Mali, ali moćni — egzosomi, novi međustanični glasnici u neurodegeneraciji, 3. dio

Egzosomi izvedeni iz mikroglije: Mikroglijalne stanice su makrofagi mozga i leđne moždine. Oni čine približno 10% glije.

Mikroglija je vrsta ne-neuronskih stanica u mozgu i najzastupljenije su stanice u živčanom sustavu. U prošlosti se smatralo da su mikroglije stanice koje podupiru neurone i koje uglavnom osiguravaju kisik i hranjive tvari.

Međutim, nedavne studije su otkrile da mikroglija igra važnu ulogu u ljudskom zdravlju i kognitivnoj funkciji. Studije su pokazale da mikroglija igra vitalnu ulogu u procesu učenja i pamćenja.

Mikroglija uglavnom potiče rast i razvoj neurona otpuštanjem tvari koja se naziva čimbenik rasta neurona. Ovaj čimbenik rasta ne samo da pomaže neuronima da se povezuju i prenose informacije, već također potiče stvaranje novih neurona. Ovi su učinci ključni za održavanje zdravog učenja i pamćenja.

S druge strane, mikroglija također može ukloniti višak neurona i sinapsi u mozgu i promicati zdrav razvoj živčanog sustava. Ovaj postupak uklanjanja može pomoći u smanjenju ometajućih signala u mozgu i poboljšati kognitivne funkcije.

Osim toga, mikroglija može zaštititi neurone od oksidativnog oštećenja potičući dolazak kisika i hranjivih tvari u mozak. Ove stanice također igraju vrlo važnu ulogu u otporu kognitivnoj degeneraciji i neurodegeneraciji.

Ukratko, važnost mikroglije ne može se podcijeniti. Oni mogu zaštititi neurone i pomoći procesu učenja i pamćenja. Trebali bismo zaštititi i poboljšati broj i funkciju mikroglije što je više moguće kako bismo osigurali zdravlje i vitalnost našeg mozga. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer može regulirati i ravnotežu neurotransmitera, poput povećanja razine acetilkolina i faktora rasta koji su vrlo važni za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche također može poboljšati protok krvi i pospješiti opskrbu kisikom, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znati načine poboljšanja funkcije mozga

Iako je njihov broj relativno nizak, oni imaju važne funkcije održavanja homeostaze praćenjem prisutnosti infekcije tkiva i oštećenja u CNS-u.

Pod homeostatskim uvjetima, stanice mikroglije održavaju se u stanju mirovanja, ali neprestano skeniraju svoju okolinu. Kada se aktiviraju, ispoljavaju svoju fagocitnu aktivnost i mogu otpuštati upalne molekule kao što su citokini i kemokini.

Mikroglija može dobiti dva fenotipa, M1 (upalni tip) i M2 podtip (pro-regenerativni tip), ovisno o podražajima i može se prebacivati ​​između ova dva suprotna fenotipa [140], što predstavlja primjer njihove izuzetne plastičnosti.

Slično neuronima i drugim glijalnim stanicama, mikroglija oslobađa egzosome za komunikaciju sa susjednim stanicama i stanicama na daljinu. Bioaktivni teret egzosoma mikroglije ovisi o fenotipu mikroglije koja oslobađa, bilo proupalni ili proregenerativni. Mikroglijalni egzosomi sadrže sve enzime bitne za anaerobnu glikolizu i proizvodnju laktata.

Stoga se predlaže da bi laktat upakiran u egzosome mogao funkcionirati kao dodatni izvor energije za neurone tijekom sinaptičke aktivnosti [141]. Mikroglijalni egzosomi reguliraju sinaptički prijenos promicanjem proizvodnje ceramida i sfingolipida u neuronima.

Pojačani metabolizam sfingolipida pozitivno utječe na ekscitatornu neurotransmisiju predstavljajući novi način na koji mikroglija utječe na sinaptičku aktivnost [142]. Suočene s infekcijom i/ili ozljedom, mikroglijalne stanice brzo se uključuju u složeni upalni odgovor i stječu fenotip M1.

Mikroglija sada s proupalnim fenotipom (fenotip M1) otpušta egzosome koji pomažu u razvoju neuroupale. Dokazi o uključenosti mikroglijalnih egzosoma u neuroinflamaciju potječu iz studije provedene s lipopolisaharidima (LPS).

