Simulirana mikrogravitacija utječe na biomarkere povezane s imunitetom kod raka pluća
Aug 10, 2023
Sažetak: Mikrogravitacija je nova strategija koja može poslužiti kao komplementarni alat za razvoj budućih terapija raka. Kod raka pluća dobro se govori o utjecaju mikrogravitacije na stanične procese i migracijsku sposobnost stanica. Međutim, njegov učinak na mehanizme koji pokreću progresiju raka pluća još je u povojima. U ovoj studiji pokazalo se da je 13 različito izraženih gena povezano s prognozom raka pluća pod simuliranom mikrogravitacijom (SMG). Korištenjem analize obogaćivanja skupa gena, ti su geni obogaćeni putevima humoralne imunosti. Umjesto toga, alveolarne bazalno-epitelne (A549) stanice bile su izložene SMG-u putem 2D klinostatskog sustava in vitro. Uz promjenu morfologije i smanjenje stope proliferacije, SMG je vratio fenotip prijelaza epitela u mezenhim (EMT) A549, ključnog mehanizma u progresiji raka. To je dokazano povećanom ekspresijom epitelnog E-kadherina i smanjenom ekspresijom mezenhimalnog N-kadherina, čime se pokazuje manje metastatsko stanje. Zanimljivo je da smo primijetili povećanu ekspresiju FCGBP, BPIFB, F5, CST1 i CFB i njihovu korelaciju s EMT pod SMG-om, što ih čini potencijalnim tumor supresorskim biomarkerima. Zajedno, ovi nalazi otkrivaju nove mogućnosti za uspostavljanje novih terapijskih strategija za liječenje raka pluća.
Ključne riječi: simulirana mikrogravitacija; EMT; rak pluća; metastaza; supresor tumora; biomarker
Učinci biljke Cistanche - Antitumorski
1. Uvod
Svemir je poznat po tome što nema vektor gravitacije, koji utječe na tijelo na razini organa, tkiva i stanica. Mikrogravitacija, stanje prividne bestežinskog stanja, značajan je svemirski stresor za koji se zna da značajno utječe na ljudsko zdravlje, kao što je gubitak koštane mase, atrofija mišića i dekondicioniranje srca [1,2]. Utjecaj mikrogravitacije na stanice raka također je sve veća žarišna točka interesa u istraživanju svemira i raka. Dokazano je da mikrogravitacija potiskuje aktivnost imunoloških stanica i remeti sustave više tijela, što može povećati rizik od razvoja raka [2-4]. Zbog ovih očitih zdravstvenih problema, mikrogravitacijsko okruženje omogućilo je istraživačima proučavanje biofizičkih mehanizama na koje utječe mikrogravitacija i pomoglo u otkrivanju terapeutika za neurodegenerativne poremećaje, imunoterapije i potencijalno boljih i ciljanijih terapija protiv raka [4-6]. Brojne su studije dobro dokumentirale i pregledale velike implikacije koje mikrogravitacija ima na staničnu progresiju, proliferaciju i apoptozu u bezbrojnim tumorskim staničnim linijama, uključujući rak pluća [7-12]. Međutim, pokazalo se da mnoge druge studije koje uključuju mikrogravitaciju induciraju promjene u ekspresiji gena koji su uključeni u proliferaciju stanica raka, metastaze i preživljavanje, pomičući stanice prema manje agresivnom fenotipu [13,14]. Ovo bi moglo rasvijetliti nova razumijevanja biologije i dijagnoze tumora, ističući mikrogravitaciju kao inovativni alat za otkrivanje novih ciljeva u nadi da će se razviti novi istraživački pristupi i poboljšati terapeutske strategije. Rak pluća, s karcinomom pluća nemalih stanica (NSCLC) kao najistaknutijom vrstom, vodeći je uzrok smrti, čini 12% svih karcinoma i najčešće je dijagnosticiran rak [15]. U studijama koje uključuju mikrogravitaciju, koje bi nas mogle voditi ka boljem razumijevanju karcinogenog procesa, pokazalo se da stanice raka pluća gube stabljiku nakon izlaganja mikrogravitaciji, što utječe na rast i funkciju stanica raka [11]. Studija Ahna i sur. pokazalo je da izlaganje stanica raka pluća (A549) mikrogravitaciji izaziva brzu migraciju i proliferaciju. To je objašnjeno povišenim razinama matričnih metaloproteaza (MMP-2 i MMP-9) pod mikrogravitacijom, čime igraju ključnu ulogu u invaziji i migraciji raka [10]. U drugoj studiji, Chung i sur. otkrili su da simulirana mikrogravitacija nije značajno utjecala na proliferaciju stanica raka pluća, već je povećala migraciju u usporedbi s kontrolnom skupinom pod normalnom gravitacijom [16]. Naprotiv, Chang i sur. pokazalo je smanjenje migracije stanične linije raka pluća A549 nakon 24 sata izlaganja uvjetima mikrogravitacije [17]. Unatoč značajnim učincima mikrogravitacije na ponašanje stanica, što uključuje apoptozu, migraciju i invazivnost, njezin učinak na rak pluća tek treba u potpunosti razjasniti. Dobro je utvrđeno da epitelne stanice prolaze kroz nekoliko biokemijskih promjena kako bi uspostavile mezenhimalni fenotip koji povećava otpornost na apoptozu, invazivnost i migracijske sposobnosti. Takav biološki proces poznat je kao prijelaz epitela u mezenhim (EMT), obilježje progresije raka [18]. Odnos EMT-a i progresije raka dobro je raspravljen. Poznato je da tumori aktiviraju EMT pojačanom regulacijom faktora transkripcije, ekspresijom proteina na površini stanice i proizvodnjom enzima koji razgrađuju ECM. Nakon što se EMT aktivira, tumorske stanice gube svoju stanično-staničnu adheziju i poprimaju migratorna i invazivna svojstva [19]. Samo su dvije studije pokazale da simulirana mikrogravitacija izaziva prolaznu tranziciju epitela u mezenhim (EMT) u keratinocitima [9]. Osim toga, takvi su fenomeni istaknuti u MCF-7 stanicama i HUVEC [20]; međutim, niti jedna studija nije usmjerena na učinak mikrogravitacije na EMT kod raka pluća. Unatoč mnogim ključnim otkrićima o sposobnosti mikrogravitacije da modulira tumorogene i metastatske procese raka, točni mehanizmi potaknuti mikrogravitacijskim gradom ostaju relativno nepoznati, što otvara pitanja u vezi s adaptivnim promjenama koje se događaju na molekularnoj razini. U ovoj studiji identificirali smo potpis gena povezanih s imunološkim sustavom (FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1) koji su značajno pokazali povećanu ekspresiju mRNA u stanicama A549 pod učinkom simulirane mikrogravitacije (SMG). Osim toga, procijenili smo doprinos SMG-a u progresiji raka A549 putem EMT regulacije. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1 i njihova korelacija s ključnim markerima EMT-a pokazali su potencijalno manje metastatski fenotip raka pluća pod SMG-om. Nalazi ove studije daju osnovu za buduća istraživanja koja su potrebna za identificiranje temeljnih mehanizama, koji će razviti naše razumijevanje i pomoći u razvoju novih terapijskih strategija za liječenje raka pluća.
Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor
2. Rezultati
2.1. Najčešći diferencijalno eksprimirani geni identificirani u stanicama raka pluća pod simuliranom mikrogravitacijom (SMG) u usporedbi s prizemnom gravitacijom (GG)
Kako bismo identificirali gene uključene u rak pluća pod simuliranom mikrogravitacijom (SMG), prvo smo istražili gene koji su različito izraženi pod SMG u usporedbi s prizemnom gravitacijom (GG) za ljudski rak pluća koristeći javno dostupnu Gene Expression Omnibus (GEO) bazu podataka. Odabrana su dva skupa podataka, GSE78210 i GSE36931, koji uključuju ekspresiju gena za dvije različite stanične linije ljudskog raka pluća, A549 i Colo699, uzgojene u 2D i 3D uvjetima kulture stanica. Razlike u profilima genetske ekspresije između SMG i GG uzoraka prikazane su u grafikonima vulkana (Slika 1). Identificirani različito eksprimirani geni (DEG; Slika 2) za svaki skup podataka podijeljeni su na one koji su regulirani u raku pluća (21 gen u A549 i 29 gena u Colo699 skupa podataka GSE78210 i 47 gena u skupu podataka A549 GSE36931) i one koji su smanjeno regulirani I rak pluća (40 gena u A549 i 27 gena Colo699 iz GSE78210 skupa podataka i 87 gena u A549 iz GSE36931 skupa podataka), kao što je prikazano u tablici 1. Trinaest DEG-ova bilo je značajno visoko eksprimirano u A549 stanicama iz skupova podataka GSE78210 i GSE36931 u SMG u usporedbi s GG stanjem. Najčešći geni identificirani su pomoću web alata InteractiVienn (Slika 2A). Geni kandidati uključuju AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP i BPIFA1. Kako bi se utvrdilo jesu li identificirani DEG uključeni u uobičajene putove, geni kandidati su učitani na Metascape (http://metascape.org; pristupljeno 11. studenog 2021.). Zanimljivo je da su ti geni obogaćeni putevima koji uključuju humoralni imunološki odgovor i reguliranu egzocitozu (Slika 2B).
Slika 1. Dijagram vulkana koji prikazuje različito izražene gene (DEG) korištenjem GEO Omnibusa. (A) Dijagram vulkana koji prikazuje DEG pod efektima SMG i GG u stanicama A549 korištenjem skupova podataka (A) GSE78210 i (B) GSE36931. (C) Dijagram vulkana koji prikazuje DEG pod efektima SMG i GG u staničnoj liniji Colo699 korištenjem skupa podataka GSE78210. Crvena boja označava gene s pojačanom regulacijom, dok plava boja označava gene s niskom regulacijom.
Tablica 1. Ukupni geni koji su različito eksprimirani na SMG u usporedbi s GG u staničnim linijama raka pluća A549 i Colo699. Svaki skup podataka imao je promjene nabora prilagođene za izdvajanje prvih 5% DEG-ova. Za GSE36931, promjena nabora (FC) je prilagođena tako da uključuje samo gene s FC većim ili jednakim 4 ili manjim ili jednakim -4. Za GSE78210, FC je prilagođen tako da uključuje samo gene s FC većim ili jednakim 3 ili manjim ili jednakim -3.
Slika 2. Trinaest zajedničkih DEG između skupova podataka GSE78210 i GSE36931 kod raka pluća. (A) Vennov dijagram koji prikazuje 134 DEG u GSE36931 (stanična linija A549), 61 DEG u GSE78210 (stanična linija A549) i 56 DEG u GSE78210 (stanična linija Colo699) pod SMG uvjetima u usporedbi s GG. Od ukupno identificiranih 251 gena, za 13 DEG je utvrđeno da su zajednički između dva skupa podataka, GSE78210 i GSE36931, u staničnoj liniji A549. Vennov dijagram generiran je korištenjem InteractiVinna.
2.2. Diferencijalno izraženi geni u korelaciji s kliničkom prognozom bolesnika s adenokarcinomom pluća
Diferencijalno izraženi geni u korelaciji s kliničkom prognozom pacijenata s adenokarcinomom pluća Za procjenu kliničke prognostičke vrijednosti gena kandidata na pacijentima s adenokarcinomom pluća, Kaplan–Meierov crtač (http://www.kmplot.com/; pristupljeno 11. studenoga 2{ {44}}21) korišten je za usporedbu ukupnog preživljenja (OS) pacijenata s adenokarcinomom pluća (LUAD) s visokom/srednjom u odnosu na nisku ekspresiju gena kandidata (Slika 3). Visoke razine ekspresije mRNA NOX1 (omjer rizika (HR), 1,45; 95% interval pouzdanosti (CI), 1,11–1,9; p=0.0058), GDA (HR) , 1,74; 95% CI, 1,33-2,26; p=3.2e-05), TCN1 (HR, 1.62; 95% CI, 1.26-2.08; p=0.00014), i BPIFA1 (HR, 1,44; 95% CI, 1,12-1,84; p=0.0026) uočeno je da su značajno povezani s lošom prognozom (Slika 3A-D). S druge strane, visoke razine ekspresije mRNA FCGBP (HR, 0,63; 95% CI, 0,46–0,85; p=0.0026) bile su povezane s boljom prognozom i većim ukupnim preživljenjem u bolesnika s LUAD-om (Slika 3E). Nije bilo značajne korelacije između mRNA
Slika 3. FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 u korelaciji s kliničkom prognozom bolesnika s adenokarcinomom pluća. Kaplan–Meierove krivulje preživljavanja razina ekspresije mRNA gena kandidata: (A)NOX1; (B) GDA; (C) TCN1; (D) PLUNC; (E) FCGBP; (F) AZGP1; (G) H2Bf; (H) B7X; (I) AGR3; (J) CEACAM6; (K) F5; (L) BPIFB1; i (M) CST1 kod pacijenata s adenokarcinomom pluća. HR: omjer rizika.
