Studija o terapeutskim učincima i mehanizmima ekstrakta Cistanche Deserticola na sarkopeniju izazvanu deksametazonom kod miševa

Sažetak:Ova studija istraživala jeterapeutski učinak ekstrakta Cistanche deserticola (CdE)o sarkopeniji izazvanoj deksametazonom (Dex) u miševa i mogućem mehanizmu djelovanja. Prvo, farmakodinamičke komponente i važne mete Cistanche proučavane su mrežnom farmakologijom, a putovi su obogaćeni kako bi se predvidio mehanizam djelovanja CdE. U pokusima na životinjama, 50 KM miševa nasumično je podijeljeno u 5 skupina (kontrolna skupina, skupina Dex modela, skupina s visokom dozom CdE, skupina s srednjom dozom CdE i skupina s niskom dozom CdE). Osim kontrolne skupine, ostalim je skupinama ubrizgana supkutana injekcija kako bi se izazvala sarkopenija nakon 42 dana, a trima tretiranim skupinama oralno su istodobno davane različite doze CdE. Tijekom pokusa redovito su testirani težina životinja, sposobnost vježbanja i sastav tijela. Nakon što su životinje žrtvovane, izračunat je mišićni koeficijent stražnjih udova, te su obavljeni histološki i povezani testovi ekspresije gena. Rezultati mrežne farmakologije pokazuju da CdE može liječiti sarkopeniju reguliranjem signalnih putova povezanih s IGF-1. Rezultati pokusa na životinjama pokazuju da CdE značajno preokreće smanjenje udjela nemasnog mesa i mišićnog koeficijenta uzrokovano Dexom, poboljšava sposobnost vježbanja, smanjuje sadržaj masnoće, poboljšava histološki status mišića, pojačava IGF-1, MyoD i MyoG i smanjuje ekspresiju Atrogin-1 i MuRF-1. CdE ima terapeutski učinak na atrofiju mišića izazvanu Dex-om i može poboljšati histološku morfologiju mišića, a njegov mehanizam djelovanja može biti aktivacija IGF-1 signalnog puta.

Ključne riječi: Ekstrakt Cistanche deserticola; deksametazon; sarkopenija; mrežna farmakologija; IGF-1 put

 

 

dobrobit ehinakozida

 

1. Materijali i metode

1.1 Reagensi

U ovoj studiji korišteni su sljedeći reagensi:

Injekcija deksametazon natrijevog fosfata(Broj serije. 040191147) – Shanxi Ruicheng Kelong Veterinary Medicine Co., Ltd.

Normalna fiziološka otopina(Broj serije L220092407) – Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.

Bezvodni etanol, ksilol, paraformaldehid, iglutaraldehid– Kineska nacionalna farmaceutska grupa

Klorovodična kiselina(CAS: 7647-01-0) – Chengdu Kelon Chemicals Co., Ltd.

Otopina za bojenje hematoksilinom– Wuhan Servicebio Biological Technology Co., Ltd.

Otopina boje eozina– Hefei Bomei Biological Technology Co., Ltd.

812 komplet za ugradnju epoksidne smole, uranil acetat– Tvrtka SPI

Molpure® komplet za ekstrakciju RNK, PrimeScript RT komplet, TB Green™ Premix Ex Taq™ II– YEASEN Biotechnology i Takara Biomedical Technology Co., Ltd.

3 aktivna sastojka cistanke

 

1.2 Instrumenti

Glavna korištena oprema:

NK-10 analogni push-pull mjerač– Wenzhou Weidu Instrument Co., Ltd.

QMR06-060H analizator sastava tijela– Niumag Corporation

BA 210 digitalni trinokularni mikroskop– Motic Group

JEM-1400 FLASH prijenosni elektronski mikroskop– JEOL, Japan

QuantStudio™ 3 PCR sustav u stvarnom vremenu– ThermoFisher Scientific

 

1.3 Mrežna farmakološka analiza

Istražiti aktivne spojeve i potencijalne mehanizmeCistanche tubulosau liječenjusarkopenija, a mrežna farmakologijakorišten je pristup:

Aktivni spojeviodCistanche tubulosapregledani su pomoćuFarmakološka baza podataka sustava tradicionalne kineske medicine (TCMSP), s pragovima od:

Oralna bioraspoloživost (OB) veća ili jednaka 30%

Sličnost lijeku (DL) Veća ili jednaka 0,18

Dodatni spoj iciljane informacijepreuzeto je iz:

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)

Geni povezani s bolešću za sarkopenijudobiveni su od:

DisGeNET(http://www.disgenet.org)

GeneCards(https://www.genecards.org)

Analiza protein-protein interakcije (PPI).izvedeno je putemSTRING baza podataka(https://string-db.org).

