Studija o učinku aktiozida (aktivni sastojak u Cistanche Deserticola) na NAFLD inducirajući autofagiju

Sažetak:

 

Cilj:Da bi se istražila funkcija autofagije aktivnog sastojka Acteozida (ACT) u pustinjskoj pustinji Cistanche i njegov utjecaj na bezalkoholnu bolest masne jetre (NAFLD).

MetodeDa bi uzeli ehinakozid i djelovali kao istraživački objekti, 1 {0 0 µmol/L ACT i ehinakozid (ECH) kombinirano je s inhibitorom autofagije-lisosoma Bleomicin A1 za intervencijsko liječenje. Proteinsko imunobloting korišten je za otkrivanje relativne razine ekspresije mikrotubule proteina koji se nalazi protein proteina 1 Lagani lanac 3 (LC 3- II). HEPG2 stanice su intervenirane s različitim koncentracijama ACT in vitro, a vitalnost stanica je otkrivena metodom tetrazolijske soli. In vitro intervencija HepG2 stanica s različitim koncentracijama ACT -a u kombinaciji s balofloksacinom A1, i otkrivanjem LC 3- II ekspresije proteina imunonoblottinga. NaFLD model konstruiran in vitro s intervencijom lijeka korišten je za mrlje lipidnih kapljica pomoću ulja crvene O metode bojenja i otkrivanje razine unutarćelijskog triglicerida. Promatrajte lokalizaciju kapljica proteina LC3 i lipida putem imunofluorescentne tehnologije. Rezultati mogu značajno inducirati autofagiju u HEPG2 ćelijama, a razina ekspresije LC 3- II proteina značajno se povećava u usporedbi s kontrolnom skupinom (tretirana sa samom ACT -om) (1.36 ± 0. 11, {}}. 28}. respektivno), sa statističkim značajem (P0.05). 50 µmol/L djelo značajno induciralo autofagiju u stanicama HepG2, a razina ekspresije Lc 3- II proteina značajno je porasla (1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18, respektivno). TG razina HEPG2 stanica u ACT interventnoj skupini (19,11 ± 1,68) bila je značajno niža od one u skupini Model Model Model In vitro stanice NAFLD (34,15 ± 1,90), a razlike su bile statistički značajne (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Ključne riječi:Bezalkoholna bolest masne jetre;Pustina;Akteozid; Autofagija

 

TCM Herb Cistanche za liječenje bezalkoholne bolesti masne jetre (NAFLD)

Kliknite sliku da biste dobili više detalja

 

U posljednjih nekoliko desetljeća bezalkoholna masnabolest jetre(NAFLD) postao je najčešćikronična bolest jetre, s globalnom prevalencijom od oko 25% odrasle populacije, a smatra se da je usko povezana s metaboličkim sindromom [1]. Iako je vjerojatnost komplikacija povezanih s jetrom u bolesnika s NAFLD-om manja od 10%, NAFLD je faktor rizika za bolesti povezane s jetrom, poput ciroze i primarnog karcinoma jetre, što nameće ogroman ekonomski opterećenje pacijentima [2-5]. Unatoč sve većoj pažnji koja se posvećuje NAFLD -u, NAFLD kao važna kronična bolest nije privukla dovoljnu pažnju. Stoga su daljnje dubinsko razumijevanje patogeneze NAFLD-a i potraga za učinkovitim strategijama liječenja postalo hitne probleme koje treba riješiti [6-7].