dobrobiti dodatka cistanche-Antitumor
Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda
【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.3. Ekspresija FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1 u stanicama A549 nakon simulacije mikrogravitacije
Kako bi se potvrdila ekspresija in silico identificiranih gena (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP i BPIFA1), provedena je in vitro aplikacija pomoću qRT-PCR. Zanimljivo je da su korištenjem qRT-PCR-a naši podaci pokazali značajnu regulaciju ekspresije FCGBP mRNA, posebno nakon 48 i 72 sata u stanicama A549, nakon SMG-a u usporedbi s GG (Slika 4A). Osim toga, ekspresije mRNA CFB, F5 i BPIFB1 bile su značajno pojačane 72 h nakon SMG-a, i u usporedbi s GG, u stanicama A549 (Slika 4B, C, E). Blagi porast, iako neznatan, u ekspresiji mRNA otkriven je za CTS1 pod SMG uvjetima u usporedbi s GG (Slika 4D). Ekspresije AZGP1, AGR3, GDA, VTCN1, BPIFA1, NOX1, CEACAM5 i TCN1 nisu bile određene ni za SMG ni za GG (podaci nisu prikazani).
Slika 4. Regulacija FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 pod SMG uvjetima in vitro. Razine ekspresije mRNA (A) FCGBP, (B) CFB, (C) F5, (D) CTS1 i (E) BPIFB1, kvantificirane pomoću qRT-PCR i normalizirane na GAPDH u stanicama A549 podvrgnutim GG i SMG uvjetima tijekom 24 , 48 i 72 h. Stupčasti grafikoni prikazuju rezultate 3 neovisna eksperimenta (n=3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 i **** p < 0,0001.
Sve u svemu, ovi podaci upućuju na to da različito izraženi FCGBP, F5, CFB i BPIFB1 u raku pluća mogu igrati važnu ulogu u progresiji raka pluća.
2.4. Simulirana mikrogravitacija smanjuje vitalnost stanica i preokreće prijelaz epitela u mezenhim u liniji stanica raka pluća A549
Kako bi se istražilo utječe li SMG na potencijal proliferacije stanica A549, provedeno je ispitivanje stanične viabilnosti korištenjem testa isključenja tripan plavim. Naši su podaci otkrili da je SMG značajno inducirao smanjenje stanične proliferacije ovisno o vremenu (Slika 5B). Smanjenje stanične proliferacije bilo je značajno uglavnom nakon 48 i 72 sata nakon SMG-a u usporedbi s GG-om, koji je pokazao povećanje stanične proliferacije stanica A549. Paralelno, promjena stanične morfologije otkrivena je u stanicama A549 pod SMG. Kako bi se procijenile te promjene, stanice su uklonjene iz SMG stanja, nasađene na 24-pločice s jažicama i promatrane pod svjetlosnim mikroskopom nakon 1 h primjene SMG-a. Zanimljivo je da su stanice izložene SMG-u otkrile granularnu, zgrudanu morfologiju nakon SMG-a. (Slika 5A).
Slika 5. Simulirana mikrogravitacija smanjuje vitalnost stanica i izaziva morfološke promjene u stanicama A549 na način ovisan o vremenu. (A) Reprezentativne mikrofotografije roditeljskih stanica A549 (GG) i stanica A549 podvrgnutih SMG-u 24, 48 i 72 sata prije ponovnog zasijavanja na 1 sat pod GG-om. Slike su snimljene s povećanjem od 10X. (B) Preživljavanje stanica A549 stanica procijenjeno je pomoću testa isključenja tripan plave boje. Prosječna održivost stanica u 3 neovisna eksperimenta prikazana je kao postotna kontrola. **** p < 0.0001. Slika 5. Simulirana mikrogravitacija smanjuje vitalnost stanica i izaziva morfološke promjene u stanicama A549 na način ovisan o vremenu. (A) Reprezentativne mikrofotografije roditeljskih stanica A549 (GG) i stanica A549 podvrgnutih SMG-u 24, 48 i 72 sata prije ponovnog zasijavanja na 1 sat pod GG-om. Slike su snimljene s povećanjem od 10X. (B) Preživljavanje stanica A549 stanica procijenjeno je pomoću testa isključenja tripan plave boje. Prosječna održivost stanica u 3 neovisna eksperimenta prikazana je kao postotna kontrola. **** p < 0,0001.
Kineska biljka cistanche - Antitumor
Kako bismo razumjeli dobivene podatke o smanjenoj staničnoj proliferaciji u A549, procijenili smo doprinos SMG-a mehanizmu prijelaza epitela u mezenhim (EMT). EMT je obilježje i važan mehanizam koji pokreće progresiju raka i metastaze, čime se poboljšava njegova pokretljivost stanica i invazivna svojstva [19]. Ključni EMT markeri (E-kadherin, N-kadherin, ZO-1 i Snail) i razine ekspresije mRNA metaloproteinaza MMP-2 i MMP-9 izmjerene su qRT-PCR-om u A549, pod i GG i SMG (Slika 6). Nakon primjene SMG-a, uočeno je značajno povećanje ekspresije mRNA E-kadherina, paralelno sa značajnim smanjenjem ekspresije mRNA N-kadherina, 48 i 72 sata nakon SMG-a (Slika 6A, B). Neznačajno povećanje ZO-1 i MMP-9 i smanjenje Puževog transkripcijskog faktora otkriveno je nakon SMG-a (Slika 6C–E). MMP-2 značajno je smanjen u A549 48 h nakon SMG (Slika 6F), što ukazuje na manje invazivan oblik. Zajedno, ovi podaci podupiru fenotip mezenhimalno-epitelne tranzicije (MET) induciran SMG-om u A549.