Izloženost mikroglije LPS-u, glavnoj komponenti Gram-negativnih bakterija, povećava otpuštanje egzosoma obogaćenih IL-1, proupalnim citokinom, i mikroRNA kao što su miR-155 i miR{{4} }. MikroRNA 155 je važna regulatorna mikroRNA u imunološkom sustavu i njezine povećane razine otkrivaju se kod upalnih bolesti [143].

U drugoj studiji, mikroglijalne stanice tretirane su LPS-om koji je povećao ekspresiju razina proteina N-myc gena 2 (NDRG2). Povećani NDRG2 protein zauzvrat je stimulirao mikrogliju da otpusti egzosome obogaćene miR-375. Internalizacija egzosoma obogaćenih miR-375 smanjila je vitalnost stanica N2A neurona što ukazuje na neurotoksičnu prirodu ovih egzosoma [144].

Čini se da izloženost LPS-u mijenja mikroRNA i proteine ​​pakirane u egzosome. Potvrdni dokaz došao je iz studije koja je uključivala stanice BV2. Stanice BV2 crnih miševa C57 su besmrtne stanice mikroglije. Kada su stanice BV2 bile izložene LPS-u, otpustile su egzosome bogate proupalnim citokinima IL-6 i TNF i proteinima povezanim s translacijom i transkripcijom.

Proteomski profil egzosoma analiziran spektrometrijom mase identificirao je 49 jedinstvenih proteina prisutnih u egzosomima LPS-tretiranih BV2 stanica u usporedbi s kontrolnim BV2 stanicama.

Ovdje je vrijedno napomenuti da su egzosomi iz mikroglije aktivirane LPS-om imali 58 proteina, dok su egzosomi iz kontrolnih BV2 stanica imali 37 proteina [145]. Prethodna rasprava pokazuje da su egzosomi mikroglije važni u olakšavanju neuroprotektivnih i neuroupalnih funkcija mikroglije u CNS-u.

4. Uloga egzosoma u neurodegenerativnim bolestima

Mnoge neurodegenerativne bolesti povezane su s nakupljanjem abnormalnih, pogrešno savijenih proteina što dovodi do progresivne neuralne i glijalne disfunkcije. Općenito, neurodegenerativne bolesti počinju s disfunkcijom u diskretnom području mozga.

Nakon oslobađanja u izvanstanični prostor, pogrešno savijeni proteini prenose se u zdrave stanice i počinju inducirati endogene protuproteine ​​da se pogrešno savijaju poput domino efekta [160].

Ovaj "infektivni" proces dovodi do pojačanja patologije i širenja bolesti na šira područja mozga. Međustanična komunikacija važna je u prijenosu i napredovanju neurodegenerativnih bolesti. Egzosomi koje oslobađaju sve stanice u mozgu postali su sastavni igrač u neuro-glija komunikacijama.

Sposobnost egzosoma da transportiraju i prenesu bioaktivni teret kao što su lipidi, RNA i proteini iz jedne stanice u drugu čini ih atraktivnim kandidatima kao posrednicima neurodegeneracije. U nastavku raspravljamo o utjecaju egzosoma na selektivne neurodegenerativne bolesti.

Alzheimerova bolest: Alzheimerova bolest je najčešći oblik neurodegenerativne demencije koju karakterizira progresivni gubitak pamćenja i kognitivnih sposobnosti.

Središnje mjesto u patologiji Alzheimerove bolesti je stvaranje izvanstaničnih nakupina -amiloida (A ) poznatih kao amiloidni plakovi u kombinaciji s neurofibrilarnim čvorovima tau. (A ) peptidi su izvedeni sekvencijalnim proteolitičkim procesiranjem amiloidnog prekursora proteina (APP) putem - i -sekretaze.

Kako je APP unutarstanični protein, formulirana je hipoteza da patološke lezije neurodegenerativne bolesti uključuju fizičko širenje krivo presavijenog proteina od neurona do neurona [161].

Međutim, mehanizam(i) za prijenos pogrešno savijenih proteina ostao je intrigantno pitanje. Jedno od najranijih izvješća koje je počelo rasvjetljavati moguće mehanizme kako se A izbacuje u izvanstanični prostor potječe iz studije koju su proveli Rajendran i kolege [162].