A mreža interakcije spoj–cilj–genkonstruiran je korištenjemCytoscape 3.2.1.

Funkcionalno obogaćivanjeprovedeno je pomoću:

DAVID(https://david.ncifcrf.gov) zaGenska ontologija (GO)

KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) za analizu puta

Rezultati su vizualizirani putemBioinformatički online alat(https://www.bioinformatics.com.cn/)

cistanche tubulosa

1.4 PripremaCistanche tubulosaEkstrakt (CdE)

TheCistanche tubulosaekstrakt je pripremljen na sljedeći način:

Kriške sirove biljke (serijski br. Y221217) kupljene su odSichuan TCM Decoction Pieces Co., Ltd., a autentičnost je potvrdio prof. Yang Wenyu sa Sveučilišta Xihua.

1 kg osušenihCistanche tubulosaje usitnjena u prah i propuštena kroz aSito od 40 oka.

A Omjer materijala i tekućine 1:20korišten je sa50% otopina etanol-voda.

Smjesa je bilanatopljeno 30 min, nakon čega slijediultrazvučna ekstrakcijana55 stupnjeva, 250 W, za40 min.

Izvodi su bilicentrifugirana, filtrirana i koncentrirana pod smanjenim tlakomna 60 stupnjeva do guste paste (gustoće 1,2) pomoću rotacijskog isparivača.

Koncentrirani ekstrakt bio jeliofilizirano pod vakuumom, dajući finaleučinkovitost ekstrakcije od 40%.

 

1.5 Dizajn pokusa na životinjama

Ukupno50 Muški KM miševi SPF stupnja, star 6 tjedana i na vaganju(22 ± 2) g, korišteni su u ovoj studiji (dozvola za životinje br.SCXK [Chuan] 2023-030). Svi postupci na životinjama su slijediliPravilnik o upravljanju laboratorijskim životinjamakoje je izdalo Ministarstvo znanosti i tehnologije Narodne Republike Kine i bili suodobrio Odbor za etiku životinja Sveučilišta Xihua(Odobrenje br.: XH-2023-02-01).

Uvjeti stanovanja:Temperatura (26 ± 1 stupanj), vlažnost (50 ± 10%), 12 h ciklusa svjetlo/mrak, slobodan pristup hrani i vodi.

Nakon 7 dana aklimatizacije miševi su bilinasumično raspoređeni u 5 grupana temelju tjelesne težine.

Svakodnevno se bilježila tjelesna težina, a pratilo se opće zdravstveno stanje poput ponašanja, stanja krzna i unosa hrane.

Terapijske skupine i dozesu detaljno opisani uTablica 1.

Nadana 40–42, testovi motoričkih funkcija(snaga stiska i plivanje).

Nadan 43, nakon 12 sati gladovanja, zabilježena je tjelesna težina i sastav tijela. Miševi su zatim anestezirani eterom i žrtvovani. Bilateralni skeletni mišići stražnjih ekstremiteta brzo su secirani i izvagani.

Thelijevi gastrocnemiusbio je uzdužno izrezan i učvršćen3% glutaraldehidai4% paraformaldehida, odnosno.

Thedesni gastrocnemiusbio zamrznut na -80 stupnjevaqPCR analiza.

SEO ključne riječi:životinjski model sarkopenije, KM miševi, eksperiment mišićne atrofije, procjena mišićne funkcije, etičko istraživanje na životinjama

prednosti akteozida

1.6 Sastav tijela i mjerenje mišićnog indeksa

Tjelesna težinabilježena je svakodnevno tijekom eksperimenta.

Prije žrtve,sastav tijela(mršava masa i masna masa).dvaput, iprosječna vrijednostje snimljeno.