Slika 6
2.5. Prijelazni put epitela u mezenhim korelira s ekspresijom FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1
Kako bi se dobio daljnji mehanički uvid u potencijalnu ulogu identificiranih gena u A549 i njihovu moguću korelaciju s EMT-om pod uvjetima SMG-a, provedena je analiza interakcije gena pomoću GeneMANIA-e protiv EMT genskih markera. Slika 7 prikazuje interakcije gena ucrtane između EMT gena E-kadherina (CDH1), N-kadherina (CDH2), TJP1, CTNNB1, SNAI1 (puž), ZO-1 i -katenina. Poznavajući njihovu značajnu ulogu u invaziji i migraciji raka, metaloproteinaze MMP-2 i MMP-9 također su uključene u analizu. Čvorovi identificiraju obrasce koekspresije između gena različite snage na temelju debljine čvora. Geni kandidati pokazuju određeni stupanj međusobne koekspresije; BPIFB1 se eksprimira zajedno s CFB i CST1; FCGBP se eksprimira zajedno s F5, CST1 i CFB; CST1 se eksprimira zajedno s CFB, a F5 se eksprimira zajedno s CFB, CST1 i BPIFB1. Čvorovi koekspresije također su identificirani između EMT gena i gena kandidata; CDH1 je koeksprimiran s FCGBP i F5; CDH2 se eksprimira zajedno s F5, CST1, BPIFB1 i FCGBP; CTNNB1 se eksprimira zajedno s CST1 i FCGBP; SNAI1 se eksprimira zajedno s CST1, F5 i BPIFB1; TPJ1 se eksprimira zajedno s CST1, FCGBP i F5; CTNNB1 se eksprimira zajedno s CST1 i FCGBP; MMP2 se eksprimira zajedno s BPIFB1 i CST1; a MMP9 se eksprimira zajedno s F5, CST1, FCGBP i CFB. Ovi nalazi sugeriraju značajnu korelaciju između novih identificiranih gena i EMT markera u uvjetima SMG-a, što je moguće povezano s EMT putevima.
Slika 7. FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 koreliraju s putem EMT-a. Mreža gen–gen interakcije odabranih gena kandidata; FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 s EMT genima; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 i SNAI1, kao i geni MMP2 i MMP9 povezani s migracijom stanica koje je generirala GeneMANIA (http://genemania.org/; pristupljeno 11. studenog 2021.) za identifikaciju interakcija između gena kandidata s EMT i markeri stanične migracije. Različite boje mrežnog ruba označavaju primijenjene bioinformatičke metode: predviđanje web mjesta (narančasto), fizičke interakcije (crveno), ko-ekspresija (ljubičasto), zajedničke proteinske domene (smeđe), put (svijetloplavo), ko-lokalizacija (tamno plava) i genetske interakcije (zelena)
3. Rasprava
Cistanche čaj
Rasprava Rak pluća, jedna od značajnih i svjetski prijetećih bolesti, u posljednje je vrijeme dobila veliku pozornost u "Istraživanju svemira". Međutim, unatoč napretku u ovom području, progresija raka pluća i njegov odgovor na liječenje ostaju kontroverzni zbog nedostatka definitivnih strategija procjene koje pomažu u prevenciji ili liječenju raka [21]. Koliko znamo, ovo je prvo izvješće koje identificira skup gena kao potpis za napredovanje raka pluća u mehaničkom okruženju izazvanom simuliranom mikrogravitacijom (SMG). Ističemo povećanu ekspresiju gena FCGBP, BPIFB, F5, CST1 i CFB povezanih s imunološkim odgovorom i njihovu korelaciju s prijelazom epitela u mezenhim (EMT) pod SMG-om, što ih čini potencijalnim biomarkerima progresije raka pluća. Ovdje također ističemo učinak induciranog SMG-a na regulaciju EMT-a, obilježje progresije raka [18,22], u podržavanju fenotipa prijelaza mezenhima u epitel (MET). Sve u svemu, ova studija nudi osnovu za povezanost identificiranih gena s EMT-om; međutim, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se otkrili točni mehanizmi koji pomažu u razvoju nove ciljane terapije za rak pluća. U ovoj smo studiji prikazali trinaest gena (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP i BPIFA1) koji su značajno izraženi u raku pluća pod simuliranom mikrogravitacijom (SMG) kao u usporedbi s zemaljskom gravitacijom u silicu. Naši podaci su pokazali da su ti različito izraženi geni obogaćeni putovima koji se uglavnom odnose na humoralni imunitet i reguliranu egzocitozu. Zanimanje paralelno s našim nalazima, iako je glavna funkcija FCGBP još uvijek nejasna [23]. To može biti djelomično zbog kontradiktornih uloga koje pokazuje u različitim tumorima [25]. Na primjer, pokazalo se da je FCGBP značajno povezan s boljom ukupnom prognozom i preživljenjem specifičnim za bolest u bolesnika s rakom glave i vrata, rakom debelog crijeva i osteosarkomom [25-27], dok je u raku jajnika i prostate visoka ekspresija FCGBP je bio povezan s lošijim ukupnim preživljenjem [28]. Važno je napomenuti da se uloga FCGBP-a pripisuje obrambenim mehanizmima imunološkog sustava, protuupalnim odgovorima, kao i zaštiti stanica [29,30], što ga čini bitnim prognostičkim markerom [31]. Koristeći in vitro aplikacije, procijenili smo ekspresiju identificiranih gena u raku pluća i pod SMG uvjetima putem 2D klinostata. Postoji širok izbor tipova klinostata i drugih mikrogravitacijskih platformi koje su razvijene. To uključuje 1/2/3 D klinostatske sustave, strojeve za nasumično pozicioniranje opremljene staklenim tikvicama (uglavnom za stanice raka štitnjače) i posude s rotirajućim zidom koje je razvila NASA. Svaki je dizajniran da služi određenom istraživačkom cilju, gdje su neki dizajnirani za uzgoj adherentnih ili suspenzijskih stanica, a drugi se koriste za online mjerenje kinetičkih odgovora. Treba napomenuti da je klinostat jedna od najjednostavnijih i najprilagodljivijih platformi koju koriste različite eksperimentalne aplikacije. U načelu, 2D klinostat karakterizira rotacijska os koja se kontinuirano okreće podešenom konstantnom brzinom i u smjeru koji je okomit na smjer vektora gravitacije Zemlje, stvarajući stoga centrifugalne sile koje oponašaju stvarnu mikrogravitaciju [14,32,33]. ]. Zanimljivo, od trinaest gena, ekspresija FCGBP, BPIFB, F5, CST1 i CFB značajno se povećala kao odgovor na 2D