Dok su istraživali mjesto cijepanja APP-a, primijetili su da se cijepanje APP-a β-sekretazom događa u podskupu ranih endosoma s naknadnim prometom peptida A u multivezikularna tijela.

Mali dio peptida A povezanog s membranom egzosoma izlučen je u izvanstanični prostor. Egzosomi koji sadrže amiloidne plakove imali su eksosomalne markerske proteine, flotillin-1 i Alix. Prema tome, peptid A povezan s membranom egzosoma može predstavljati novi mehanizam koji pridonosi stvaranju amiloidnog plaka u izvanstaničnom prostoru [162].

Od ovog početnog opažanja, APP pune duljine i mnogi njegovi metaboliti te nekoliko članova obitelji sekretaza proteaza uključenih u obradu APP-a otkriveni su u egzosomima [163].

A može postojati u različitim konformacijskim stanjima koja imaju različita svojstva i međuprodukte stvaranja fibrila. Među njima, za A i protofibrile niske molekularne težine se smatra da su posebno neurotoksični i da djeluju kao klice za agregaciju proteina [164,165]. Pokazalo se da egzosomi izolirani iz postmortalnih mozgova pacijenata s Alzheimerovom bolešću imaju povećane razine A oligomera. Ti egzosomi su internalizirani kada su inkubirani s uzgojenim neuronima.

Što je najvažnije, uspjeli su proširiti A oligomere na druge neurone, uzrokujući citotoksičnost [166]. Početna zapažanja potvrđena su inkubacijom egzosoma koji sadrže APP s primarnim kulturama normalnih neurona in vitro [167] i in vivo [168].

Pitanje je zašto su A ili A oligomeri pakirani u egzosome? Osjećaju li neuroni toksičnu prirodu A ili A oligomera i stoga pokušavaju očistiti toksične proteine ​​iz intracelularno prisutnih A ili A oligomera sličnih transferin receptorima u retikulocitima [7,8]? Za razvrstavanje u MVB/egzosome potrebna je monoubikvitinacija. To postavlja drugo pitanje podvrgava li se A ubikvitinaciji da bi se razvrstao u MVB/egzosome. Amiloidni prekursorski protein (APP) ima pet lizinskih ostataka (Lys-724, Lys-725, Lys-726, Lys-751 i Lys-763) na svom C- završni kraj [169].

Ovi su ostaci mutirani pojedinačno ili u kombinaciji kako bi se ispitao učinak na procesiranje APP-a u obliku A peptida. Sveprisutnost APP-a na Lys-726 posredovana F-kutijom i leucinom bogatim ponovljenim proteinom2 (FBL2), komponentom E3 ubikvitin ligaze, smanjila je generaciju A [170]. S druge strane, ubikvitinacija APP-a na Lys-763 odvojila je APP u Golgijevom kompleksu i spriječila sazrijevanje APP-a [171].

Inhibicija ubikvitinacije supstitucijom svih pet lizinskih ostataka argininom u C-terminalnom fragmentu APP (C99) spriječila je učinkovitu degradaciju APP-a i nakupljanje proteina u strukturama s Golgijevim izgledom. To se pripisuje nedostatku razgradnje povezane s endoplazmatskim retikulumom. C99 se podvrgava cijepanju -sekretazom kako bi se proizveo A [172].

Mutacija tri lizinska ostatka (Lys-724, Lys-725 i Lys-726) istodobno je uzrokovala zadržavanje proteina u ograničavajućoj membrani endosoma umjesto da se internalizira u intraluminalne vezikule MVB [173]. ]. Kada je svih pet lizinskih ostataka mutirano kako bi se spriječila ubikvitinacija, protein se nije učinkovito razvrstao u MVB/egzosome, te je uočeno selektivno povećanje A 40 [174].

Ovaj nalaz je usporediv s prisutnošću A 40 u amiloidnim naslagama u cerebralnoj amiloidnoj angiopatiji [175]. Iako je evidentno da ubikvitinacija APP-a može usmjeriti protein na MVB/egzosome, potreban je izravan dokaz korištenjem neuronskih kultura ili in vivo modela kako bi se dokazalo da su APP, A ili A oligomeri monoubikvitinirani za njihovo ciljanje na MVB/egzosome i da nisu ubikvitinirani biti ciljana degradacija povezana s forendoplazmatskim retikulumom (ERAD).