Nakon žrtvovanja,skeletni mišić stražnjeg udabio je izvagan.

Theindeks mišićne maseizračunat je pomoćuCuadros formula [11]:

Mišićni indeks (%)=Mišićna masa/tjelesna težina × 100
(Jednadžba 1)

SEO ključne riječi:nemasna tjelesna masa u miševa, izračun mišićnog indeksa, analizator sastava tijela, biomarkeri sarkopenije

 

1.7 Testovi motoričkih funkcija

Ocijenitirad mišića, sljedeći testovi su provedeni između 40. i 42. dana:

Test plivanja:

Svaki miš je biovagao, i aopterećenje (5% tjelesne težine u olovnoj foliji)bio fiksiran za distalnu trećinu repa.

Miševi su stavljeni u aposuda s vodom od 25 stupnjeva, na dubini većoj ili jednakoj 30 cm.

Vrijeme plivanjasniman je od ulaska sve dok miš više nije mogao plutati i počeo je tonuti.

Svaki miš je testiran jednom dnevno na3 uzastopna dana, iprosjekuzeto je kao konačni rezultat.

Ispitivanje čvrstoće prianjanja:

manual push-pull mjerač.

Svaki miš je testiranpet puta, s aOdmor od 150 sekundiizmeđu testova.

Thekoeficijent čvrstoće stiskaje izračunato za normalizaciju tjelesne težine:

Koeficijent snage stiska=Sila stiska / tjelesna težina (N/kg)
(Jednadžba 2)

SEO ključne riječi:test izdržljivosti u plivanju, snaga stiska kod glodavaca, metrika mišićne izvedbe, mišji model sarkopenije

 

1.8 Histološka analiza

Za procjenumorfološke promjene u mišićnom tkivunakon tretmana saCistanche tubulosaekstrakt (CdE):

Bojanje hematoksilinom i eozinom (H&E).izvedena je na tkivu fiksiranom u4% paraformaldehida.

Sekcije su promatrane pod asvjetlosni mikroskop, ipovršina presjeka mišićnog vlaknaSlikaJsoftver.

Zaultrastrukturna analiza, mišići fiksirani3% glutaraldehidanaknadno su postavljeni u1% osmijev tetroksid, dehidriran u acetonu i ugrađen uEp812 smola.

Polutanki dijelovibili zamrljani satoluidinsko plavoza pozicioniranje.

Ultratanki dijelovibili zamrljani sauranil acetat i olovo citrat, a promatrano s aTransmisijski elektronski mikroskop JEM-1400FLASH.

Širina mišićnog vlaknaizmjereno je pomoću ImageJ.

SEO ključne riječi:histologija skeletnih mišića, protokol bojenja HE, elektronska mikroskopija u istraživanju mišića, analiza morfologije mišićnih vlakana

popis beneficija cistanche

1.9 Analiza ekspresije gena

Za istraživanjemolekularni mehanizmiCdE u sarkopeniji:

Smrznuto mišićno tkivosu mehanički prekinuti pod tekućim dušikom.

Ukupna RNA je ekstrahirana pomoćuTRIčisti reagensprema uputama proizvođača.

cDNA je sintetizirana s akomplet za obrnutu transkripciju, iqPCRizvedeno je pomoću aThermo Scientific PikoRealsustav.

GAPDHkorišten je kao unutarnji referentni gen.

Primer sekvence zageni povezani s mišićimanavedeni su uTablica 2.

SEO ključne riječi:qPCR za gene za atrofiju mišića, GAPDH referentni gen, ekstrakcija RNA iz mišića, ekspresija gena u sarkopeniji

 

1.10 Statistička analiza

Eksperimentalni podaci analizirani su korištenjemjednosmjerna ANOVA, nakon čega slijediDunnettov test višestruke usporedbe.

A P-vrijednost < 0,05se smatralo statistički značajnim.

Sve statističke analize provedene su korištenjemSPSS 23.0.

Histomorfometrijski podacianalizirani su pomoćuSlikaJsoftver.

SEO ključne riječi:statistička analiza u farmakološkim studijama, SPSS u biomedicinskim istraživanjima, ANOVA u studijama na životinjama, ImageJ analiza mišića