforme pomoću Smart-seq3. Nat Biotechnol. 2020. lipnja;38(6):708–14.

21. Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I. CEL-seq: jednostanični RNA-seq multipleksiranim linearnim pojačanjem. Cell Rep. 2012, rujan; 2 (3): 666–73.

22. Yanai I, Hashimshony T. CEL-seq2-jednostanično sekvenciranje RNA pomoću multipleksirane linearne amplifikacije. Metode Mol Biol. 2019;1979: 45–56.

23. Streets AM, Zhang X, Cao C, Pang Y, Wu X, Xiong L, et al. Mikrofluidno jednostanično sekvenciranje cijelog transkriptoma. Proc Natl Acad Sci US A. 2014. svibanj;111(19):7048–53.

24. Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V, et al. Kapljično barkodiranje za transkriptomiju jedne stanice primijenjeno na embrionalne matične stanice. Ćelija. Svibanj 2015.; 161 (5): 1187–201.

25. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. Visoko paralelno profiliranje ekspresije pojedinačnih stanica na cijelom genomu pomoću nanolitarskih kapljica. Ćelija. Svibanj 2015.;161(5):1202–14.

26. Fan HC, Fu GK, Fodor SP. Profiliranje izraza. Kombinatorno označavanje pojedinačnih stanica za citometriju ekspresije gena. Znanost. Veljača 2015.; 347(6222):1258367.

27. Gierahn TM, Wadsworth MH, Hughes TK, Bryson BD, Butler A, Satija R, et al. Seq-well: prijenosno, jeftino sekvenciranje RNA pojedinačnih stanica uz visoku propusnost. Nat metode. Travanj 2017.;14(4):395–8.

28. Cao J, Packer JS, Ramani V, Cusanovich DA, Huynh C, Daza R, et al. Sveobuhvatno jednostanično transkripcijsko profiliranje višestaničnog organizma. Znanost. 2017. kolovoz;357(6352): 661–7.

29. Rosenberg AB, Roco CM, Muscat RA, Kuchina A, uzorak P, Yao Z, et al. Jednostanično profiliranje mišjeg mozga i leđne moždine u razvoju s barkodiranjem podijeljenog skupa. Znanost. Travanj 2018.;360(6385):176–82.

30. Cao J, Spielmann M, Qiu X, Huang X, Ibrahim DM, Hill AJ, et al. Jednostanični transkripcijski krajolik organogeneze sisavaca. Priroda. Veljača 2019;566(7745):496–502.

31. Cao J, O'Day DR, Pliner HA, Kingsley PD, Deng M, Daza RM, et al. Atlas ljudskih stanica ekspresije gena fetusa. Znanost. 2020.; 370(6518):370.

32. Chen L, Lee JW, Chou CL, Nair AV, Battistone MA, Păunescu TG, et al. Transkriptomi glavnih tipova stanica bubrežnih sabirnih kanala u miševa identificirani pomoću jednostanične RNA-seq. Proc Natl Acad Sci US A. 2017. studeni;114(46): E9989–98.

33. Ransick A, Lindström NO, Liu J, Zhu Q, Guo JJ, Alvarado GF, et al. Profiliranje jedne stanice otkriva spol, lozu i regionalnu raznolikost u mišjem bubregu. Dev Cell. 2019. studeni;51(3):399– 413.e7.

34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, Lis R, Zhang T, Lu T, et al. Molekularne determinante vaskularne specijalizacije nefrona u bubregu. Nat Commun. Prosinac 2019;10(1):5705.

35. Chung JJ, Goldstein L, Chen YJ, Lee J, Webster JD, Roose-Girma M, et al. Profiliranje jednostaničnog transkriptoma glomerula bubrega identificira ključne tipove stanica i reakcije na ozljedu. J Am Soc Nephrol. Listopad 2020; 31 (10): 2341–54.

36. Kramann R, Machado F, Wu H, Kusaba T, Hoeft K, Schneider RK, et al. Parabioza i jednostanično sekvenciranje RNA otkrivaju ograničeni doprinos monocita miofibroblastima u fibrozi bubrega. JCI Insight. Svibanj 2018.; 3 (9): e99561.

37. Kuppe C, Ibrahim MM, Kranz J, Zhang X, Ziegler S, Perales-Patón J, et al. Dekodiranje podrijetla miofibroblasta u fibrozi ljudskog bubrega. Priroda. 2021. siječnja;589(7841):281–6.