Nedavna istraživanja pokazala su da stanična autofagija igra važnu ulogu u fiziologiji i patologiji jetre [8]. Disfunkcija autofagije ili disregulacija povezana je s raznim jetrenim bolestima poputbolest jetre povezana s alkoholom[9], NAFLD [10], bezalkoholni steatohepatitis [11] i hepatocelularni karcinom [12]. Patološke karakteristike NAFLD-a su prekomjerno taloženje triglicerida (TG) i drugih neutralnih kapljica lipida (LD) u hepatocitima pod bezalkoholnom stimulacijom. Za jetru, dva glavna puta koji reguliraju katabolizam ovih LD -a su lipoliza i autofagija.
Put lipolize reguliran je citoplazmatskim neutralnim lipazama, kao što su hormon-osjetljiva lipaza i masna TG lipaza. U odgovarajućem putu lipoautofagije, LDS se selektivno može preuzeti izravnim regrutovanjem proteina povezanih s autofagijom kako bi formirali autofagosome, a zatim se LDS kapsulirani autofagosomima dodatno isporučuju u lizosome i desomuniraju se kiselinom lipazom u lizosomima. Stoga je aktiviranje lipoautofagije u hepatocitima postalo učinkovita strategija za prevenciju i liječenje NAFLD -a.
Cistanche Deserticola je dragocjena kineska biljna medicina koja se široko koristi u kliničkoj praksi u formulama tradicionalne kineske medicine. Istodobno se već dugo koristi kao dodatak zdravstvenoj hrani. Cistanche Deserticola sadrži razne bioaktivne sastojke, od kojih su najvažniji Cistanche pustinski feniletanol glikozidi. Kao predstavnici feniletanoidnih glikozida, zabilježeno je da ehinakozid (ECH) i verbaskozid (ACT) imaju mnoge važne biološke aktivnosti, poput antioksidacijskog, neuroprotektivnog, imunomodulacijskog i zaštite jetre [13]. U pogledu zaštite jetre, studije su otkrile da ECH može zaštititi jetru smanjujući upalne posrednike, inhibirajući transformirajući faktor rasta i smanjujući razinu ekspresije gena povezanih s fibrozom jetre. ACT ima značajan zaštitni učinak na kemijsko oštećenje jetre i lijekova, poput alkohola, ugljičnog tetraklorida i lipopolisaharida. ACT smanjuje oksidativni stres uzrokovan toksičnim kemikalijama, uklanja reaktivni kisik akumuliran u jetri i smanjuje koncentraciju malondialdehida. Istodobno, značajno povećava aktivnost jetre superoksida dismutaze i smanjuje sadržaj glutationa i značajno poboljšava histopatološko oštećenje jetre i apoptozu. Međutim, ne postoji relevantno izvješće o literaturi o tome jesu li feniletanoidni glikozidi Cistanche Deserticola uključeni u proces autofagije u izvršavanju zaštite jetre. Na temelju toga, ovo je istraživanje koristilo konvencionalne metode biologije stanične biologije i model in vitro stanica za preliminarno istraživanje učinka feniletanoidnih glikozida pustinjske pustinjske pustinjske autofagije i istražio njegove moguće farmakološke funkcije, ciljajući da pruži znanstvenu osnovu za budući razvoj lijekova.

 

1 Materijali i metode

1.1 Materijali

1.1.1 Istraživački ispitanici ECH i ACT korišteni su kao ispitanici.

1.1.2 Stanice HEPG2 kupljene su od Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (serijski broj: B21209) i ACT (serijski broj: B20715, HPLC čistoća veća od ili jednaka 98%) kupljene su od Shanghai Yuancea, BAFCACE, DMEM Trypsin su kupljeni od tvrtke Hyclone Company, SAD, fetalni goveđi serum (serijski broj: {04-002-1 a) kupljen je od kompanije BI, Izrael, penicilin/streptomicin (serijski broj: SV30010.01) kupljen od tvrtke Hyclone, SAD, M81, MTT (BATCH BATCH: TG (serijski broj: BC0625) Komplet za otkrivanje kupljen je od tvrtke Solebao Company, Peking, Kina, Oil Red O (Lot broj: O {0625-100 g), dimetil sulfoksid (Broj lota: BCBZ1685) kupljen je od Sigma-Aldrich, USA; Inhibitor autofagije-lizosoma Bafilomicin A1 (BAFA1, Broj lota: TLRL-BAF1) kupljen je od Invitrogena, USA; Aktivator autofagije Rapamycin (Lot broj: S17098) kupljen je od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Kina; Protein 1 protein 1 proteina 1 (LC3, Broj lota: L7543, vrsta: zec, omjer razrjeđivanja: 1: 1 000) i -actin (lot broj: zrb1312, vrste: zec, omjer razrjeđivanja: 5 000) Antibodies hren sekundarno antitijelo obilježeno peroksidazom (lot broj: {4010-05, vrsta: kozji anti-zečji, omjer razrjeđenja: 1: 1 000) kupljen je od južne biotehnike, američka kompanija: Alexa Fluor Fluorescentus Označena sekundarna (lot38, wavevelth, wavevel. Sigma-Aldrich Company, SAD i Bodipy 493/501 (Broj lota: D3922) kupljen je od tvrtke Invitrogen Company, USA.

