Simultana stabilizacija aktinskog citoskeleta u više stanica specifičnih za nefron štiti bubreg od različitih ozljeda

Kronične bolesti bubregaiakutna ozljeda bubregasu mehaničkirazličite bolesti bubrega. Dok su kronične bolesti bubrega povezane sozljeda podocita, akutna ozljeda bubregautječe na epitelne stanice bubrežnih tubula. Unatoč ovim razlikama,kardinalna značajkaod obojeakutne i kronične bolesti bubregaje neregulirani aktinski citoskelet. To smo pokazalifarmakološka aktivacija dinamina GTPazeublažava ozljede podocita umišji modeli kroničnih bubrežnih bolestipopoticanje polimerizacije aktina. Ovdje utvrđujemo ulogu dinamina u modulaciji krutosti i polaritetaepitelne stanice bubrežnih tubulaumrežavanjem aktinskih filamenata u razgranate mreže. Aktivacija dinaminove sposobnosti umrežavanja pomoću agonista malih molekula stabilizira aktomiozinski korteks apikalne membrane protiv ozljeda, koje zauzvratčuva funkciju bubregau različitim mišjim modelima akutne ozljede bubrega. Naime, agonist dinamina istovremeno slabi podocite itubularna ozljedau genetskom mišjem modelu Alportovog sindroma. Naša studija pruža dokaze o izvedivosti i naglašavaprednosti novih holističkih terapija za zaštitu nefrona.

KLIKNITE OVDJE ZA UPOZNAVANJE S BILJNOM FORMULACIJOM CISTANCHE KOJA JE DOBRA KOD AKUTNE OZLJEDE BUBREGA

Thevodeći uzroci akutne ozljede bubrega(AKI) suishemija, hipoksija, ilinefrotoksičnost1. Iako se može poništiti, AKI predstavlja značajan zdravstveni problem s visokom smrtnošću i bez konačnog liječenja. Bez obzira na etiologiju, AKI primarno ozljeđuje polarizirane epitelne stanice bubrežnih tubula čiji apikalni mikrovili tvore tubularnu četkastu granicu koja sudjeluje u koordinaciji prijenosa esencijalnog elektrolita i vode2. Rana morfološka značajka AKI je gubitak četkastog ruba i polariteta stanica zbog razgradnje aktomiozinskog korteksa na apeksnoj membrani1.

Uspostava i održavanje polariteta stanica uključuje signalne kaskade, promet membranom i dinamiku citoskeleta, a sve je vrlo koordinirano3. Organizacija apikalne membrane uvelike je određena arhitekturom aktomiozinskih mreža4, ​​koje uspostavljaju krutost korteksa, čime se olakšava grupiranje proteina polariteta. Dok se miozin II motori smatraju primarnim generatorom kortikalne krutosti5,6, arhitektura aktomiozinskog korteksa uspostavljena je mnoštvom proteina koji vežu aktin (ABP)7.

Uz poznate ABP-ove, četkasti rub bubrežnih tubula visoko je obogaćen dinaminom8, GTPazom najpoznatijom po svojoj ulozi u endocitozi9. Dynamin ima intrinzičnu sklonost sklapanju u višestruka oligomerizacijska stanja kao što su dimeri, tetrameri, prstenovi i spirale9. Po prvi smo put identificirali izravne interakcije dinamina i aktina10 i pokazali da oligomerizacija dinamina regulira polimerizaciju aktina u podocitima11,12, specijaliziranim stanicama bitnim za selektivnost bubrežnog filtra. Koristeći mišje modele CKD-a, pokazali smo da aktivacija polimerizacije aktina ovisne o dinaminu poništava ozljedu podocita vraćanjem njihove jedinstvene strukture i funkcije12.

Ovdje to prikazujemo uepitelne stanice bubrežnih tubula, dinamin povezuje filamentozni aktin (F-aktin) u razgranate mreže. Dynaminova sposobnost unakrsnog povezivanja definirana je njegovim stanjem oligomerizacije i duljinom F-aktina. Farmakološka aktivacija dinaminske oligomerizacije suzbija AKI stabiliziranjem aktinskih mreža, a time i cjelovitosti stanica, što djelomično štiti epitelne stanice bubrega od ozljeda izazvanih oksidativnim stresom. Naša studija identificira aktomiozinski korteks apikalne membrane stanica bubrežnih tubula kao metu koja se može liječiti u AKI preko dinamina kao posrednika

Rezultati Dynamin oligomerizacija utvrđuje krutost i morfologiju apikalne membrane.