klinostatom izazvan SMG u A549 stanicama. Ekspresije FCGBP i BPIFB bile su najviše pogođene, pokazujući značajan porast u svim procijenjenim vremenskim točkama: 24, 48 i 72 sata nakon SMG-a. Slično FCGBP-u, poznato je da BPIFB1 doprinosi odgovorima urođenog imuniteta [34]. BPI fold koji sadrži protein člana 1 obitelji B (BPIFB1), koji prvenstveno proizvodi epitel dišnih putova, dokazano sudjeluje u obrambenim mehanizmima domaćina, zajedno s baktericidnim i protuupalnim učincima [35]. U respiratornim bolestima, pokazalo se da BPIFB1 pokazuje antitumorske i antimetastatske učinke; međutim, točni mehanizmi ostaju nejasni, što zahtijeva daljnje istraživanje [34,36]. Jedno istraživanje Weija i sur. otkrili su da BPIFB1 inhibira migraciju i invaziju nazofaringealnog karcinoma [37]. S obzirom na to, utvrđeno je da mutacije koje se javljaju u BPIFB1 promiču rizik od raka pluća, a njegova niža regulacija dovodi do loše prognoze u bolesnika s rakom pluća [38,39]. Osim uloge FCGBP i BPIFB, pokazalo se da faktor komplementa B (CFB) i kimerni tumor supresor 1 (CST1) imaju zaštitnu ulogu kod raka. Na primjer, objavljeno je da je visoka ekspresija CFB-a povezana s povećanim ukupnim preživljenjem pacijenata i preživljenjem bez bolesti kod pacijenata s rakom pluća [40]. Nadalje, sustav komplementa služi kao prva linija obrane protiv patogena, služeći kao glavna komponenta i urođenog i stečenog imunološkog sustava [41]. Što se tiče CST1, različite studije istaknule su njegova zanimljiva svojstva, kao što je njegova sposobnost suzbijanja rasta stanica, induciranja apoptoze i njegove otpornosti na inaktivaciju onkogenim oblicima p53, što ga čini atraktivnom, ali alternativnom terapeutskom metom divljeg tipa p{ {74}}otporni ljudski tumori [42]. Uz povećanu ekspresiju FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1, naši su podaci zanimljivo prikazali dva stanično povezana fenotipa stanica A549 pod SMG-promjenu morfologije u agregate i stanice u obliku nakupina i značajno smanjenje proliferacije stopa nakon SMG. Ovo je paralelno s nekim drugim studijama, gdje su stanice koje su bile izložene SMG pokazale male nakupine ili višeslojne stanične agregate [43,44]. Ove morfološke razlike ogledaju se u popratnim dramatičnim funkcionalnim promjenama u staničnim procesima, dio kojih je EMT. EMT je obilježje metastatskog procesa, povezanog s izbjegavanjem imunološkog nadzora i invazijom na vaskulaturu, čime se stanicama omogućuje diseminacija u sekundarne organe [19,22]. U načelu, maligne epitelne stanice prolaze kroz EMT mehanizam u primarnim fazama razvoja tumora, gdje te stanice imaju tendenciju izražavanja mezenhimalnih svojstava, pokazujući povećanu pokretljivost koja olakšava njihov bijeg iz primarne niše, dok se metastatske stanice formirane na sekundarnoj strani prikazuju manje dediferencirana svojstva u usporedbi s njihovim odgovarajućim primarnim tumorima. Ovdje je MET (mezenhimalni do epitelni) proces dio takve progresije formiranja metastatskog tumora. Međutim, to ne zanemaruje sudjelovanje EMT-a u različitim fazama progresije raka jer će stanice raka na sekundarnim mjestima ili nastaviti rasti i razmnožavati se ili će biti podvrgnute mirovanju [45,46]. Takva višestruka koordinacija gena i pojava specifičnih migracijskih markera koji reguliraju metastatsku progresiju stanica raka mogu rezultirati različitim ishodima nakon izlaganja SMG-u [47]. Na primjer, u uvjetima mikrogravitacije, različite stanice raka dojke pokazale su različite morfologije, staničnu adheziju i migracijska svojstva nakon izlaganja mikrogravitaciji [5]. Važno je napomenuti da je glavna karakteristika EMT-a gubitak molekule stanične adhezije, E-kadherina, čime se utječe na mirovanje integriteta stanica. S druge strane, povećanje neuralnog kadherina, N-kadherina, dovodi do promjena stanične adhezije. To je inducirano uglavnom transformirajućim faktorom rasta (TGF-), koji aktivira pleiotropski izražene transkripcijske faktore, kao što su Snail, Twist i Zeb proteini i drugi signalni putovi implementirani u metastatskim putevima [18,48,49]. Ovdje izvješćujemo o poboljšanju epitelnog markera E-kadherina (CDH1) i smanjenoj regulaciji razina mRNA mezenhimalnog N-kadherina (CDH2), ključnih markera EMT-a [49]. To implicira da u kombinaciji s našim podacima o smanjenoj stopi proliferacije A549, stanice pokazuju manje metastatsko stanje. Zanimljivo je da je promijenjena ekspresija ključnih EMT markera također bila popraćena značajnim smanjenjem matrične metaloproteinaze MMP-2, koja je glavna komponenta bazalne membrane koja normalno odvaja epitelni sloj od okolnog mezenhima, što dovodi do gubitak bazalne membrane [50]. Ovo je paralelno sa studijom koju su proveli Chang i sur., gdje su izvijestili o svojim nalazima smanjenja metastatskog potencijala stanica adenokarcinoma ljudskih pluća kroz promjenu ekspresije MMP2 [17]. Općenito, uloga MMP-a dobro je implicirana u napredovanju zloćudnih bolesti, uključujući metastaze, gdje je smanjena ekspresija MMP-a (MMP-2 i MMP-9) i enzimska aktivnost karakteristika manje metastatskog fenotipa [ 50–52]. Imajući značajnu ulogu EMT-a u metastaziranju, naši podaci ističu značajnu korelaciju FCGBP, BPIFB, F5, CST1 i CFB s markerima gena EMT-a, kao i genima MMP2 i MMP9 povezanima s migracijom stanica. Zanimljivo, Xiong et al. su pokazali da je FCGBP glavni regulator EMT-a u žučnom mjehuru [53]. To znači da identificirani geni mogu poslužiti kao potencijalni biomarkeri za buduće studije koje mogu predvidjeti i dalje razumjeti napredovanje raka pluća. Zajedno, naša otkrića klasificiraju identificirane gene kao ključne regulatore EMT-a, promičući potencijalno poboljšanje manje metastatskog fenotipa putem mezenhimalnog u epitelni prijelaz (MET) stanica raka pluća.