Još jedno patološko obilježje Alzheimerove bolesti je abnormalno fosforilirani tau protein u neurofibrilarnim čvorovima (NFT). Tau je citoplazmatski protein za koji je poznato da stabilizira mikrotubule. Sve više dokaza sugerira da se patološki tau protein može širiti među stanicama, regrutirajući prirodni tau za stvaranje agregata. Noviji podaci upućuju na egzosome kao nositelje tau proteina [176,177].

Ispitivanje stanica pokazalo je da egzosomi uključeni u tau patologiju potječu iz mikroglijalnih stanica. Egzozomi iz mikroglije prenijeli su tauprotein u neurone. Kako bi se dobili eksperimentalni dokazi, provedene su studije u kojima je biogeneza egzosoma bila inhibirana ili su mikroglijalne stanice osiromašene tau. Rezultati ovih studija pokazali su slabljenje tau taloženja u normalnim neuronima [178].

Autori su sugerirali da mikroglija fagocitira citopatske neurone koji sadrže tau i recikliraju tau kroz egzosome, čime inkriminiraju egzosome u širenju Alzheimerove bolesti. U zdravim mozgovima nekoliko protein kinaza i fosfataza odgovorno je za fosforilaciju, odnosno defosforilaciju tau.

Disregulacija ovih važnih enzima može dovesti do abnormalnih uzoraka fosforilacije tau u AD. Nedavna studija uspoređivala je egzosomalni proteinski teret pomoću Nano-LC–MS/MS. Egzosomi su pročišćeni iz neurona pluripotentnih matičnih stanica (iPSC) izazvanih ljudima koji eksprimiraju AD obiteljski A246E mutantni oblik presenilina 1 (mPS1) i normalnih ljudskih iPSC neurona.

U obje skupine egzosoma identificirano je ukupno 1117 proteina, a 733 proteina bila su zajednička objema populacijama egzosoma. Među različito povezanim proteinima s mPS1 bile su fosfataze i protein kinaze, a njihove razine proteina povezane s egzosomima mPS1 bile su značajno niže u usporedbi s kontrolnim neuronima [179].

Nadalje, ovi egzosomi sadržavali su različite proteine ​​kojih nema u kontrolnim egzosomima. Konkretno, različiti proteini bili su oni koji sudjeluju u strukturi i funkciji izvanstaničnog matriksa što ukazuje na još jedan mehanizam za širenje patologije tau u AD [179]. Glavni naglasak istraživanja Alzheimerove bolesti bio je na neuronima.

Međutim, studije su otkrile da se atrofija astroglije javlja u ranim fazama neurodegenerativnog procesa. Nedostatak neuronske podrške od atrofirane astroglije rezultira prekidima sinaptičke povezanosti, gubitkom sinapsi i neravnotežom homeostaze neurotransmitera. U kasnijoj fazi Alzheimerove bolesti, astrociti i mikroglija se aktiviraju i otpuštaju upalne molekule i neurotoksične tvari. Neurotoksične kemikalije dovode do neuroupale i smrti neurona što dovodi do atrofije mozga [180].

U ranim stadijima Alzheimerove bolesti, mikroglijalne stanice aktivirane preko Toll-ovog receptora 4 poprimaju neuroprotektivnu ulogu i uklanjaju A [181]. Fagocitoza i razgradnja pročišćenih polimorfnih beta-amiloidnih proteinskih naslaga i A povezanih s egzosomima potvrđene su korištenjem kulture mikroglijalnih stanica [182,183]. Zanimljivo, čini se da astrociti oslobađaju mikroglijalne stanice njihove neuroprotektivne funkcije. Mediji i kolege primijetili su da je inkubacija s peptidom A aktivirala glijalne stanice i potom rezultirala upalom [184].

Zajedničko uzgoj s astrocitima ili uzgoj u astrocitima uvjetovanom mediju inhibiranom fagocitnom akcijom mikroglije. Inhibicija mikroglijalne fagocitoze bila je vrlo specifična budući da kondicionirani medij iz fibroblasta nije utjecao na mikroglijalnu fagocitnu aktivnost. Iz ovih studija vidljivo je da su astrociti otpuštali signale u obliku topivih faktora koji su ometali fagocitnu aktivnost mikroglije [182]. Uloge astrocita i mikroglije mogu se obrnuti nakon kronične stimulacije mikroglije.