 

1.2 metode

1.2.1 Stanična kultura

HEPG2 stanice uzgajane su u Dulbeccovom modificiranom mediju o orlu s visokom glukozom koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina i 100 UG/ml streptomicina u inkubatoru od 37 stupnjeva, 5% ugljičnog dioksida. Kad je uvjeti stanice doseglo 85%, provedene su subkulture, obloga, intervencija i druge operacije.

 

1.2.2 Otkrivanje imunoblotiranja proteina

1.2.2.1 ACT i ECH tretman

LC 3- ⅱ Razina ekspresije proteina u HEPG2 stanicama BAFA1, kao inhibitor protonske pumpe, može uzrokovati Lc {{3} ⅱ ⅱ protein da se agregiraju u velikim količinama u stanicama, pojačavajući tako sposobnost autofagije. Stoga se kombinirana upotreba BAFA1 može koristiti kao sustav za praćenje autofagije za procjenu indukcijske sposobnosti autofagije. HEPG2 stanice u fazi logaritamskog rasta prenesene su u posude za kulturu stanične kulture od 3,5 cm za kulturu preko noći. Za intervenciju je 12 h, 100 µmol/L ACT, ECH i BAFA1. Stanice su isprane unaprijed hlađenom otopinom fosfatnog pufera (PBS) i odmah lizirane u puferu za lizu proteina RIPA 10 minuta. Supernatant je centrifugiran, a ukupna koncentracija proteina određena je korištenjem kompleta koncentracije koncentracije proteina bicinhoninske kiseline. Nakon kvantifikacije puferom natrijevog dodecil sulfata, uzorak je zagrijan na 95 stupnjeva 10 minuta kako bi se protein denaturao. Tada je 30 μl uzorka uzeto mikropipetom i elektroforezirano na poliakrilamidnom gelu.
Nakon elektroforeze, protein je prebačen iz gela u nitroceluloznu membranu, blokiranu s 1 0% mlijeka preko noći, inkubiran sa specifičnim primarnim antitijelom na sobnoj temperaturi 1 sat, ispravan fosfatnim puferom koji sadrži 0,5% Triton i s specifičnim sedmiranim temperaturama. ECL metoda korištena je za razvoj boja. Oni su postavljeni kao prazna kontrolna skupina, Rapamycin Group, ECH Group, ACT Group, Rapamycin+BAFA1 Group, ECH+BAFA1 Group i ACT+BAFA1 Group.

 

1.2.2.2 Različite koncentracije ACT intervenirale su razinu ekspresije Lc 3- ⅱ proteina u stanicama Hepg2

Logaritamske stanice faze rasta HEPG2 prenesene su u posude za kulturu stanične kulture od 3,5 cm za kulturu preko noći, a 25, 50 i 100 µmol/L ACT u kombinaciji s BAFA1 korišteno je za intervencijsko liječenje 12 h, a razina ekspresije LC {{8} ⅱ proteina je izražena imunonoblotting proteina. Kontrolna skupina, kontrola za gladovanje (STA grupa, HEPG2 stanice liječenja gladovanjem), 25, 50 i 100 µmol/L ACT skupina, i BAFA1 u kombinaciji s 25, 50 i 100 µmol/L ACT skupinom.

1.2.3 MTT metoda za otkrivanje stope preživljavanja HEPG2 stanica tretiranih s različitim koncentracijama ACT -a tijekom 24 i 48 h
HEPG2 stanice u fazi logaritamskog rasta inokulirane su u ploči 96- s umjerenom gustoćom inokulacije i uzgajane u inkubatoru 12 sati. 2 {0, 40, 60, 80 i 100 µmol/L ACT dodani su tijekom 24 i 48 h. 0,5 mg/ml MTT otopine dodano je u tamnom okruženju i inkubirano u inkubatoru. Nakon 4 sata, supernatant je odbačen, u svaku je jažicu dodano 100 μl dimetil sulfoksida, a stanice su tresene u konstantnom tresenju temperature na 37 stupnjeva 10 minuta. Vrijednost optičke gustoće (OD) na valnoj duljini od 490 nm otkrivena je enzimskim markerom, a izračunata je stopa preživljavanja stanica.

 

1.2.4 In vitro konstrukcija modela NAFLD ćelije

Određena težina palmitske kiseline (PA) je izvađena i potpuno otopljena u određenom volumenu izopropanola za pripremu 100 mmol/l PA zaliha, koja je zatim podijeljena i pohranjena u hladnjaku -20 za kasniju uporabu. Otopina PA razrijeđena je na 100 µmol/L pomoću kompletnog medija za kulturu, a dodano je 1% albumina goveđeg seruma bez masnih kiselina. Stanice su se inkubirale na 37 stupnjeva u trajanju od 3 sata za pripremu indukcijske otopine. HEPG2 stanice u fazi logaritamskog rasta prenesene su u posudu za staničnu kulturu od 3,5 cm uz odgovarajuću gustoću za kulturu preko noći, a zatim je pripremljena indukcijska otopina korištena za intervenciju.