4. Materijali i metode
4.1. Skupovi podataka za identifikaciju uobičajenih diferencijalno izraženih gena (DEG) u staničnim linijama raka pluća izloženih simuliranoj mikrogravitaciji
Za početnu analizu izdvojeni su relevantni skupovi podataka iz javno dostupne baze podataka Gene Expression Omnibus (GEO). Ova se baza podataka koristi kao javno dostupna funkcionalna genomska analiza podataka o ekspresiji gena visoke propusnosti i mikronizova. Odabrani skupovi podataka ispunili su sljedeće kriterije: skupovi podataka koji koriste samo stanične linije ljudskog raka pluća, studije koje uključuju podudarne kontrole uvjeta gravitacije u zemlji (GG), skupovi podataka s definiranom klasifikacijom staničnih linija raka pluća i skupovi podataka s ekspresijom gena stanica ljudskog raka pluća koristeći mikromrežu. Dva skupa podataka odgovaraju ovom kriteriju, GSE78210 i GSE36931. Ukupno je 25 uzoraka uključeno u studije, a 14 uzoraka stanične linije raka pluća u simuliranoj mikrogravitaciji (SMG) uspoređeno je s 11 GG kontrola, kao što je prikazano u tablici 2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/; pristupljeno 11. studenog 2021.).
Tablica 2. Pojedinosti skupova podataka ekstrahiranih iz Gene Expression Omnibus (GEO) korištenih za početnu identifikaciju DEG između stanica raka pluća simulirane mikrogravitacije (SMG) i prizemne gravitacije (GG).
4.2. GEO2R analiza obogaćivanja skupa gena za generiranje DEG-ova u svakoj bazi podataka
GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r; pristupljeno 11. studenog 2021), interaktivni online alat koji se koristi za usporedbu GEO serija, korišten je u svakom skupu podataka za grupiranje i identificirati pojačano i smanjeno regulirane gene u SMG uvjetima u usporedbi s GG uvjetima. Geni s p-vrijednostima manjim od 0,05 i promjenom puta većom od 2 odabrani su kao različito eksprimirani geni DEG u SMG uvjetima. Posljedično, DEG-ovi svakog skupa podataka međusobno su se križali i identificirani su zajednički geni
4.3. Kvantifikacija kliničko-patološke zahvaćenosti identificiranih gena
Zatim su dobiveni geni u užem izboru potvrđeni korištenjem Kaplan–Meier Plottera (http://www.kmplot.com/; pristupljeno 11. studenog 2021.), javne baze podataka na mreži koja procjenjuje učinak odabranih gena na kliničke ishode pacijenata. Ukupno preživljenje (OS) definirano je kao trajanje od vremena dijagnoze (u mjesecima) do smrti. Podaci o ekspresiji gena i informacije o preživljavanju izvedeni su iz Omnibusa genske ekspresije (GEO), Atlasa genoma raka (TCGA) i Europskog atlasa fenomena genoma (EGA). Bolesnici su kategorizirani u dvije skupine: (1) visoka ekspresija (s TPM vrijednostima iznad gornjeg kvartila) i (2) niska/srednja ekspresija (s TPM vrijednostima ispod gornjeg kvartila). Kaplan-Meierovi dijagrami korišteni su za usporedbu OS pacijenata s adenokarcinomom pluća (LUAD) s visokom/srednjom naspram niske ekspresije gena kandidata.
4.4. Obogaćena ontološka klasterizacija za identificirane gene
Kako bi se istražilo dijele li identificirani geni zajedničke putove, provedena je analiza obogaćivanja puta Gene Ontology (GO) za identificirane gene pomoću web alata Metascape (https://metascape.org/; pristupljeno 11. studenog 2021.) za sveobuhvatnu napomenu popisa gena i resurs analize uz GEO2R
4.5. Stanična linija i kultura stanica
Linija bazalnih epitelnih stanica ljudskog adenokarcinoma alveolarnog (A549), naširoko korištena kao model za adenokarcinom pluća, uzgojena je u mediju Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS; Sigma, St. Louis, MO, SAD) i 100 jedinica/mL penicilina/streptomicina (P/S; Sigma, St. Louis, MO, SAD). Stanična linija je uzgajana u vlažnom inkubatoru na 37 ◦C u atmosferi od 5% CO2. Kada su stanice dosegle konfluentnost, sakupljene su pomoću 0,5% tripsina, centrifugirane na 100 x g tijekom 5 minuta i korištene po potrebi.
4.6. Mikrogravitacija
Stanice raka pluća (A549) uzgajane su u 2D klinostatskom sustavu oponašajući okolinu gotovo nulte gravitacije (mikrogravitacija). Ovaj Rotary Culture Max (RCMW™; Synthecon® Inc—Houston, TX, USA) je bioreaktor opremljen posudom za kulturu stanica koja uključuje mikroporoznu perfuzijsku jezgru i linijski sustav oksigenatora, koji osigurava hranjive tvari i vanjsko plinjenje medija, čime se osigurava odgovarajuća izmjena plinova i okruženje stanične kulture s niskim smicanjem. Komora je bila napunjena medijem kulture koji je sadržavao stanice. Ova se komora horizontalno okretala oko jedne osi okomite na silu gravitacije brzinom od 10 okretaja u minuti. 2D klinostat je postavljen unutar ovlaženog inkubatora na 37 ◦C u atmosferi od 5% CO2. Stanice A549 sakupljene su nakon simulacije mikrogravitacije (SMG) 24, 48 i 72 sata. Kako bi se stvorilo usporedivo okruženje za rak pluća, stanice A549 uzgajane su u pločama s kulturama na GG, u nerotiranim ili statičnim uvjetima, i držane su u blizini uređaja unutar ovlaženog inkubatora (37 ◦C). Ove stanice se nazivaju kontrolnom skupinom i također su sakupljene nakon 24, 48 i 72 sata.