Nekoliko neovisnih studija dovodi do zaključka da egzosomi koje otpuštaju neuroni, astrociti i mikroglija djeluju kao čistači i upijaju topljivi A bez sjemena kako bi pospješili agregaciju A koju mikroglija internalizira za razgradnju [185-187]. Ovo opažanje nije iznenađujuće s obzirom na pomno praćenu međustaničnu komunikaciju među moždanim stanicama (o čemu se ukratko govori u odjeljku 3).

Kao što je ranije spomenuto, A agregati stupaju u interakciju s glikosfingolipidima, ceramidom i/ili GPI-usidrenim proteinom PrPc (stanični prionprotein) prisutnim na površini egzosoma i na neuronima [185,187]. Neuronski egzosomi veza A agregiraju se učinkovitije u usporedbi s astrocitnim ili mikroglijalnim egzosomima zbog obilno prisutnog gangliozida GM1 i sijaliranog glikosfingolipida posebno trisialogangliozida GT1 na njihovoj površini [188-190]. Astrocitni egzosomi obogaćeni su sfingolipidnim ceramidom [187].

Neuroni internaliziraju A agregate vezane za astrocitne egzosome i usmjeravaju ih u mitohondrije, uzrokujući grupiranje mitohondrija i istovremeno povećavajući razine proteina fisije Drp-1. Na vanjskoj membrani mitohondrija, egzosom A tvori kompleks s ADP/ATP transporterom, anionskim kanalom 1 ovisnim o naponu, i aktivira kaspaze.

Aktivne kaspaze induciraju fragmentaciju neurita i konačno smrt neuronskih stanica [191]. Za bolje razumijevanje mogućih dinamičkih interakcija između proteina, lipida i RNA u Alzheimerovoj bolesti, nedavno su primijenjene tehnike visoke propusnosti. Cohn i kolege zauzeli su 'omički' integrativni pristup za analizu mikroglijalnih egzosoma [192].

U ovoj studiji autori su izolirali mikroglijalne egzosome iz parijetalnog korteksa pacijenata u kasnom stadiju Alzheimerove bolesti. Izveli su integrativnu analizu kombinirajući proteomsku, transkriptomsku i lipidomsku analizu. Koristili su proteomiku sačmarice, koja se odnosi na analizu proteina odozdo prema gore, gdje su proteini karakterizirani analizom peptida koji se oslobađaju iz proteina kroz proteolizu [193], ciljanu lipidomiku i tehnologiju NanoStringnCounter, tehnologiju hibridizacije multipleksne nukleinske kiseline [194].

Koristeći ovaj kombinatorni pristup, istraživačka skupina pokazala je značajno smanjenje markera homeostatske mikroglije P2RY12 i TMEM119 i povećane razine markera mikroglije FTH1 i TREM2 povezanih s bolešću. Osim toga, razine tau proteina u mikroglijalnim egzosomima izvedenim iz AD mozga bile su značajno više što sugerira da se egzosomi izvedeni iz mikroglije čine važnima u širenju patologije tau.

Sinaptički i neuronski specifični proteini također su različito obogaćeni u mikroglijalnim egzosomima AD mozga. Autori su, međutim, pretpostavili da su sinaptički i mijelinski specifični proteini bili fagocitirani prije ulaska u mikroglijalne egzosome. Lipidomske analize otkrile su proupalni fenotip i potencijalni defekt u remodeliranju acilnog lanca.

Na kraju, miRNA povezana s signalnim putovima imunološkog i staničnog starenja povećana je u mikroglijalnim egzosomima AD mozga [192]. Ovi podaci sugeriraju da značajna promjena u molekularnom sastavu egzosoma odražava promjene u mikrogliji u skladu sa stanjem bolesti. Prikupili smo veliku količinu podataka koji impliciraju egzosome u Alzheimerovoj bolesti.

Važno je pitanje u kojoj mjeri egzosomi potiču ili sprječavaju uklanjanje krivo smotanih proteina? Dodatno, razjašnjavanje doprinosa egzosoma otpuštenih iz različitih moždanih stanica dodatno će promicati naše razumijevanje prijenosa bolesti.