Kako bismo ispitali ulogu interakcija dinamina i aktina u polariziranim epitelnim stanicama bubrežnih tubula, upotrijebili smo Bis-T-23, alosterički aktivator oligomerizacije dinamina ovisne o aktinu u rekonstituiranom sustavu13, u stanicama11,13 i u cijeli organizam12. Stanični fenotipovi procijenjeni su u stanicama Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) praćenjem statusa F-aktina i uzorka bojenja proteina uskog spoja zonula occludens-1 (ZO-1), koji je smatra biomarkerom polariteta stanica. Citohalazin D (CytoD) i latrunculin A (LatA), poznati inhibitori polimerizacije aktina, smanjili su razine F-aktina i izazvali diskontinuirano bojenje ZO-1 (dodatna slika 1a). Nasuprot tome, Bis-T-23 je izazvao blago povećanje razine F-aktina bez ikakvog učinka na bojenje ZO-1. Dodavanje Bis-T-23 prije, ali ne i nakon LatA, djelomično je očuvalo razine F-aktina i polaritet stanica. Niti DMSO vehikulum niti inhibitor dinamina dynole14 nisu pokazali nikakav učinak (dodatna slika 1a).

Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) omogućila nam je vizualizaciju promjena morfologije stanica izazvanih lijekovima s fokusom na apikalnu membranu (Slika 1a). Prosječna visina MDCK stanica bila je 11 ± 2 µm, a prosječna duljina mikrovila 0.63 ± 0.2 µm (tablica 1), što je unutar raspona uočenog u bubregu15. LatA je smanjio visinu stanica i duljinu mikrovila i pomaknuo ravnomjerno raspoređene mikrovile u klastere, dok je Bis-T-23 izazvao suprotne učinke (Tablica 1, Slika 1a). Kada se doda prije LatA, Bis-T-23 djelomično je sačuvao visinu stanice i duljinu mikrovila. Budući da mikrovili pokazuju izvrsnu kontrolu duljine definiranu kortikalnim aktinom na njihovoj bazi16, ovi podaci pružaju dokaz da je Bis-T-23 modificirao korteks aktomiozina na apikalnoj membrani.

Kako bismo odredili točan učinak koji je Bis-T-23 imao na kortikalni aktin, vizualizirali smo korteks aktomiozina unutar lamelipodija pomoću elektronske mikroskopije replike platine (PR-EM). LatA je smanjio gustoću aktinskih mreža, a taj je učinak djelomično poništen dodatkom Bis-T-23 prije LatA (Slika 1b). Kako LatA ubrzava depolimerizaciju aktinskog filamenta izdvajanjem aktinskih monomera, zatim smo ispitali je li uočeno očuvanje aktomiozinskog korteksa pomoću Bis-T-23 posljedica njegovog pozitivnog učinka na polimerizaciju aktina. Za razliku od snažne stimulacije polimerizacije aktina opažene u ekstraktima stanica podocita10,11, Bis-T-23 samo je marginalno povećao polimerizaciju aktina u ekstraktu stanica MDCK (dodatna slika 1b). Slično, imunodeplecija endogenog dinamina-2 (Dyn2) iz ekstrakta ili inhibicija njegove aktivnosti GTPaze pomoću dinoda rezultirala je marginalnim oštećenjem polimerizacije aktina (dodatna slika 1c). Dok su LatA i CytoD značajno oslabili polimerizaciju aktina, dodatak Bis-T-23 prije LatA ili CytoD nije uspio prevladati njihove inhibicijske učinke (dodatna slika 1d, e). Jasplakinolid, lijek koji inducira polimerizaciju aktina stimuliranjem nukleacije aktinskog filamenta17, nije značajno povećao ukupnu razinu polimerizacije (dopunska slika 1d), što sugerira da lizat stanica MDCK pokazuje gotovo maksimalnu razinu polimeriziranog aktina. Zajedno, ovi podaci pokazuju da su učinci Bis-T-23 na morfologiju apikalne membrane u MDCK stanicama vođeni mehanizmom koji nije polimerizacija aktina.