4.7. Ispitivanje vitalnosti stanica
Za GG uvjete, stanice A549 nasađene su u 24-pločice za kulturu stanica s jažicama u gustoći od 3.0 × 104 stanice po 500 µL. Stanice su sakupljene tripsinizacijom 24, 48 i 72 sata nakon nasađivanja, zatim centrifugirane na 200 x g tijekom 5 minuta. Dobivene stanične pelete rekonstituirane su u mediju kulture. Za SMG uvjete, A549 stanice su zasađene u 2D clinostat rotirajući sustav pri gustoći od 6,0 × 104 stanica po 1 mL. Stanice su sakupljene 24, 48 i 72 sata nakon izlaganja SMG-u, zatim centrifugirane na 200 x g tijekom 5 minuta. Dobivene stanične pelete rekonstituirane su u mediju kulture. Proveden je test isključenja boje tripan plavim (Sigma, SAD). Broj stanica određen je korištenjem CellDrop™ automatiziranog brojača stanica.
4.8. Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (qRT-PCR)
Razine ekspresije gena (razine mRNA) in silico identificiranih gena (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP i BPIFA1) zajedno s EMT genskim markerima (Tablica 3) također su određeni u stanicama A549 pomoću qRT-PCR. Ukratko, ekstrakcija ukupne RNA iz stanica provedena je korištenjem RNEasy Mini Kita (QIAGEN, Hilden, Njemačka) na 24, 48 i 72 sata na GG i nakon izlaganja SMG-u slijedeći protokole proizvođača. Jedan µg ukupne RNA je obrnuto transkribiran u jednolančanu komplementarnu DNA (cDNA) u reakcijskom volumenu od 20 µL korištenjem iScript™ kompleta za sintezu cDNA (Thermo, Waltham, MA, SAD). qRT-PCR je izveden pomoću PowerUp™ Sybr™ Green master mix (Thermo, SAD) u Quant Studio 5 pcr stroju (Thermo, SAD). Koraci PCR amplifikacije bili su sljedeći: početni korak denaturacije na 95 ◦C tijekom 3 minute, temperatura žarenja ciljnog gena tijekom 30 sekundi, a zatim 72 ◦C tijekom 30 sekundi. Vrijednost ciklusa praga fluorescencije dobivena je za svaki gen. ∆∆Cq metoda korištena je za izračunavanje relativne višestruke promjene ekspresije gena nakon normalizacije na gen za domaćinstvo, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH).
Tablica 3. Popis humanih početnica. NOX1, NADPH oksidaza 1; GDA, guanin deaminaza; TCN1, transkobalamin 1; FCGBP, Fc gama vezujući protein; BPIFA1, BPI presavijanje koje sadrži člana obitelji A 1; AZGP1, alfa-2-glikoprotein 1; CFB, faktor komplementa B; VTCN1, V-Set domena koja sadrži inhibitor aktivacije T stanica 1; AGR3, prednji gradijent 3; CTS1, kimerni tumor supresor 1; F5, faktor koagulacije V; CEACAM6, CEA molekula stanične adhezije 6; BPIFB1, BPI presavijanje koje sadrži člana obitelji B 1; ZO-1, Zonula occludens protein 1; MMP-9, matrična metaloproteinaza 9; MMP-2, matrična metaloproteinaza 2; i GAPDH, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza
4.9. Analiza interakcije gen-gen
Podaci iz in vitro qRT-PCR-a implementirani su u analizu interakcije gen-gen pomoću in silico web alata GeneMANIA (http://genemania.org/; pristupljeno 11. studenog 2021.), mrežnog algoritma za predviđanje funkcija gena pomoću velikog skupa podaci o funkcionalnoj povezanosti. Ovo je provedeno kako bi se dodatno procijenile interakcije između/između odabranih gena kandidata; FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 s EMT genima; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 i SNAI1, kao i geni povezani s migracijom stanica, MMP2 i MMP9.
4.10. Statistička analiza
Za izvođenje statističke analize korišten je softver GraphPad Prism. Rezultati se izražavaju kao pojedinačni podaci ili kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Za usporedbu različitih skupina korišten je Studentov t-test. Razlike između skupina procijenjene su jednosmjernom ANOVA varijance (ANOVA). p-vrijednosti su određene i vrijednosti p < 0.05, p < 0.01, p < 0,001 (*, **, odnosno ***) su smatrati značajnim. Svi eksperimenti izvedeni su u tri primjerka (n=3).
Reference
1. Bijeli, RJ; Averner, MJN Ljudi u svemiru. Nature 2001, 409, 1115–6828. [CrossRef]
2. Bradbury, P.; Wu, H.; Choi, JU; Rowan, AE; Zhang, H.; Poole, K.; Lauko, J.; Chou, J. Modeliranje utjecaja mikrogravitacije na staničnoj razini: Implikacije za ljudske bolesti. Ispred. Cell Dev. Biol. 2020, 8, 96. [CrossRef] [PubMed]
3. Yuan, M.; Liu, H.; Zhou, S.; Zhou, X.; Huang, Y.-E.; Hou, F.; Jiang, W. Integrativna analiza regulatornog modula otkriva povezanost mikrogravitacije s disfunkcijama sustava više tijela i tumorigenezom. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7585. [CrossRef] [PubMed]
4. Crucian, BE; Chouker, A.; Simpson, RJ; Mehta, S.; Marshall, G.; Smith, SM; Zwart, SR; Heer, M.; Ponomarev, S.; Whitmire, A.; et al. Disregulacija imunološkog sustava tijekom svemirskih letova: Potencijalne protumjere za misije istraživanja dubokog svemira. Ispred. Immunol. 2018, 9, 1437. [CrossRef] [PubMed]
5. Nassef, MZ; Melnik, D.; Kopp, S.; Sahana, J.; Infanger, M.; Lützenberg, R.; Relja, B.; Wehland, M.; Grimm, D.; Krüger, M. Stanice raka dojke u mikrogravitaciji: Novi aspekti istraživanja raka. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7345. [CrossRef]
6. Takamatsu, Y.; Koike, W.; Takenouchi, T.; Sugama, S.; Wei, J.; Waragai, M.; Sekiyama, K.; Hashimoto, M. Zaštita od neurodegenerativnih bolesti na Zemlji iu svemiru. NPJ Microgravity 2016, 2, 16013. [CrossRef]
7. Nassef, MZ; Kopp, S.; Wehland, M.; Melnik, D.; Sahana, J.; Krüger, M.; Corydon, TJ; Oltmann, H.; Schmitz, B.; Schütte, A. Prava mikrogravitacija utječe na citoskelet i žarišne adhezije u ljudskim stanicama raka dojke. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3156. [CrossRef]
8. Dietz, C.; Infanger, M.; Romswinkel, A.; Strube, F.; Kraus, A. Indukcija apoptoze i promjena prianjanja stanica u ljudskim stanicama raka pluća pod simuliranom mikrogravitacijom. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3601. [CrossRef]
9. Ricci, G.; Cucina, A.; Proietti, S.; Dinicola, S.; Ferranti, F.; Cammarota, M.; Filippini, A.; Bizzarri, M.; Catizone, A. Mikrogravitacija izaziva prolazni EMT u ljudskim keratinocitima ranom regulacijom E-kadherina i remodeliranjem stanične adhezije. J. Appl. Sci. 2020, 11, 110. [Unakrsna Ref.]
10. Ahn, CB; Lee, J.-H.; Han, DG; Kang, H.-W.; Lee, S.-H.; Lee, J.-I.; Sin, KH; Lee, JW Simulirana mikrogravitacija s plutajućim okolišem potiče migraciju karcinoma pluća nemalih stanica. Sci. Rep. 2019, 9, 14553. [CrossRef] [PubMed]
11. Pisanu, ME; Noto, A.; De Vitis, C.; Masiello, MG; Coluccia, P.; Proietti, S.; Giovagnoli, MR; Ricci, A.; Giarnieri, E.; Cucina, A. Matične stanice raka pluća gube zadano stanje matične stanice nakon izlaganja mikrogravitaciji. BioMed Res. Int. 2014, 2014, 470253. [CrossRef] [PubMed]
12. Infanger, M.; Kossmehl, P.; Shakibaei, M.; Bauer, J.; Kossmehl-Zorn, S.; Cogoli, A.; Curcio, F.; Oksche, A.; Wehland, M.; Kreutz, RJC; et al. Simulirano bestežinsko stanje mijenja citoskelet i proteine izvanstaničnog matriksa u stanicama papilarnog karcinoma štitnjače. Cell Tissue Res. 2006, 324, 267–277. [CrossRef] [PubMed]
13. Chen, J.; Mikrogravitacija, L. Tumorske stanice u mikrogravitaciji. U svemiru: putovanje o tome kako se ljudi prilagođavaju i žive u mikrogravitaciji; IntechOpen: London, UK, 2018.; Svezak 139, str. 259–268.
14. Grimm, D.; Schulz, H.; Krüger, M.; Cortés-Sánchez, JL; Egli, M.; Kraus, A.; Sahana, J.; Corydon, TJ; Hemmersbach, R.; Wise, PM Borba protiv raka mikrogravitacijom: višestanični sferoid kao model metastaza. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 3073. [CrossRef]
15. Schabath, MB; Cote, ML Napredak raka i prioriteti: Rak pluća. Cancer Epidemiol. Biomark. Pret. 2019, 28, 1563–1579. [CrossRef] [PubMed]
16. Chung, JH; Ahn, CB; Sin, KH; Yi, E.; Sin, HS; Kim, H.-S.; Lee, SH Simulirani učinci mikrogravitacije na proliferaciju i migraciju stanica raka pluća nemalih stanica. Aerosp. Med. Pjevušiti. Izvoditi. 2017, 88, 82–89. [CrossRef]
17. Chang, D.; Xu, H.; Guo, Y.; Jiang, X.; Liu, Y.; Li, K.; Pan, C.; Yuan, M.; Wang, J.; Li, T.; et al. Simulirana mikrogravitacija mijenja metastatski potencijal stanične linije adenokarcinoma ljudskih pluća. Vitr. Ćelija. Dev. Biol. Anim. 2013, 49, 170–177. [CrossRef]
18. Hanahan, D.; Weinberg, R. Obilježja raka: Sljedeća generacija. Cell 2011, 144, 646–674. [CrossRef]
20. Ribatti, D.; Tamma, R.; Annese, T. Epitelno-mezenhimalni prijelaz kod raka: povijesni pregled. prev. Oncol. 2020, 13, 100773. [CrossRef]
20. Shi, S.; Li, Q.; Cao, Q.; Diao, Y.; Zhang, Y.; Yue, L.; Wei, L. EMT transkripcijski faktori uključeni su u promijenjenu staničnu adheziju pod simuliranim učinkom mikrogravitacije ili preopterećenja regulacijom E-kadherina. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1349. [CrossRef]
21. Topal, U.; Zamur, C. Mikrogravitacija, matične stanice i rak: Nova nada za liječenje raka. Matične stanice Int. 2021, 2021, 5566872. [CrossRef]
23. Ksiazkiewicz, M.; Markiewicz, A.; Zaczek, AJ Epitelno-mezenhimalni prijelaz: obilježje stvaranja metastaza koje povezuju cirkulirajuće tumorske stanice i matične stanice raka. Pathobiology 2012, 79, 195–208. [CrossRef] [PubMed]
23. Yan, T.; Tian, D.; Chen, J.; Tan, Y.; Cheng, Y.; Da, L.; Deng, G.; Liu, B.; Yuan, F.; Zhang, S. FCGBP je prognostički biomarker i povezan je s imunološkom infiltracijom u gliomu. Ispred. Oncol. 2021, 11, 769033. [CrossRef] [PubMed]