 

1.2.5 ACT Intervencija NaFLD in vitro stanična model TG Detekcija i ulja crveno O bojenje

 

1.2.5.1 Detekcija TG

HEPG2 stanice u fazi logaritamskog rasta prenesene su u posudu za kulturu stanične kulture od 3,5 cm prema kulturi u skladu s praznom kontrolnom skupinom, grupom modela i ACT interventnom skupinom. Grupa modela inducirana je sa 100 µMOL/L PA indukcijske otopine, a ACT interventna skupina inducirana je sa 100 µmol/L PA indukcijskom otopinom, a istodobno je dodano 50 µmol/L ACT. Vrijeme intervencije bilo je 24 h. Lagano uklonite stari kulturni medij, polako operite staničnu površinu s unaprijed hlađenim PBS-om jednom, dodajte 100 μl/posudu unaprijed hlađenog otopine za lizu RIPA, u potpunosti na ledu 15 min, centrifugirajući na 4 stupnja i {12 000 R/min tijekom 10 minuta, uzmite 10 µl za ENZMIMST, TG μl za detekciju TG μl za TG µl za TG µl za TG μl Upute TG kompleta i na kraju ispravite razinu TG po mg proteina.

1.2.5.2 Ulje crveno O bojenje

HEPG2 stanice u fazi logaritamskog rasta prenesene su u posudu za kulturu od 3,5 cm prekrivene sterilnim pokrivačem za kulturu preko noći. 100 μmol/L PA induciralo je stanice da formiraju kapljice lipida. Istodobno, dodano je 50 µmol/L Zakon za intervenciju u trajanju od 24 sata.
Stanični dijapozitivi su prikupljeni, isprani 3 puta s unaprijed hlađenim PBS-om, fiksiranim s 4% formaldehidom na sobnoj temperaturi 10 minuta, oprali staničnu površinu PBS-om, dodali radnoj otopini za ulje O, obojene na sobnoj temperaturi u mraku 15 minuta, aspirirali su uljana otopina, s dvostrukog voda, s dvostrukog voda, obrezana, s dvostrukom otopinom obojene vode, oprana je u dvostrukom otopini za mrlje od 60. fotografiran pod mikroskopom.

 

1.2.6 Imunofluorescentno promatranje autofagosoma i kapljica lipida nakon tretmana ACT -a

HEPG2 stanice u fazi logaritamskog rasta prenesene su u posudu za kulturu od 3,5 cm prekrivene sterilnim pokrivačem za kulturu preko noći. 1 0 0 µmol/L PA korišten je za induciranje stvaranja kapljica lipida u ćelijama. Istodobno je dodan ACT za interventni tretman tijekom 24 sata. Stanični dijapozitivi su prikupljeni, isprani 3 puta s unaprijed hlađenim PBS-om, fiksiranim na sobnoj temperaturi 10 minuta s 4% formaldehidom, permeabilizirani na sobnoj temperaturi 15 minuta s permeabilizacijskim međuspremnikom koji sadrži 0,1% saponina, blokiran na sobnoj temperaturi, a s koznim serumom, s 1 h, s {{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{°} Specifično fluorescentno označeno sekundarno antitijelo, inkubirano na sobnoj temperaturi i udaljen od svjetla 1 sat. Nakon inkubacije antitijela, dijapozitivi su isprani 3 puta s PBS-om, suprotstavljeni lipidnim kapljicama specifičnim bodipima 493/503 na sobnoj temperaturi 10 minuta, isprane s PBS-om i zapečaćene anti-fadi medijem za brtvljenje, osušeni u mraku, promatrani s laserskim konfokalnim mikroskopom i zabilježenim. Postavljena je prazna kontrolna skupina, grupa za liječenje rapamicina i ACT interventna skupina.

 

1.3 Statistička analiza

SPSS25. 0 Statistički softver korišten je za analizu podataka. Kvantitativni podaci izraženi su kao x ± s. Korištena je jednosmjerna analiza varijance i LSD-T testa. P<0.05 was considered statistically significant.