Parkinsonova bolest: Parkinsonova bolest jedan je od najčešćih poremećaja mozga povezanih sa starenjem - prvenstveno se smatra poremećajem kretanja, s tipičnim simptomima tremora u mirovanju, rigidnosti, bradikinezije i motoričke nestabilnosti [195].

Uz ovu bolest dodatno su povezani kognitivni pad, depresija i psihoza [196]. Patološki, karakterizirana je degeneracijom nigrostriatalnih dopaminergičkih neurona i prisutnošću Lewyjevih tijela koja sadrže krivo presavijeni -sinukleinski protein u preživjelim neuronima. Alfa-sinuklein otkriven u mnogim tjelesnim tekućinama uključujući cerebrospinalnu tekućinu i plazmu [197,198].

Alfa-sinuklein se nalazi u mediju kulture kada se stanice koje eksprimiraju -sinuklein uzgajaju in vitro [199]. Uzimajući u obzir da je -sinuklein detektiran izvanstanično u nedostatku izvanstaničnog signala za razvrstavanje, kako ovaj protein dospijeva u izvanstanični prostor? Nekoliko je istraživača ispitalo mehanizam izlučivanja -sinukleina uključujući ulogu egzosoma u izlučivanju -sinukleina i patologiju.

Prva naznaka da bi egzosomi doista mogli biti uključeni u patogenezu došla je iz in vitro studije u kojoj su korištene SH-SY5Y stanice koje izražavaju -sinuklein. Autori su pokazali izvanstanično izlučivanje -sinukleina putem egzosoma na način ovisan o kalciju i sugerirali njihovu uključenost u širenje patologije Parkinsonove bolesti [200].

Nakon ove studije, egzosomi koji sadrže -sinuklein identificirani su iz različitih stanica, cerebrospinalne tekućine i plazme pacijenata s Parkinsonovom bolešću [201-203]. Međutim, postoji mnogo varijabilnosti prijavljenih u različitim studijama [204]. Zanimljivo je da je količina -sinukleina u egzosomima relativno niska u usporedbi sa slobodnim -sinukleinom otkrivenim u cerebrospinalnoj tekućini ili kondicioniranom mediju.

Pomno ispitivanje otkrilo je da stanice neuroglioma koje eksprimiraju -sinuklein koriste dva puta za oslobađanje oligomera -sinukleina, jedan kroz egzosome i drugi, izravno otpuštanje slobodnog -sinukleina kao oligomera [205].

Iako egzosomi imaju niske razine -sinukleina, egzosomi su učinkovitiji u ispoljavanju svojih toksičnih učinaka od slobodnog -sinukleina. Alfa-sinukleinske oligomere prisutne u egzosomima učinkovitije su internalizirale ljudske H4 neurogliomske stanice u usporedbi sa slobodnim -sinukleinskim oligomerima [205].

Kao nastavak ove studije, ova skupina istraživača izvijestila je o sličnim rezultatima koristeći egzosome pročišćene iz cerebrospinalne tekućine pacijenata s Parkinsonovom bolešću. Učinkovito preuzimanje egzosomalnog oligomeriziranog -sinukleina primijećeno je u kulturama stanica humanog H4 neuroglioma u usporedbi sa slobodnim -sinukleinskim oligomerima [206].

Dokazi za izlučivanje slobodnog -sinukleina u izvanstanični prostor ili tekućinu došli su iz studije koja je ispitivala ulogu vakuolarnog sortiranja proteina 4 (VPS4) u učitavanju -sinukleina u multivisikularna tijela. Normalno, VPS4 regulira razvrstavanje proteina u multivezikularna tijela. U Parkinsonovoj bolesti, VPS4 usmjerava -sinuklein u lizosome za njegovu razgradnju i recikliranje endosoma za izvanstanično izlučivanje -sinukleina [207].

Kada je funkcija lizosoma bila inhibirana, uočeno je da oslobađanje -sinukleina upakiranog u egzosome povećava inkulturirane SH-SY5Y stanice [208]. Endosomska frakcija -sinukleina izbjegava razgradnju u uvjetima lizosomskog oštećenja [209].

For more information:1950477648nn@gmail.com