S obzirom na opće znanje o obogaćenoj lokalizaciji Dyn2 i F-aktina na četkastom rubu bubrežnih epitelnih stanica8 i ulozi dinamina u endocitozi, zatim smo istražili utječe li Bis-T-23 na aktin neizravno putem promjena u endocitozi. Kao što se očekivalo, i Dyn2 i F-aktin su lokalizirani u aktomiozinskom korteksu ispod apikalne membrane, unutar mikrovila i u jamama obloženim klatrinom (CCP), definiranim njihovim posebnim oblikom i veličinom (dodatna slika 1f). Ispitali smo dinamiku CCP-a pomoću mikroskopije fluorescencije totalne unutarnje refleksije (TIRF)18,19. Bis-T-23, čak i pri najvišoj koncentraciji, nije imao utjecaja na distribuciju vijeka trajanja CCP-a, dok je dinol smanjio broj produktivnih CCP-a (dodatna slika 1g). Ovaj nedostatak korelacije između razine endocitoze i promjena u staničnoj morfologiji potvrđuje da Bis-T- 23 cilja na kortikalni aktin bez utjecaja na ulogu dinamina u endocitozi.

Budući da se polaritet bubrežnih stanica održava arhitekturom i trajnom kontrakcijom aktomiozinskih mreža, što uspostavlja krutost stanice na apikalnoj membrani20, zatim smo izmjerili krutost stanice pomoću mikroskopije atomske sile (AFM). Sustav Nanowizard IV i softver za analizu JPK korišteni su za određivanje promjena u Youngovom modulu21 pod različitim eksperimentalnim postavkama (dopunska slika 2a). Liječenje s LatA rezultiralo je značajnim smanjenjem krutosti kontakta između stanica i krutosti apikalne stanice u MDCK stanicama (Slika 1c–e). Nasuprot tome, Bis-T-23 značajno je povećao krutost stanice u usporedbi s DMSO nosačem (Slika 1c–e), u skladu s njegovim pozitivnim učincima na visinu stanice, broj mikrovila i gustoću aktinskih mreža (Tablica 1 i Slika 1b)22. Dodavanje Bis-T-23 prije LatA snažno je smanjilo negativan učinak LatA na krutost stanice (Slika 1c–e), u skladu s pozitivnim učinkom Bis-T-23 na aktinske mreže i morfologiju apikalne stanice (Tablica 1, Slika 1b).

Slika 1 Dynamin oligomerizacija definira krutost stanica utječući na arhitekturu aktina u stanicama bubrežnog epitela. a Reprezentativne SEM slike MDCK stanica tretiranih s DMSO (0.1%) ili Bis-T-23 (30 µM, 0.1% DMSO) za 1 0 min prije dodavanja DMSO (0.1%) ili LatA (0.2 µM, 0.1% DMSO) za 2{{23} } min. Uvećane slike umetaka (područja s narančastim okvirom) pokazuju raspored, distribuciju i gustoću mikrovila na apikalnoj membrani. b Reprezentativne PR-EM slike MDCK stanica tretiranih kako je objašnjeno u (a). Slike pokazuju promjene u organizaciji aktomiozinskog korteksa u MDCK stanicama pod navedenim uvjetima. c Reprezentativne slike mapa Youngovog modula MDCK stanica tretiranih kako je objašnjeno u (a). d, e Stupčasti dijagrami koji predstavljaju Youngov modul koji prikazuje krutost stanice izmjerenu na spoju stanica-stanica (d) ili na apikalnoj membrani (e). Svaki simbol predstavlja prosječnu krutost jedne ćelije. Rezultati prikazani u d, e generirani su iz najmanje 10 stanica iz najmanje tri posude s kulturama. Trake pogrešaka, srednja vrijednost ± SD (*P Manje ili jednako 0,05, **P Manje ili jednako 0,01, ***P Manje ili jednako 0,001, ****P Manje ili jednako 0,0001, neupareno dvostrani t-test). ns, nije značajno.