38. Wang H, Zheng C, Lu Y, Jiang Q, Yin R, Zhu P, et al. Fibrinogen u urinu kao prediktor progresije CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 2017. prosinac;12(12):1922–9.

39. Fu J, Akat KM, Sun Z, Zhang W, Schlondorff D, Liu Z, et al. Jednostanično RNA profiliranje glomerularnih stanica pokazuje dinamičke promjene u eksperimentalnoj dijabetičkoj bubrežnoj bolesti. J Am Soc Nephrol. Travanj 2019;30(4):533–45.

40. Zhang Y, Li W, Zhou Y. Identifikacija hub gena u dijabetičkoj bubrežnoj bolesti putem višestruke analize mikromreža. Ann Transl Med. 2020. kolovoz;8(16):997.

41. Wilson PC, Wu H, Kirita Y, Uchimura K, Ledru N, Rennke HG, et al. Jednostanični transkriptomski krajolik rane ljudske dijabetičke nefropatije. Proc Natl Acad Sci US A. 2019. rujan;116(39):19619–25.

42. Wu H, Kirita Y, Donnelly EL, Humphreys BD. Prednosti jednojezgrenog u odnosu na jednostanično RNA sekvenciranje odraslih bubrega: rijetki tipovi stanica i nova stanja stanica otkrivena u fibrozi. J Am Soc Nephrol. 2019. siječnja;30(1):23–32.

43. Young MD, Mitchell TJ, Vieira Braga FA, Tran MGB, Stewart BJ, Ferdinand JR, et al. Jednostanični transkriptomi iz ljudskih bubrega otkrivaju stanični identitet bubrežnih tumora. Znanost. 2018. kolovoz;361(6402):594–9.

44. Stewart BJ, Ferdinand JR, Young MD, Mitchell TJ, Loudon KW, Riding AM, et al. Prostorno-vremenska imunološka zona ljudskog bubrega. Znanost. Rujan 2019;365(6460):1461–6.

45. Arazi A, Rao DA, Berthier CC, Davidson A, Liu Y, Hoover PJ, et al. Krajolik imunoloških stanica u bubrezima pacijenata s lupusnim nefritisom. Nat Immunol. 2019. srpanj;20(7):902–14.

46. ​​Der E, Ranabothu S, Suryawanshi H, Akat KM, Clancy R, Morozov P, et al. Jednostanično RNA sekvenciranje za analizu molekularne heterogenosti u lupus nefritisu. JCI Insight. Svibanj 2017.;2(9):e93009.

47. Der E, Suryawanshi H, Morozov P, Kustagi M, Goilav B, Ranabothu S, et al. Transkriptomija tubularnih stanica i jednostaničnih stanica keratinocita primijenjena na lupusni nefritis otkriva IFN tipa I i puteve relevantne za fibrozu. Nat Immunol. 2019. srpanj;20(7):915–27.

48. Conway BR, O'Sullivan ED, Cairns C, O'Sullivan J, Simpson DJ, Salzano A, et al. Jednostanični atlas bubrega otkriva mijeloičnu heterogenost u progresiji i regresiji bubrežne bolesti. J Am Soc Nephrol. prosinac 2020.; 31 (12): 2833–54.

49. Cameron GJM, Cautivo KM, Loering S, Jiang SH, Deshpande AV, Foster PS, et al. Urođene limfoidne stanice skupine 2 suvišne su u eksperimentalnoj ishemijsko-reperfuzijskoj ozljedi bubrega. Front Immunol. 2019;10:826.

50. Kreimann K, Jang MS, Rong S, Greite R, von Vietinghoff S, Schmitt R, et al. Ishemijsko-reperfuzijska ozljeda pokreće oslobađanje CXCL13 i regrutiranje B stanica nakon alogene transplantacije bubrega. Front Immunol. 2020;11:1204.

51. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Stanično profiliranje mišje akutne ozljede bubrega otkriva očuvane stanične odgovore na ozljedu. Proc Natl Acad Sci US A. 2020. srpanj;117(27):15874–83.

52. Wen L, Yang H, Ma L, Fu P. Uloge NLRP3 signalnih putova posredovanih upalom u hiperurikemijskoj nefropatiji. Mol Cell Biochem. Ožujak 2021.;476(3):1377–86.

53. Nishinakamura R. Organoidi ljudskih bubrega: napredak i preostali izazovi. Nat Rev Nephrol. Listopad 2019;15(10):613–24.

54. Tran T, Lindström NO, Ransick A, De Sena Brandine G, Guo Q, Kim AD, et al. In vivo razvojne putanje ljudskih podocita informiraju in vitro diferencijaciju pluripotentnih podocita izvedenih iz matičnih stanica. Dev Cell. 2019. srpanj;50(1):102–e6.

55. Uchimura K, Wu H, Yoshimura Y, Humphreys BD. Organoidi bubrega izvedeni iz ljudskih pluripotentnih matičnih stanica s poboljšanim sazrijevanjem sabirnog kanala i modeliranjem ozljeda. Cell Rep. 2020. prosinac;33(11):108514.

56. Subramanian A, Sidhom EH, Emani M, Vernon K, Sahakian N, Zhou Y, et al. Popis pojedinačnih stanica organoida ljudskog bubrega pokazuje ponovljivost i smanjeni broj stanica izvan cilja nakon transplantacije. Nat Commun. 2019. studeni;10(1):5462.

57. Wu H, Uchimura K, Donnelly EL, Kirita Y, Morris SA, Humphreys BD. Usporedna analiza i usavršavanje diferencijacije organoida bubrega izvedenih iz ljudskog PSC-a s jednostaničnom transkriptomijom. Matične stanice stanica. 2018. prosinac;23(6):869–e8.

58. Czerniecki SM, Cruz NM, Harder JL, Menon R, Annis J, Otto EA, et al. Probir visoke propusnosti poboljšava diferencijaciju organoida bubrega iz ljudskih pluripotentnih matičnih stanica i omogućuje automatizirano višedimenzionalno fenotipiziranje. Matične stanice stanica. 2018. lipnja; 22 (6): 929–e4.

59. Dvela-Levitt M, Kost-Alimova M, Emani M, Kohnert E, Thompson R, Sidhom EH, et al. Mala molekula cilja na TMED9 i potiče lizosomalnu degradaciju kako bi se preokrenula proteinopatija. Ćelija. 2019. srpanj;178(3):521–e23.

60. Wu H, Malone AF, Donnelly EL, Kirita Y, Uchimura K, Ramakrishnan SM, et al. Transkriptomija jedne stanice uzorka biopsije alografta ljudskog bubrega definira raznolik upalni odgovor. J Am Soc Nephrol. 2018. kolovoz;29(8):2069–80.

61. Malone AF, Wu H, Fronick C, Fulton R, Gaut JP, Humphreys BD. Iskorištavanje izražene varijacije jednog nukleotida i sekvenciranje jednostanične RNA za definiranje kimerizma imunoloških stanica u odbacivanju transplantata bubrega. J Am Soc Nephrol. 2020. rujan;31(9):1977–86.

62. Liu Y, Hu J, Liu D, Zhou S, Liao J, Liao G, et al. Analiza jedne stanice otkriva imunološki krajolik u bubrezima pacijenata s kroničnim odbacivanjem transplantata. Teranostika. 2020.; 10(19):8851–62.

63. Wang Y, Zhao Y, Zhao Z, Li D, Nie H, Sun Y, et al. Jednostanična RNA-Seq analiza identificirala je stanice preteče bubrega iz ljudskog urina. Proteinska stanica. Travanj 2021.;12(4):305–12.

64. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. Sekvenciranje RNA: tinejdžerske godine. Nat Rev Genet. 2019. studeni;20(11):631–56. 65 Regev A, Teichmann SA, Lander ES, Amit I, Benoist C, Birney E, et al. Atlas ljudske stanice. Elife. 2017;12:6.

Mengmeng Jiang^a,b; Haide Chen^{b, c}; Guoji Guo^{a, b, c, d, e}

a: Laboratorij Liangzhu, Medicinski centar Sveučilišta Zhejiang, Hangzhou, Kina;

b: Centar za matične stanice i regenerativnu medicinu, Medicinski fakultet Sveučilišta Zhejiang, Hangzhou, Kina;

c: Zhejiang Provincial Key Lab for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Dr. Li Dak Sum & Yip Yio Chin, Centar za matične stanice i regenerativnu medicinu, Hangzhou, Kina;

d: Centar za transplantaciju koštane srži, Prva pridružena bolnica, Medicinski fakultet Sveučilišta Zhejiang, Hangzhou, Kina;

e: Institut za hematologiju, Sveučilište Zhejiang, Hangzhou, Kina