Također smo odredili krutost stanica koristeći sustav BioScope II kao alternativni eksperimentalni pristup za AFM. U ovom slučaju, krivulje sile utiskivanja dobivene su prema modelu Dischera i suradnika izračunatom pomoću softvera Matlab23. Slični trendovi s obzirom na krutost stanica zabilježeni su za međuigru između LatA i Bis-T-23 (dodatna slika 2b, 2c). Osim toga, dynode nije pokazao nikakav učinak na krutost stanice, dok je CytoD značajno smanjio krutost stanice (dopunska slika 2d, e), u skladu s njihovim fenotipovima aktina (dopunska slika 1a). Zajedno, ovi podaci uspostavljaju korelaciju između statusa aktomiozinskog korteksa, krutosti stanice, morfologije apikalne membrane i polariteta stanice. Ovi nalazi također uvjerljivo pokazuju ulogu dinaminske oligomerizacije u definiranju mehaničkih parametara polariteta epitelnih stanica putem njegovog učinka na korteks aktomiozina

Dynamin poprečno povezuje aktinske filamente u razgranate mreže koje su u osnovi polariteta stanica. Kako bismo razjasnili molekularni mehanizam kojim oligomerizacija dinamina utječe na arhitekturu aktomiozinskog korteksa, zatim smo ispitali učinak dinamina na aktinske filamente u rekonstruiranom sustavu. Na temelju trenutne hipoteze, duljina aktinskih filamenata definira njihov način unakrsnog povezivanja6. Kako je prosječna duljina kortikalnih aktinskih filamenata unutar mreže na vodećem rubu između 100 i 150 nm24, ispitali smo učinke dinamina na organizaciju kraćih filamenata generiranih zatvaranjem F-aktina gelsolinom (Gsn-aktin) (Sl. 2a). Dodatak Dyn2 rezultirao je stvaranjem velikih, razgranatih mreža (Sl. 2b, c). Na temelju veličina i oblika rekombinantnog Dyn2 (Slika 2d), mreže su pretežno formirane Dyn2 dimerima (Dyn2DIMER) i tetramerima (Dyn2TETRA) koji su bili u interakciji s nekoliko aktinskih filamenata (Slika 2e): Dyn2DIMER je vezan na dva filamenta, Dyn2TETRA vezao je do četiri filamenta, a Dyn2RING je povezao do šest filamenata. Malo povećanje slika otkrilo je da mreže ovisne o dinaminu tvore uzorak manjih i većih prstenastih oblika (slika 2c).

Kako bismo povezali opažanja iz rekonstituiranog sustava s ulogom dinamina u stanicama, zatim smo odredili lokalizaciju endogenog Dyn2 na kortikalnim aktinskim mrežama korištenjem monoklonskog anti-Dyn2 protutijela praćenog zlatom konjugiranog sekundarnog protutijela (Dopunska slika 3a–c). Kao što se vidi u rekonstituiranom sustavu, dinamin je povezan s različitim brojem F-aktina unutar razgranatih mreža (slika 2f). Zajedno, ovi podaci identificiraju novu aktivnost dinamina, koja je unakrsno povezivanje F-aktina u razgranate mreže.

Kako bismo doveli u korelaciju sposobnost umrežavanja dinamina i zaštitni učinak Bis-T-23 na korteks aktomiozina i morfologiju apikalne membrane, zatim smo ispitali učinke Bis-T-23 na posredovane dinaminom mreže u rekonstruiranim sustavima (slika 3a). Na temelju konturnih dijagrama, koji daju topografske prikaze različitih gustoća filamenata, Bis T-23 je povećao ukupnu gustoću mreže (Sl. 3a), što se može objasniti povećanjem broja F-aktina vezanog na dinamin zbog povećanje njegove oligomerizacije. Osim toga, dynamin jače umrežuje kraće filamente nego dugi F-aktin (Slika 3a-c), što sugerira da je sposobnost dynamina da formira razgranate mreže definirana njegovim statusom oligomerizacije i duljinom aktinskih filamenata. Sposobnost unakrsnog povezivanja aktinskih filamenata u mreže dijelile su dvije izoforme dinamina, sveprisutno eksprimirani Dyn2 i neuronski specifični dinamin-1 (Dyn1) (Slika 3b, c).

Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Dućan:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop