Napredak istraživanja i primjena fluorescentnih proteinskih protutijela: Pregled s fokusom na nanotijela

Sažetak: Od otkrića fluorescentnih proteina (FP), njihovi bogati fluorescentni spektri i fotokemijska svojstva potaknuli su široku primjenu bioloških istraživanja. FP se mogu klasificirati u zelene fluorescentne proteine ​​(GFP) i njegove derivate, crvene fluorescentne proteine ​​(RFP) i njegove derivate i FP blizu infracrvenog zračenja. Uz kontinuirani razvoj FP-a, pojavila su se protutijela koja ciljaju FP-ove. Antitijelo, klasa imunoglobulina, glavna je komponenta humoralne imunosti koja eksplicitno prepoznaje i veže antigene. Monoklonska protutijela, koja potječu iz jedne B stanice, naširoko se primjenjuju u imunotestovima, in vitro dijagnostici i razvoju lijekova. Nanotijelo je nova vrsta antitijela koja se u potpunosti sastoji od varijabilne domene teškog lanca antitijela. U usporedbi s konvencionalnim antitijelima, ova mala i stabilna nanotijela mogu se eksprimirati i djelovati u živim stanicama. Osim toga, mogu lako pristupiti utorima, šavovima ili skrivenim antigenskim epitopima na površini mete. Ovaj pregled daje pregled različitih FP-ova, napredak istraživanja njihovih protutijela, posebno nanotijela, i napredne primjene nanotijela koja ciljaju FP-ove. Ovaj pregled će biti od pomoći za daljnja istraživanja nanotijela koja ciljaju FP, čineći FP vrednijima u biološkim istraživanjima.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Ključne riječi: fluorescentni protein; monoklonsko antitijelo; nanotijelo; napredak istraživanja; primjena

1. Uvod

Fluorescentni protein (FP) je najčešće korišten alatni protein u biomedicinskim znanstvenim istraživanjima. Nakon povećane upotrebe FP, razvijena su i FP antitijela. U usporedbi s tradicionalnim antitijelima (Slika 1A), protutijela teškog lanca (HCAb) iz deve (Slika 1B) i imunoglobulinski novi antigenski receptori (IgNAR) iz morskih pasa (Slika 1C) prirodno nemaju lake lance. Antitijelo s jednom domenom (sdAb) je antitijelo u potpunosti sastavljeno od varijabilnih domena HCAb ili IgNAR. Njegova molekularna težina je 12-15 kDa, što je oko 1/10 veličine monoklonskog protutijela; stoga se naziva i nanotijelo. Nanotijelo, s manjom veličinom, visokom postojanošću na kiselinu i toplinu, snažnom sposobnošću prodiranja, lakoćom genetskog inženjeringa i ekspresije te visokim afinitetom, znanstveni su istraživači primijenili na raznim poljima. Može lako pristupiti utorima, šavovima ili skrivenim antigenskim epitopima na površini mete, prepoznajući mnoge antigene koje konvencionalna protutijela ne mogu prepoznati [1]. Stoga su se nanotijela koristila kao biomolekule u organizmima i sustavima staničnih kultura u razvojnoj biologiji, kristalni šaperoni za konformacijsko stanje u stabilnoj biologiji, regulatori ili inhibitori aktivnosti enzima, imunohistokemijski reagensi za biokemijske analize i sekundarna protutijela u imunoblotingu i imunofluorescenciji [2]. –6]. Nanotijela koja specifično vežu FP naširoko se koriste u substaničnoj lokalizaciji, studijama unutarstaničnog signalnog puta, slikanju živih stanica i ciljanim nanomaterijalima [7-9]. Konkretno, nanotijela imaju jedinstvene prednosti u odnosu na tradicionalna IgG antitijela u slikanju super visoke rezolucije.

Slika 1. Dijagrami strukture IgG (A), HCAb kamile (B) i IgNAR morskog psa (C). VH, varijabilna regija teškog lanca; VL, varijabilna regija lakog lanca; CH/C, konstantna regija teškog lanca; CL, konstantna regija lakog lanca; VHH, varijabilna domena HCAb; VNAR, varijabilna domena IgNAR.

2. Pregled fluorescentnih proteina

2.1. Otkriće fluorescentnih proteina

Luminescencija je uobičajena pojava kod morskih beskralješnjaka. Koelenterati, uključujući meduze, hidre i koralje, emitiraju zelenu fluorescenciju pod ultraljubičastim (UV) ili plavim svjetlom, dok ctenofori emitiraju plavu fluorescenciju. Zeleni fluorescentni protein (GFP) prvi su identificirali u Aequorea victoria Shimomura et al. 1962. [10], a potom kloniran i eksprimiran 1985. [11]. Jedinstvena svojstva i stabilna struktura GFP-a divljeg tipa (wtGFP) su, prema tome, privukli mnoge istraživače da ga proučavaju. Od tada, na temelju postojećeg znanja i njegove kristalne strukture, Tisen i njegovi kolege su mutacijom generirali različite GFP proteine ​​s različitim fluorescentnim svojstvima i razradili mehanizam luminescencije GFP [12]. Što se tiče istraživanja vezanog uz GFP, tri su znanstvenika (Shimomura, Chalfie i Tsien) osvojili Nobelovu nagradu za kemiju 2008. za otkriće GFP-a i njihov izniman doprinos njegovoj primjeni.

Ancestralni crveni fluorescentni protein (RFP), naime DsRed, kloniran je iz nebioluminiscentnih grebenskih koralja 1999. [13]. RFP se može koristiti zajedno s GFP-om za rješavanje znanstvenih problema koje GFP sam ne može riješiti. Ono što je najvažnije, zbog niske pozadine RFP-a u intracelularnom snimanju, prikladnije je za primjenu u istraživanju bioznanosti [14,15]. Uz napore mnogih znanstvenika, objavljeno je da spektri fluorescencije FP pokrivaju cijelo vidljivo područje, pa čak i blisko infracrveno područje, pružajući mnoštvo alata za vizualizaciju i kvantificiranje proteina u živim stanicama [16]. Slika 2 sažima razvoj FP-ova.

Slika 2. Razvoj fluorescentnih proteina. GFP, zeleni fluorescentni protein; BFP, plavi fluorescentni protein; EGFP, pojačani zeleni fluorescentni protein; YFP, žuti fluorescentni protein; RFP, crveni fluorescentni protein; VHH, varijabilna domena teškog lanca; VNAR, varijabilni novi antigenski receptor. Blijedo zeleni marker označava napredak istraživanja primjene GFP-a, a žutozeleni marker označava napredak istraživanja GFP antitijela.

2.2. Struktura i funkcionalna svojstva GFP-a

GFP je prirodni, globularni i topljivi kiseli FP. Primarna struktura GFP-a sastoji se od monomera koji se sastoji od 238 aminokiselinskih ostataka, molekularne težine 27-30 kDa. Njegova kristalna struktura prikazuje središte formirano od 11 antiparalelnih lanaca, koji tvore cilindričnu, čvrsto zbijenu bačvastu strukturu. Središte -bačve zaštićeno je skupinom koja emitira svjetlost 4-(p-hidroksibenziliden)-5-imidazolinona povezanom s njegovom -heliksom, s oba kraja zapečaćena kratkim -heliks segmentima [17,18]. Sazrijevanje kromofora ne zahtijeva drugi kofaktor osim O2 [19]. GFP apsorbira plavo svjetlo ili UV svjetlo i emitira zelenu fluorescenciju, s glavnim vrhom pobude na 395 nm, najnižim vrhom pobude na 475 nm i vrhom emisije na 509 nm. GFP je izuzetno stabilan i može lako izdržati tretman na visokim temperaturama. Fiksacija formaldehidom ili parafinska ugradnja ne utječe na njegove fluorescentne karakteristike. Kroz dubinsko istraživanje strukture i procesa sazrijevanja FP-a, sve više i više istraživača redizajnira strukturu FP-a kako bi im pružili nove funkcije i svojstva, dodatno promičući njihov razvoj i primjenu.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

2.3. GFP izvedenice

Ograničavajući čimbenici u primjeni GFP-a su pH, osjetljivost na kloridne ione i slaba fotostabilnost. Ciljane modifikacije GFP-a ispravljaju te nedostatke, povećavajući njegov kvantni prinos, svjetlinu, koeficijent molarne ekstinkcije i fotostabilnost. Uz to, uspostavljeno je nekoliko GFP derivata za proširenje raspona emitiranih boja, uključujući plavu, ultramarin, cijan i žutu.

Kao odgovor na nizak intenzitet fluorescencije wtGFP-a pod pobuđivanjem plavim svjetlom i njegovu nestabilnu ekspresiju u stanicama sisavaca, Zhang et al. konstruirao je aminokiselinsku supstituciju GFP-a (F64L i S65T), naime, poboljšani GFP (EGFP), čiji je intenzitet fluorescencije povećan 35-puta [20]. EGFP ostaje najčešće korišteni FP mutant u području zelene svjetlosti, s obzirom na njegovu dobru fotostabilnost i visoku svjetlinu. Osim toga, svojstva savijanja GFP-a su optimizirana, dobivajući super mapu GFP (sfGFP) sa super sposobnošću savijanja. SfGFP ima šest novih mutacija, uključujući S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V i A206V. sfGFP se može učinkovito savijati čak i kada se eksprimira u fuziji s netopivim proteinima, osiguravajući svjetlinu svoje fluorescencije [21]. GFPuv, još jedan modificirani oblik GFP-a, optimiziran je za fluorescenciju pod UV svjetlom. Generira svjetliju zelenu fluorescenciju u prisutnosti UV svjetla s vrhom ekscitacije na 395 nm i vrhom emisije na 509 nm i može se koristiti za precizno određivanje lokacije različitih unutarstaničnih proteina [22,23]. Tri aminokiselinske supstitucije javljaju se u GFPuv, uključujući F99S, M153T i V163A. Ove mutacije induciraju 18-puta jaču ekspresiju GFPuv nego wtGFP u E. coli. Gen GFPuv je sintetski gen gdje je pet niskofrekventnih Arg kodona zamijenjeno kodonima prikladnim za E. coli kako bi se osigurala učinkovita ekspresija GFPuv.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Mjesto usmjerena mutacija Y66H konstruira plavi fluorescentni protein (BFP) s vrhom ekscitacije na 384 nm i vrhom emisije na ~445 nm. Njegov ekscitacijski spektar blizak je UV svjetlu koje tijekom rada oštećuje stanice, a njegova kratka valna duljina emisije izaziva autofluorescenciju u stanicama. Poboljšani BFP (EBFP) je slabo luminescentan i slabo otporan na fotoizbjeljivanje i kiselinu, s visokim pozadinskim signalom za staničnu sliku. Razvijena su tri svjetlija EBFP mutanta, uključujući Azurite [24], EBFP2 [25] i mTagBFP [26], koji su 1.6-, 2.0- i 3.{{13} }svjetliji od EBFP-a. mTagBFP, najsvjetliji BFP, izveden je iz mutanta crvenog fluorescentnog proteina (RFP) TagRFP [27], s koeficijentom ekstinkcije od 52,000 M−1 cm−1 i kvantnim prinosom od {{19 }}.63, što značajno poboljšava njegovu otpornost na fotoizbjeljivanje. Mutacija Y66F u wtGFP rezultira ultramarin fluorescentnim proteinom s valnom duljinom emisije od 442 nm [28]. Međutim, nizak kvantni prinos fluorescencije varijante GFP-Y66F ozbiljno ograničava njegovu primjenjivost u slikanju. Daljnja mutacija GFP-Y66F aminokiselinskim supstitucijama T65Q, Y145G, H148S i T203V rezultira ultramarin fluorescentnim proteinom Sirius, koji je 25 puta svjetliji od GFP-Y66F [29].

Cijan fluorescentni protein (CFP) ima vrhunac ekscitacije na 449 nm i vrhunac emisije na ~482 nm, sa spektralnim svojstvima u rasponu između BFP i EGFP. Slično BFP-u, mutacija Y66W usmjerena na mjesto koristi se za konstrukciju CFP-a. CFP ima široku primjenu u višebojnim slikama i istraživanjima lokalizacije zbog svoje izvanredne fotostabilnosti. Na primjer, gen koji kodira CFP optimiziran je za ljudske kodone i sada je komercijalno dostupan pod trgovačkim nazivom AmCyan1 (Clontech). Osim toga, postoji nekoliko mutanata svjetlijih od poboljšanog CFP-a (ECFP), kao što su Cerulean, mTFP (dvostruko svjetliji od Ceruleana) i tirkiz (otprilike dvostruko svjetliji od ECFP-a) [21,30].

Mutacije u žutom fluorescentnom proteinu (YFP) nisu ograničene na motiv jezgre kromofora Y66, već na ostatke koji su strukturno susjedni Y66. Vrh ekscitacije YFP-a je ~518 nm, s vrhom emisije od ~531 nm. U usporedbi s GFP-om, fluorescencija YFP-a pomiče se prema crvenom spektru, što je uglavnom posljedica supstitucije Thr s Tyr-om na poziciji 203. Poboljšani YFP (EYFP) jedan je od najfluorescentnijih i najčešće korištenih FP biosenzora za otkrivanje intracelularnog pH i koncentracije kloridnih iona. Međutim, vrlo je osjetljiv na kisele i kloridne ione i manje je fotostabilan od mnogih FP-ova izvedenih iz meduza [31]. mCitrine i mVenus, poboljšane verzije EYFP-a, trenutno su najčešće korišteni YFP [32,33]. Fotofizička svojstva GFP-a i njegovih derivata sažeta su u tablici 1.

Tablica 1. Fotofizička svojstva GFP, RFP i njihovih derivata.

Tablica 1. Nast.

2.4. RFP izvedenice

RFP je još jedan široko korišten FP. DsRed je tetramer koji ima tendenciju stvaranja multimera prilikom izvođenja fuzija proteina i može biti toksičan kada se eksprimira unutar stanice, pa je dizajniran za dobivanje monomera. Najistaknutiji RFP je obitelj "mFruit", uključujući mTrešnje, mBanane, mNaranče, dRajčice, mTangerine i mJagode (Tablica 1), od kojih je mTrešnja, s mutacijama K163Q i K83L, najpoželjnija. mTrešnja ima brzo sazrijevanje, dobra monomerna svojstva i bolju fotostabilnost, iako je manje svijetla [34]. Međutim, TagRFP u svom monomernom obliku je oko tri do četiri puta svjetliji od mCherry, što ga čini relativno svijetlim monomernim RFP-om koji je trenutno dostupan [27]. mKate je novi monomerni dalekocrveni fluorescentni protein izveden iz mutacije na četiri mjesta TagRFP-a s vrhom ekscitacije na 588 nm i vrhom emisije na 635 nm, koji je samo 45% svjetliji od EGFP-a; njegov dimerizacijski protein, Katushka, je 67% svjetliji od EGFP [35]. mKate2, mutant mKate sa aminokiselinskim supstitucijama V38A, S165A i K238R, ima otprilike dvostruko veću svjetlinu od mKate [36]. U usporedbi s GFP i RFP, mKate i Katushka pokazuju bolju dubinu slike i bogatije optičke signale za fluorescentnu sliku unutar objekta [35]. Stoga je razvoj dalekocrvenih fluorescentnih proteina vredniji za in vivo bioimaging.

2.5. Bliski infracrveni FP-ovi

Bliski infracrveni (NIR) FP-ovi vrlo su poželjni kao oznake proteina u aplikacijama za snimanje. Većina NIR FP dizajnirana je od bakterijskih fotoreceptora fitokroma (BphP) [37]. Prvi NIR FP korišten u slikanju živih životinja je IFP1.4, fluorescentni protein izveden iz BphP koji fluorescira vezanjem na biliverdin (BV) kromofor [38]. Miješanjem DNK i nasumičnim mutagenezom, tada se razvija svjetliji IFP2.0 [39]. Iako se monomerni IFP1.4 i IFP2.0 mogu postići prekidanjem dimerizacijskog sučelja BphP-a, oni i dalje imaju tendenciju dimerizacije pri visokim koncentracijama. Prirodni monomerni infracrveni fluorescentni protein (IFP), mIFP, dizajniran je 2015. godine [40]. Dokazano je da mIFP ima efekt zvučne slike u ličinkama Drosophile i neuronima. Shcherbakova i sur. dizajnirali su tri svijetla monomerna NIR FP-a s različitim spektrima, naime miRFP670, miRFP703 i miRFP709 [41]. NIR FP izvedeni iz BphP minimalno zahtijevaju dvije domene, PAS (Per-ARNT-Sim) i GAF (cGMP fosfodiesteraza-adenilat ciklaza-FhlA), za kovalentno pričvršćivanje BV kromofora, a također posjeduju složenu strukturu "čvora osmice" topološki povezuju GAF i PAS domene, što utječe na njihovo savijanje. Stoga se druga klasa bakterijskih fotoreceptora, alofikocijanini (APC), koristi za projektiranje NIR FP, kao što je smURFP [42]. Iako su NIR FP-ovi bazirani na APC-u manji, oni vežu BV manje učinkovito, što dovodi do znatno niže svjetline u stanicama sisavaca od NIR FP-ova izvedenih iz BphP-a. Kako bi se prevladali nedostaci NIR FP-ova temeljenih na BphP-u i APC-u, NIR FP s jednom domenom nazvan miRFP670nano razvijen je iz cijanobakteriokroma (CBCR), što predstavlja prvi NIR FP izveden iz CBCR-a koji može učinkovito vezati endogeni BV kromofor i emitirati svijetlu fluorescenciju u stanice sisavaca [43]. Bitna prednost miRFP670nano u odnosu na NIR FPs izvedene iz BphP je visoka fotostabilnost. Poboljšani miRFP670nano3, s 14 mutacija u odnosu na roditeljski miRFP670nano, pokazuje sličnu fotostabilnost kao miRFP670nano [44]. Tablica 2 sažima fotofizička svojstva NIR FP-a.

Tablica 2. Fotofizička svojstva NIR FP-a.

Otkriće i primjena FP-a pružili su moćan istraživački alat za modernu biologiju. Danas su FP postali jedan od uobičajenih alata koje znanstvenici koriste za proširenje svoje primjene na mnoga područja istraživanja, kao što su regulacija ekspresije gena, označavanje organela, prijenos signala, probir lijekova i biomolekularne interakcije. Većina vektora za kloniranje koji izražavaju FP komercijalizirani su i dostupni su putem komercijalnih tvrtki.

3. Napredak istraživanja fluorescentnih proteinskih protutijela

3.1. Monoklonska protutijela koja ciljaju fluorescentne proteine

Antitijelo je vrsta imunoglobulina koji luče B limfociti. Monoklonska protutijela sastoje se od dva teška lanca i dva laka lanca, pri čemu se teški lanac sastoji od jedne varijabilne regije (VH) i tri konstantne regije (CH), a laki lanac se sastoji od jedne varijabilne regije (VL) i jedne konstantne regije (CL). ). Teški lanci su kovalentno povezani disulfidnim vezama, a CL regija lakog lanca je nekovalentno povezana s CH1 domenom teškog lanca kako bi nastala stabilna molekula antitijela [45]. Zbog svog specifičnog kapaciteta vezanja na receptore, monoklonska protutijela proizvode niz bioloških aktivnosti, kao što su klasično blokiranje, neutralizacija, aktivacija komplementa, ubijanje ciljnih stanica preko Fc receptora i regulacija imunološke aktivnosti. Oni su kritične biološke makromolekule koje se široko primjenjuju u imunotestovima, in vitro dijagnostici i razvoju lijekova. Poliklonska protutijela su mješavina heterotipskih protutijela koja potječu iz procesa imunološkog odgovora više B stanica, a svako protutijelo prepoznaje različiti epitop istog antigena [45]. U usporedbi s poliklonskim antitijelima, monoklonska antitijela specifično otkrivaju epitop na antigenu i manja je vjerojatnost da će unakrsno reagirati s drugim proteinima, stvarajući slabe pozadinske signale bojenja. Štoviše, ponovljivost rezultata u vezi s monoklonskim protutijelima veća je nego kod poliklonskih protutijela pod istim eksperimentalnim uvjetima.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90%) pročišćava se jednostavnom 2-tehnikom koraka upotrebom mAb FMU-GFP.5-spojene Sepharose 4B smole. Uz to, svi funkcionalni rekombinantni ciljni proteini povezani s GFP mogu se jednostavno i izravno izolirati iz stanica, zahvaljujući GFP epitopu. Ovi podaci sugeriraju da je ova metoda učinkovitija u pročišćavanju GFP-a od bilo koje dostupne metode i rješava problem niskog prinosa i čistoće kod većine GFP metoda pročišćavanja.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

3.2. Nanotijela koja ciljaju fluorescentne proteine

3.2.1. Uvođenje nanotijela

Inherentna svojstva monoklonskih protutijela, poput njihove velike molekularne težine, složene strukture i ograničene biološke aktivnosti, sve su više ograničavala njihovu daljnju primjenu. Stoga je hitno potrebno razviti alternative monoklonskim antitijelima. Godine 1989. Ward i sur. pripremili su varijabilnu domenu protutijela samo teškog lanca sa slabom sposobnošću vezanja na lizozim, potaknuvši interes za istraživanje sdAb [48]. Godine 1993. Hamers Casterman i sur. prvi put otkrili novu vrstu antitijela u devinom serumu, koja se potpuno razlikuju od tradicionalnih antitijela sisavaca [49]. Ova vrsta antitijela nazvana je HCAb zbog prirodnog nedostatka lakih lanaca. HCAb se sastoji od CH2, CH3, zglobne regije i varijabilne domene HCAb (VHH), ali još uvijek ima puni kapacitet vezanja antigena. Godine 1995. Greenberg i sur. otkrili antitijela koja sadrže samo teške lance, poznata kao IgNAR, u morskog psa dojilje [50]. Postoji i u sekretornom obliku i u obliku vezanom za membranu, a sastoji se od varijabilne regije, nazvane varijabilni novi antigenski receptor (VNAR), i nekoliko konstantnih regija. Nakon toga, IgNAR je pronađen u wobbegong morskom psu, bodljikavom morskom psu, morskom psu rogu i bambusovom morskom psu s bijelim pjegama, nadopunjavajući repertoare sdAbs. Nanotijelo posjeduje karakteristike male molekularne težine, visokog afiniteta, jake stabilnosti, dobre topljivosti, snažnog prodiranja u tkivo i prepoznavanja skrivenih antigenskih epitopa. Privukao je povećanu pozornost u dijagnozi bolesti, imunološkim reagensima, otkrivanju patogena i razvoju lijekova [51]. S razvojem tehnika molekularne biologije i poboljšanjem genetski modificirane tehnologije pripreme antitijela, nanotijelo je postalo popularno istraživačko polje u imunotestovima. Slika 3 sažima razvoj nanotijela do danas.

Slika 3. Razvoj nanotijela. Svijetloplavi marker označava napredak istraživanja lijekova nanotijela. FDA, Uprava za hranu i lijekove; EMA, Europska agencija za lijekove; NMPA, Nacionalna uprava za medicinske proizvode; HCAb, antitijelo teškog lanca; IgNAR, Ig novi antigenski receptori; sdAb, protutijelo s jednom domenom; VHH, varijabilna domena HCAb; VNAR, varijabilna domena IgNAR; PD-L1, programirana stanična smrt 1 ligand 1.

3.2.2. Nanotijela koja ciljaju fluorescentne proteine

Fluorescentni proteini promijenili su staničnu biologiju i biokemiju nudeći genski kodirane fluorescentne proteinske markere jednostavne za korištenje. Nekoliko sredstava za čvrsto vezivanje za istraživanje i ciljeve lijekova razvijeno je sintezom i odabirom biblioteka proteinskih skela tijekom paralelnog razvoja [52]. Primjer je razvoj nanotijela koje je lakše odabrati uz poboljšanu stabilnost, topljivost i prinos [53]. Za razliku od tradicionalnih antitijela, ova mala i stabilna nanotijela funkcionalna su u živim stanicama. Stoga je nanotijelo sa specifičnom aktivnošću vezanja na FP moćan alat za fuziju, odvajanje i stanični inženjering u različitim područjima bioloških istraživanja.

• Nanotijela dobivena iz Camelidae ciljaju GFP

Različiti proteini s izvrsnim karakteristikama subcelularne lokalizacije spojeni su s GFP-om, stvarajući vizualne antigene za otkrivanje proteina izravno u različitim substaničnim odjeljcima. Godine 2006. Rothbauer i sur. testirali su fragment antitijela specifičan za GFP (cAbGFP4) imuniziranjem alpake s GFP [54]. Test površinske plazmonske rezonancije (SPR) interakcije između cAbGFP4 i GFP antigena pokazao je visok afinitet (KD=0.23 nM). Osim toga, anti-GFP nanotijelo kombinirano je s monomernim RFP-om, proizvodeći vidljivo antitijelo koje veže GFP korišteno za ispitivanje distribucije anti-GFP nanotijela u živim stanicama. Gel filtracijom, imunoblotingom i konfokalnom mikroskopijom pokazalo se da je GFP-specifično nanotijelo stabilno raspoređeno u stanicama sisavaca bez detektabilne degradacije proteina ili agregacije koja se obično nalazi kod jednolančanih varijabilnih fragmenata. Nadalje, Kubala et al. karakterizirao je kompleks GFP:cAbGFP4 (Slika 4A) rendgenskom kristalografijom i izotermalnom titracijskom kalorimetrijom (ITC) [55], otkrivajući osnovu za visok afinitet i specifičnost nanotijela u vezivanju proteina. U 2020., četiri različita anti-GFP nanotijela, nazvana A12, B9, D5 i E6, identificirana su pomoću prikaza faga [56]. Nativni PAGE i imunoprecipitacijski testovi otkrili su da ta nanotijela mogu vezati GFP in vitro i in vivo.

Slika 4. Dijagram kompleksa GFP–nanotijelo. (A) cAbGFP4 (PDB:3OGO, narančasto); (B) GBP1 (PDB: 3K1K, svijetloplava); (C) GBP4 (PDB: 3G9A, ružičasta); (D) LaG16 (PDB: 6LR7, žuto); (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53, magenta). (F) Strukturna superpozicija gornjih nanotijela s GFP kompleksom. GFP je prikazan zelenom bojom.

Konformacija proteina usko je povezana s funkcijom i obično je kontrolirana regulatornim čimbenicima. Axel i sur. identificirali su sedam veziva specifičnih za GFP, naime GFP-vezujuće proteine ​​(GBP) 1-7 [57]. Među njima, GBP1 je povećao GFP fluorescenciju 10-puta, dok je GBP4 izazvao 5-struko smanjenje GFP fluorescencije; stoga su se oni nazivali "poboljšivači" odnosno "minimizatori". Strukturne analize kompleksa GFP-nanotijelo (Slika 4B, C) otkrile su da su dva nanotijela uzrokovala skromne suprotne promjene u kromoforskom miljeu, mijenjajući njegove karakteristike apsorpcije [58]. Nadalje, identificirano je 25 GFP-specifičnih nanotijela (LaGs), s KD vrijednostima u rasponu od 0.5 nM do preko 20 µM [59]. Dvovalentno nanotijelo (LaG-16-LaG-2) pokazalo je najveći afinitet, s vrijednošću KD od 36 pM. Štoviše, maksimalni intenzitet fluorescencije GFP-a povećao se za ~60% kada je inkubiran s viškom LaG proteina. Zhang i sur. objavio je kristalnu strukturu GFPuv kompleksiranog s LaG16 (Slika 4D) pri rezoluciji od 1,67 Å [60]. Vezno mjesto LaG16 na GFP cijevi nalazi se s druge strane GFP pojačivača. Stoga su LaG16 i GFP-pojačivač spojeni s (GS)4 povezivačem. Dvovalentno nanotijelo imalo je afinitet od 0,5 nM, što pokazuje izvedivost dizajniranja veziva ciljnih proteina ultra-visokog afiniteta dimerizacijom 2 nanotijela koja se vežu s različitim epitopima.

Godine 2014. Twair i sur. pripremio sfGFP i imunizirao odraslu jednogrbu devu. Izolirano je sedam anti-sfGFP nanotijela koja ciljaju tri epitopa (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 i 08) [61]. Na temelju ELISA testa i testova imunološkog blotinga, ova su nanotijela prepoznala sfGFP označen kao slobodan ili spojen s hormonom rasta. Nadalje, kristalna struktura nanotijela NbsfGFP02 kompleksiranog sa sfGFP (Slika 4E) utvrđena je pri razlučivosti od 2,2 Å. Interferometrijom biosloja (BLI) utvrđeno je da je afinitet između NbsfGFP02 i sfGFP 15,8 nM. Temperatura taljenja bila je 75,6 stupnjeva za NbsfGFP02 [62]; stoga je potencijalni kandidat za GFP nanotijela u aplikacijama koje zahtijevaju oštre uvjete testiranja. Većina nanotijela može se funkcionalno eksprimirati in vivo putem transfekcije plazmida u eukariotske stanice. Stoga su nanotijela izvrstan alat za prepoznavanje strukturnih ili dinamičkih značajki u živim stanicama. Godine 2020. Zhou i sur. predložio je novu metodu ekspresije konstruiranih GFP-vezujućih nanotijela (cAbGFP4) kao in vitro transkripcijske (IVT) mRNA, koja se naziva nanobody-mCherry [63]. MRNA s neprevedenim regijama i analozima s obrnutim poklopcem s kemijski modificiranim nukleotidima i poli(A) repom pripremljena je in vitro i korištena za transfekciju. Za razliku od nanotijela eksprimiranih pomoću plazmidne DNA, anti-GFP nanotijela eksprimirana pomoću IVT mRNA identificirana su unutar 3 sata od transfekcije i razgrađena unutar 48 sati. Stoga ekspresija kodirane mRNA nanotijela u živim stanicama omogućuje učinkovitu isporuku nanotijela.

• Nanotijela dobivena iz morskog psa ciljaju GFP.

Wei i sur. pokazali su da su bambusovi morski psi proizveli učinkovit imunološki odgovor protiv GFP imunizacije, karakteriziran povišenim brojem limfocita i antigen-specifičnim IgNAR-ima [64]. Ukupno je 7 anti-GFP nanotijela, uključujući BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 i 105, s afinitetom do 0,3 nM, izolirano iz imuniziranih bambusovih morskih pasa, što implicira da su bambusovi morski psi proizvodnju IgNAR-a visokog afiniteta. Osim toga, konstruirani su bi-paratopski VNAR-ovi s najvećim afinitetom prema GFP (20,7 pM), a karakter anti-GFP nanotijela kao intratijela potvrđen je u stanicama sisavaca. Ova otkrića će ubrzati istraživanje i napredak bambusovih morskih pasa sdAbs kako bi se dobila jeftina i laka za korištenje nanotijela za biomedicinsku industriju.

• Nanotijela usmjerena na druge fluorescentne proteine.

Masabi je svijetli monomerni zeleni fluorescentni protein. Li et al. uspješno su konstruirali biblioteku antitijela od 4 × 107 transformanata imunizacijom deva s mWasabijem kao antigenom i pregledali 3 nanotijela specifična za mWasabi visokog afiniteta, nazvana Nb4, Nb6 i Nb27 [65]. Ta su nanotijela prepoznala wasabi sam ili u kombinaciji s programiranom smrću 1 (PD-1). Identificirano je ukupno 6 nanotijela (LaM) koja ciljaju mCherry s visokom specifičnošću, s vrijednostima KD u rasponu od 0,18 nM do 63 nM [59]. Osim toga, izolirana su tri iRFP713-specifična nanotijela (BSR1, BSR3 i BSR4) s nanomolarnim afinitetima vezanja [64]. Ovi podaci sugeriraju da imunizacija bambusovih morskih pasa može proizvesti nanotijela visokog afiniteta. Sve u svemu, sposobnost nanotijela da vežu stanične proteine ​​i privuku FP fuzijske proteine ​​omogućuje preciznu kontrolu staničnih procesa i struktura u živim stanicama. Ova multifunkcionalna FP-nano zamka omogućuje mikroskopske, biokemijske i funkcionalne analize s jedinstvenom kombinacijom istog proteina. Nanotijela koja ciljaju FP sažeta su u tablici 3.

Tablica 3. Sažetak nanotijela koja ciljaju FP.

4. Primjena fluorescentnih proteinskih nanotijela

4.1. Primjene u detekciji proteina

4.1.1. Detekcija unutarstaničnih proteina

Razumijevanje funkcije proteina zahtijeva pouzdanu i mjerljivu lokalizaciju proteina visoke razlučivosti. Iako je upotreba protutijela za označavanje ciljanih proteina dobro uspostavljena u molekularnoj biologiji, ova tehnika je ograničena veličinom i multivalentnošću konvencionalnih protutijela. S obzirom na malu veličinu nanotijela, mogu se koristiti kao tragači za intracelularno oslikavanje nakon povezivanja s fluorescentnim molekulama, enzimima, peptidima, receptorima, biotinom i drugim lijekovima. Na primjer, nanotijela protiv FP-a korištena su u mikroskopskom oslikavanju visoke razlučivosti kada su označena organskim bojama [66,67]. Ptk2 stanice koje kontinuirano izražavaju tubulin YFP snimljene su ovim pristupom, a rezolucija je poboljšana na 269 ± 37 Å, za razliku od približno 450 Å s konvencionalnim antitijelima.

Označavanje posredovano nanotijelima nudi brzu i svestranu metodu za označavanje gotovo svake uobičajeno dostupne fuzijske strukture izvedene iz FP za sofisticiranu lokalizacijsku mikroskopiju jedne molekule (SMLM). Konkretno, dvobojni SMLM može istražiti subcelularnu lokalizaciju bilo kojeg funkcionalnog GFP i RFP fuzijskog konstrukta kada se nanotijela protiv GFP i RFP koriste istovremeno [68]. Stoga se brojni biološki problemi mogu brzo riješiti korištenjem dvobojnog SMLM snimanja. Ariotti i sur. predložio je modularni pristup za označavanje proteina temeljeno na enzimima, omogućavajući poboljšanu brzinu i uzorkovanje za analizu podstaničnih distribucija proteina u EM-rezoluciji [7]. Dizajniranjem GBP4 izravno na oznaku modificirane sojine askorbat peroksidaze (APEX), pokazano je da se APEX može usmjeriti na bilo koji protein označen GFP-om od interesa. Fuzija APEX-GBP4 pruža značajnu lokalizaciju proteina visoke rezolucije na poddomene organela i značajno skraćuje vrijeme za karakterizaciju distribucije substaničnih proteina. Nadalje, dopušta EM-rezoluciju GFP-obilježenih proteina izraženih na endogenim razinama.

Skupina alata plazmida koji kodiraju nanotijela specifična za FP stvorena je i spojena u funkcionalne module. Ovaj skup alata omogućuje vizualizaciju i manipulaciju unutarstaničnim signalnim putovima u živim stanicama, značajno proširujući njegovu upotrebu in vivo [9]. To uključuje fluorescentne senzore za dinamičku vizualizaciju Ca2+, H+ i ATP/ADP te oligomerne ili heterodimerne module koji omogućuju regrutiranje ili izolaciju proteina i prepoznavanje kontaktnih mjesta membrane između organela. Godine 2017. Herce i sur. koristio peptid koji prodire u stanicu (CPP) za prijenos protutijela izravno u stanice za imunološko označavanje i manipulaciju antigenom [69]. Konstruiran je sustav koji je iskoristio visok afinitet CPP-a bogatog cikličkim argininom prema RNA u nukleolu. Povezivanjem cikličkog CPP-a bogatog argininom s GFP nanotijelom, ponovna lokalizacija GFP-a u nukleolu može se izravno promatrati u stanicama (Slika 5A). Stoga se ovaj vizualizirani sustav može koristiti za praćenje lokacije proteina i kvantitativnu usporedbu učinkovitosti različitih CPP-ova.

Tehnika fluorescentnog rezonantnog prijenosa energije (FRET) naširoko se koristi u istraživanjima znanosti o životu jer omogućuje dinamičku detekciju signalnih molekula u stvarnom vremenu u fiziološkim uvjetima u živim stanicama. Zbog svoje iznimne osjetljivosti i specifičnosti, vremenski razlučna Försterova analiza rezonantnog prijenosa energije (TR-FRET) postaje sve popularnija u biomedicinskim istraživanjima. Metoda TR-FRET koja se temelji na nanotijelima omogućuje jednostavnu kvantifikaciju fluorescentnih (fuzijskih) proteina u lizatima s puno većom osjetljivošću od konvencionalnih očitanja intenziteta fluorescencije [70].

Slika 5. Primjena fluorescentnog proteinskog nanotijela. (A) Vizualizacija interakcija protein-protein. Anti-GFP nanotijelo (Nb) vezano za peptide koji prodiru u stanicu (CPP) može prodrijeti u jezgru stanice. Ako GFP-označeni protein ne stupa u interakciju s RFP-označenim proteinom, samo se GFP-označeni protein ponovno lokalizira u nukleolus preko Nb-CPP, pokazujući zelenu boju. Međutim, ako dva proteina stupaju u interakciju, oba se proteina ponovno lokaliziraju u nukleolus, pokazujući žutu boju. (B) GFP nanotijelo omogućuje selektivno označavanje novo egzocitoziranih proteina vezikula. Korak 1: Protein vezikula se veže na GFP i inkubira s nefluorescentnim nanotijelom (NbGFP), što rezultira nedostupnošću GFP-a s nanotijelom koje veže fluorescenciju (NbGFP*). Koraci 2 i 3: Nakon stimulacije stanične egzocitoze, novi protein vezikula je izložen plazma membrani i može se označiti pomoću NbGFP*. (C) Shematski prikaz degradiranog. Selektivna razgradnja proteina postiže se ubikvitinskim putem, koji provodi složeni niz enzima. F-box protein (FBP) u SKP1-CUL1-F-box kompleksima proteinske ligaze (SCFs) spojen je s anti-GFP nanotijelom (Nb) da prepozna GFP fuzijski protein, i enzim koji konjugira ubikvitin (E2) kovalentno povezuje više molekula ubikvitina s ciljnim proteinom. Nakon toga, poliubikvitinirani protein se razgrađuje pomoću proteasoma. (D) Shematski opis BiCAP-a. HER protein je spojen na N-terminalne (GFP1) ili C-terminalne (GFP2) fragmente GFP-a. Kada dvije fuzije formiraju dimer, GFP se ponovno savija i fluorescira. HER dimer i njegovi interagirajući proteini zatim se obogaćuju korištenjem GFP nanotijela, koje nema sposobnost vezanja za GFP fragmente i stoga omogućuje izolaciju dimera. (E) Transkripcijski sustav ovisan o GFP-u. DNA-vezujuća domena (DBD) i aktivacijska domena (AD) spojene su s GFP nanotijelom 1 (Nb1) odnosno GFP nanotijelom 2 (Nb2). U prisutnosti GFP-a, DBD-Nb1 i AD-Nb2 mogu aktivirati reporterski gen uzlazne aktivacijske sekvence (UAS), što dovodi do pojačane regulacije ciljnih gena. (F) Prepoznavanje GFP-obilježenih proteina na nanostrukturama DNA. DNA nanostrukture s dva vezna mjesta povezuju se na magnetsku smolu, vežu s GFP nanotijelom (Nb) komplementarnim sparivanjem baza, a zatim inkubiraju s GFP-obilježenim proteinima. Stoga se GFP-označeni proteini mogu točno pričvrstiti na nanostrukture.

Slika 5. Nast.

4.1.2. Detekcija proteina na površini stanice

Prikaz bakterijske površine je obećavajuća tehnologija za proizvodnju proteina usidrenih u stanici i dizajniranje katalizatora za cijelu stanicu. Iako se različiti proteini vanjske membrane koriste za površinski prikaz, nisu dostupne jednostavne, univerzalne i kompatibilne metode visoke propusnosti za procjenu i razvoj sustava površinskog prikaza. Osim toga, teško je razlikovati unutarstanične i površinski prikazane proteine. Wendel i sur. konstruirali su sustav za otkrivanje površinskog prikaza temeljen na fluorescenciji spajanjem GFP-nanotijela na sidra vanjske membrane [71]. Dva često korištena proteina vanjske membrane odabrana su kao sidra: protein A vanjske membrane (OmpA) i autotransporter (C-IgAP). Stoga se dva različita modula zaslona konstruiraju spajanjem OmpA ili C-IgAP s GFP-specifičnim nanotijelima, vizualiziranim dodavanjem pročišćenog GFP-a izvana. Iako se sam GFP može prikazati na površini stanice, ova nova metoda izbjegava problem lažno pozitivnih rezultata jer samo ako se GFP veže za nanotijelo koje se nalazi na površini stanice, stanice mogu proizvesti fluorescentni signal. Test je kompatibilan s mnogim metodama detekcije fluorescencije, uključujući detekciju fluorescencije cijele stanice na ploči, fluorescenciju u gelu, mikroskopiju i protočnu citometriju. Ova jeftina i lako čitljiva metoda površinskog prikaza pomoći će da se demonstrira transportni mehanizam proteina na površinu živih stanica, omogućujući racionalan razvoj bakterijskih površinskih sustava prikaza i robusnih biokatalizatora cijele stanice u budućnosti.

Oslobađanje neurotransmitera zahtijeva egzocitozu, endocitozu i stvaranje novih fuzijskih vezikula. Što se događa s proteinima vezikula nakon egzocitoze, kada ostanu na plazma membrani, slabo je poznato. Ovi proteini su često konjugirani na pH-osjetljive GFP dijelove (fluor). Budući da je slikanje pHfluorinom obično ograničeno difrakcijom mrlja nekoliko puta većih od vezikula, korištenje anti-GFP nanotijela za selektivno označavanje egzocitoziranih vezikula je dragocjeno [72]. Povezivanjem anti-GFP nanotijela s kemijskim fluoroforima prikladnim za snimanje u super rezoluciji, veličina i intenzitet proteina obilježenih pHfluorinom pod različitim uvjetima mogu se otkriti na načine koji nisu mogući samo s pHfluorinom. Nakon stimulacije egzocitoze, novi proteini vezikula izlažu se plazma membrani, a zatim će se fluorescentno obilježena nanotijela vezati s pHfluorinom (Slika 5B). Stoga je detekcija pHfluorina temeljena na nanotijelima obećavajući alat za proučavanje događaja nakon egzocitoze u neuronima.

4.2. Primjene u ciljanoj razgradnji proteinskih molekula

U usporedbi s uređivanjem gena i interferencijom RNA, izravna manipulacija biomolekulama na razini proteina je učinkovitiji put za proučavanje funkcije proteina, prevladavajući ograničenja kao što su potencijalni učinci izvan cilja, inaktivacija gena i gubitak bitne fenotipske funkcije gena. Ciljana razgradnja proteina trenutno je glavna istraživačka strategija za postizanje gubitka funkcije i proteolize proteina od interesa. Degradator proteina na bazi nanotijela može pomoći u postizanju brze razgradnje i reverzibilne regulacije proteina od interesa. Caussinus i sur. razvio je metodu razgradnje proteina za izravnu i brzu depleciju ciljnih GFP fuzijskih proteina u bilo kojem eukariotskom sustavu [73]. Ukratko, kako bi se srušio GFP fuzijski protein, anti-GFP nanotijelo spojeno je s F-box proteinom (FBP) u kompleksima E3 ligaze SKP1-CUL1-F-box proteina (SCF) prepoznati GFP fuzijski protein. Enzim koji konjugira ubikvitin (E2) kovalentno povezuje više molekula ubikvitina s ciljnim GFP fuzijskim proteinom. Nakon toga, SCF kompleks razgrađuje poliubikvitinirani protein; stoga je lako pratiti uklanjanje ciljnog proteina (Slika 5C). Ova tehnika, nazvana degradacija zelenog fluorescentnog proteina (deGradFP), korištena je za razgradnju GFP-a i njegove fuzije u stanicama sisavaca, embrijima zebrica [74] i biljkama [75].

4.3. Primjene u sustavu za pročišćavanje afiniteta bimolekularne komplementacije

Godine 2016. Croucher i sur. razvili su bimolekularni sustav za pročišćavanje afiniteta komplementacije (BiCAP) koji može učinkovito razlikovati dimer (homologni i heterologni) receptora humanog epidermalnog faktora rasta (HER) od monomera [76]. U ovom sustavu, dva komplementarna fragmenta FP molekule spojena su s dva HER proteina (HER1, HER2 ili HER3). Ova dva fragmenta ne mogu se spontano sastaviti u aktivne fluorescentne proteine. Međutim, pretpostavimo da dva HER proteina međusobno djeluju. U tom će slučaju dva fragmenta biti prostorno blizu jedan drugome i komplementarna, rekonstruirajući ih u potpuni i aktivni fluorescentni protein (Slika 5D). HER dimer i njegovi proteini u interakciji mogu se obogatiti korištenjem GFP nanotijela, koje nije imalo afiniteta za GFP fragmente, čime je omogućena izolacija i obogaćivanje dimera. Analizom identificiranih proteina otkriveno je da tri dimera (HER2:HER2, HER2:HER3 i HER1:HER2) imaju zajedničke proteine ​​u interakciji i svoj specifični interaktom. FAM59A, protein koji je specifično komunicirao s dimerom HER1:HER3, posredovao je u aktivaciji puta kinaze regulirane izvanstaničnim signalom, pružajući novu metu za terapiju raka dojke.

biljka cistanche koja jača imunološki sustav

4.4. Prijave u drugim područjima

Rana in vitro dijagnoza bolesti i praćenje terapijskih učinaka veliki je problem u dijagnostici bolesti. Idealno kontrastno sredstvo mora imati dobru penetraciju u tkivo, visok afinitet prema antigenu i sposobnost brzog uklanjanja s minimalnim oštećenjem normalnih tkiva. Nanotijela imaju potencijal kao idealna sredstva za oslikavanje koja mogu prijeći krvne žile i ući u tkiva za bolje oslikavanje i terapeutske primjene.

FP ne samo da osvjetljavaju stanice i biološke procese, već također čine izvrsne skele zbog očitog nedostatka veze s brojnim mrežama proteina domaćina. Koristeći GBP i GFP kao skelu za poticanje stvaranja biološki aktivnih kompleksa, Tang et al. stvorili su biblioteku hibridnih transkripcijskih faktora koji isključivo kontroliraju ekspresiju gena u prisutnosti GFP-a i njegovih derivata [77]. Proizvodnja GFP-a kontrolira ekspresiju stanično specifičnih gena (Slika 5E) i potiče disfunkciju mišje mrežnice i mozga. Osim toga, sojevi GFP transgenih miševa i zebrica modificirani su kako bi se postigla transkripcija ovisna o GFP-u za fotogenetičko praćenje neuronskih krugova. Ovaj rad utvrđuje poziciju GFP-a kao svestrane skele i otvara vrata selektivnoj manipulaciji različitim GFP-označenim stanicama u transgenim sojevima. Na temelju toga, drugi unutarstanični proizvodi također se mogu razviti kao stanično-specifične skele u višestaničnim organizmima.

Nanostrukture DNA postale su bitan i učinkovit alat za proučavanje aktivnosti enzima i funkcije proteina. Međutim, teško je razviti univerzalne strategije za formiranje proteinskih kompleksa na nanostrukturama DNA. Jedna od poteškoća je vezanje proteina od interesa na nanostrukture DNK. Sommese i sur. predložio je novi pristup označavanju nanostruktura DNA [78]. Njihovom funkcionalizacijom s GFP nanotijelom, sposobnost vezanja proteina može se precizno kontrolirati (Slika 5F). U usporedbi s GFP-specifičnim DNA aptamerima, nanotijela pokazuju veću specifičnost, stabilnost i afinitet prema GFP-u. Stoga je primjena nanostruktura DNA kao programabilne skele u biološkim istraživanjima dramatično pojednostavljena povezivanjem nanostruktura DNA s FP-ovima koji se obično nalaze u stanicama, razvojnoj biologiji i biokemiji proteina.

5. Rasprava o budućim izgledima

U usporedbi s tradicionalnim protutijelima, nanotijela imaju bolja fizikalna i kemijska svojstva te ih je lakše eksprimirati i pregledati. Nanotijela su mnogo jednostavnije strukture od konvencionalnih antitijela. Kodirani su jednim genom i mikroorganizmi ih mogu lako proizvesti, što značajno smanjuje troškove proizvodnje. Iako nanotijela predstavljaju napredak u istraživanju antitijela, neke probleme još treba riješiti. S jedne strane, njihov nedostatak je neprikladno rukovanje i visoka cijena imunizacije životinja. Nadalje, budući da su HCAb i IgNAR obilni u monocitima periferne krvi, nanotijela koja ciljaju FP antigene obično se pretražuju iz specifičnih biblioteka Camelidae ili imunoloških biblioteka morskih pasa. Uz sazrijevanje konstrukcije knjižnica i razvojnih tehnologija nanotijela, probir nanotijela specifičnih za FP iz sintetičkih biblioteka novi je smjer koji će prevladati neugodnosti imunizacije životinja, skratiti eksperimentalno razdoblje i značajno smanjiti troškove. S druge strane, iako je probir i ekspresija nanotijela relativno jednostavan, dobivanje FP nanotijela s potencijalnim vrijednostima primjene vrlo je kompliciran proces. Pregledom biblioteka nanotijela faga ne mogu se izbjeći lažno pozitivni rezultati uzrokovani vezanjem površine filamentoznog faga s antigenom, dok je mali kapacitet biblioteka nanotijela kvasca i bakterija još jedan težak problem u skriningu nanotijela.

Primjena nanotijela protiv FP nastavit će se povećavati u budućnosti. (1) S razvojem tehnologije unutarstaničnih antitijela postalo je dostupno otkrivanje unutarstaničnih molekula u živim stanicama. Nanotijela imaju jedinstvene prednosti u tom pogledu, u tome što (i) je nanotijelo malo, a učinkovitost ulaska u stanicu mnogo je veća od one tradicionalnih antitijela; i (ii) nanotijelo se može eksprimirati i djelovati u živim stanicama. (2) Bispecifično nanotijelo je vrsta umjetno modificiranog antitijela koje može specifično vezati dva različita antigena istovremeno. Može se lako konstruirati od monovalentnih nanotijela i eksprimirati u mikroorganizmima. Stoga nanotijela protiv FP-a pružaju široku mogućnost primjene za razvoj bispecifičnih nanotijela.

6. Zaključci

Ovaj rad daje pregled podrijetla, strukture i svojstava FP-a. Također su sažeti monoklonska protutijela i nanotijela usmjerena na FP i njihove primjene. Iako su antitijela vrijedan alat za prikazivanje bioloških komponenti u imobiliziranim stanicama, upotreba tradicionalnih antitijela u živim stanicama ograničena je neučinkovitim savijanjem i sastavljanjem njihovih varijabilnih teških i lakih lanaca. Izravna mikroinjekcija protutijela primarna je metoda koja se koristi u intracelularnoj primjeni protutijela, što je tehnički zahtjevno i stresno za stanice. Protutijela s jednom domenom dobivena iz deve ili morskog psa prepoznaju antigene kroz svoje varijabilne domene teških lanaca. Ova mala i stabilna nanotijela mogu se eksprimirati i djelovati u živim stanicama. Stoga će stvaranje nanotijela koja ciljaju FP-ove učiniti vrijednijima u biološkim istraživanjima.

Reference

1. Muyldermans, S. Nanotijela: prirodna protutijela s jednom domenom. Annu. Rev. Biochem. 2013, 82, 775–797. [CrossRef] [PubMed]

2. Helma, J.; Cardoso, MC; Muyldermans, S.; Leonhardt, H. Nanotijela i rekombinantna veziva u staničnoj biologiji. J. Cell Biol. 2015, 209, 633–644. [CrossRef] [PubMed]

3. Ashour, J.; Schmidt, FI; Hanke, L.; Cragnolini, J.; Cavallari, M.; Altenburg, A.; Brewer, R.; Ingram, J.; Postolar, C.; Ploegh, HL Intracelularna ekspresija devinih jednodomenskih protutijela specifičnih za nukleoprotein virusa influence otkriva različite značajke njegove nuklearne lokalizacije. J. Virol. 2015, 89, 2792–2800. [CrossRef] [PubMed]

4. Manglik, A.; Kobilka, BK; Steyaert, J. Nanotijela za proučavanje strukture i funkcije G protein-spregnutog receptora. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2017, 57, 19–37. [CrossRef]

5. Harmansa, S.; Hamaratoglu, F.; Affolter, M.; Caussinus, E. Dpp širenje je potrebno za medijalni, ali ne i za lateralni rast krilnog diska. Priroda 2015, 527, 317–322. [CrossRef]

6. Yamagata, M.; Sanes, JR Reporter – fuzije nanotijela (RANtijela) kao svestrani, mali, osjetljivi imunohistokemijski reagensi. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2018, 115, 2126–2131. [CrossRef]

7. Ariotti, N.; Hall, TE; Rae, J.; Ferguson, C.; McMahon, K.-A.; Martel, N.; Webb, RE; Webb, RI; Teasdale, RD; Parton, RG Modularno otkrivanje GFP-obilježenih proteina za brzi pregled putem elektronske mikroskopije u stanicama i organizmima. Dev. Ćelija 2015, 35, 513–525. [CrossRef]

8. Früholz, S.; Fäßler, F.; Kolukisaooglu, Ü.; Pimpl, P. Zaključavanje VSR-a izazvano nanotijelima otkriva ponovno učitavanje liganda u Golgiju. Nat. Komun. 2018, 9, 643. [CrossRef]

9. Prole, DL; Taylor, CW Genetski kodirani skup alata funkcionaliziranih nanotijela protiv fluorescentnih proteina za vizualizaciju i manipuliranje unutarstaničnim signaliziranjem. BMC Biol. 2019, 17, 41. [CrossRef]

10. Shimomura, O.; Johnson, FH; Saiga, Y. Ekstrakcija, pročišćavanje i svojstva Aequorina, bioluminescentnog proteina iz svjetlećeg hidromeduzana, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 1962, 59, 223–239. [CrossRef]

11. Prasher, D.; McCann, RO; Cormier, MJ Kloniranje i ekspresija cDNA kodiranja za aequorin, bioluminiscentni protein koji veže kalcij. Biochem. Biophys. Res. Komun. 1985, 126, 1259–1268. [CrossRef]

12. Heim, R.; Prasher, DC; Tsien, RY Mutacije valne duljine i posttranslacijska autooksidacija zelenog fluorescentnog proteina. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 1994., 91, 12501–12504. [CrossRef]

13. Matz, M.; Fradkov, AF; Labas, YA; Savitsky, A.; Zaraisky, AG; Markelov, ML; Lukyanov, SA Fluorescentni proteini iz nebioluminiscentnih vrsta Anthozoa. Nat. biotehnologija. 1999, 17, 969–973. [CrossRef]

14. Park, N.; Pjesma, J.; Jeong, S.; Tran, TT; Ko, HW; Kim, EY Kinaza 3 (VRK3) povezana s vakcinijom postavlja cirkadijalni period i amplitudu utječući na substaničnu lokalizaciju satnih proteina u stanicama sisavaca. Biochem. Biophys. Res. Komun. 2017., 487, 320–326. [CrossRef]

15. Zhao, D.; Xue, C.; Lin, S.; Shi, S.; Li, Q.; Liu, M.; Cai, X.; Lin, Y. Notch signalni put regulira angiogenezu putem endotelnih stanica u 3D modelu kokulture. J. Cell. Physiol. 2016, 232, 1548–1558. [CrossRef]

16. Rodriguez, EA; Campbell, RE; Lin, JY; Lin, MZ; Miyawaki, A.; Palmer, AE; Shu, X.; Zhang, J.; Tsien, RY Kutija alata za uzgoj i sjaj fluorescentnih i fotoaktivnih proteina. Trends Biochem. Sci. 2017., 42, 111–129. [CrossRef]

17. Yang, F.; Moss, LG; Phillips, GN, Jr. Molekularna struktura zelenog fluorescentnog proteina. Nat. biotehnologija. 1996, 14, 1246–1251. [CrossRef]

19. Ormö, M.; Cubitt, AB; Kallio, K.; Gross, LA; Tsien, RY; Remington, SJ Kristalna struktura zelenog fluorescentnog proteina Aequorea victoria. Znanost 1996, 273, 1392–1395. [CrossRef]

19. Reid, BG; Flynn, GC Stvaranje kromofora u zelenom fluorescentnom proteinu. Biokemija 1997, 36, 6786-6791. [CrossRef]

20. Zhang, G.; Gurtu, V.; Kain, SR. Poboljšani zeleni fluorescentni protein omogućuje osjetljivo otkrivanje prijenosa gena u stanicama sisavaca. Biochem. Biophys. Res. Komun. 1996, 227, 707–711. [CrossRef]

21. Pédelacq, J.-D.; Cabantous, S.; Tran, T.; Terwilliger, T.; Waldo, GS Inženjering i karakterizacija superfolder zelenog fluorescentnog proteina. Nat. biotehnologija. 2006, 24, 79–88. [CrossRef] [PubMed]

23. Crameri, A.; Whitehorn, EA; Tate, E.; Stemmer, WP Poboljšani zeleni fluorescentni protein molekularnom evolucijom korištenjem miješanja DNA. Nat. biotehnologija. 1996, 14, 315–319. [CrossRef] [PubMed]

23. Miura, H.; Inoko, H.; Inoue, I.; Tanaka, M.; Sato, M.; Ohtsuka, M. Jednostavna strategija kloniranja korištenjem GFPuv gena kao pozitivnog/negativnog indikatora. analno Biochem. 2011, 416, 237–239. [CrossRef] [PubMed]

24. Mena, MA; Treynor, TP; Mayo, SL; Daugherty, PS Plavi fluorescentni proteini s poboljšanom svjetlinom i fotostabilnošću iz strukturno ciljane biblioteke. Nat. biotehnologija. 2006, 24, 1569–1571. [CrossRef] [PubMed]

25. Ai, H.; Shaner, N.; Cheng, Z.; Tsien, RY; Campbell, RE Istraživanje novih struktura kromofora dovodi do identifikacije poboljšanih plavih fluorescentnih proteina. Biokemija 2007, 46, 5904–5910. [CrossRef]

26. Subach, OM; Gundorov, IS; Yoshimura, M.; Subach, FV; Zhang, J.; Grüenwald, D.; Souslova, EA; Chudakov, DM; Verkhusha, VV Pretvorba crvenog fluorescentnog proteina u svijetloplavu sondu. Chem. Biol. 2008, 15, 1116–1124. [CrossRef]

28. Merzlyak, E.; Goedhart, J.; Shcherbo, D.; Bulina, ME; Shcheglov, AS; Fradkov, AF; Gaintzeva, A.; Lukjanov, K.; Lukjanov, S.; Gadella, T.; et al. Jarko monomerni crveni fluorescentni protein s produljenim životnim vijekom fluorescencije. Nat. Metode 2007, 4, 555–557. [CrossRef]

28. Cubitt, AB; Heim, R.; Adams, SR; Boyd, AE; Gross, LA; Tsien, RY Razumijevanje, poboljšanje i korištenje zelenih fluorescentnih proteina. Trends Biochem. Sci. 1995, 20, 448–455. [CrossRef]

29. Tomosugi, W.; Matsuda, T.; Tani, T.; Nemoto, T.; Kotera, I.; Saito, K.; Horikawa, K.; Nagai, T. Ultramarin fluorescentni protein s povećanom fotostabilnošću i pH neosjetljivošću. Nat. Metode 2009, 6, 351–353. [CrossRef]

30. Goedhart, J.; van Weeren, L.; Hink, MA; Vischer, NOE; Jalink, K.; Gadella, TWJ Svijetlo cijan fluorescentne varijante proteina identificirane probirom fluorescentnog životnog vijeka. Nat. Metode 2010, 7, 137–139. [CrossRef]

31. Dan, RN; Davidson, MW Paleta fluorescentnih proteina: Alati za oslikavanje stanica. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 2887–2921. [CrossRef]

32. Griesbeck, O.; Baird, GS; Campbell, RE; Zacharias, DA; Tsien, RY Smanjenje osjetljivosti žutog fluorescentnog proteina na okoliš. J. Biol. Chem. 2001, 276, 29188–29194. [CrossRef]

33. Nagai, T.; Ibata, K.; Park, ES; Kubota, M.; Mikoshiba, K.; Miyawaki, A. Varijanta žutog fluorescentnog proteina s brzim i učinkovitim sazrijevanjem za stanično-biološke primjene. Nat. biotehnologija. 2002, 20, 87–90. [CrossRef]

34. Shaner, NC; Campbell, RE; Steinbach, PA; Giepmans, BN; Palmer, AE; Tsien, RY Poboljšani monomerni crveni, narančasti i žuti fluorescentni proteini izvedeni iz Discosoma sp. crveni fluorescentni protein. Nat. biotehnologija. 2004., 22, 1567–1572. [CrossRef]

36. Shcherbo, D.; Merzlyak, EM; Čepurnih, TV; Fradkov, AF; Ermakova, GV; Solovjeva, EA; Lukyanov, KA; Bogdanova, EA; Zaraisky, AG; Lukjanov, S.; et al. Svijetli dalekocrveni fluorescentni protein za snimanje cijelog tijela. Nat. Metode 2007, 4, 741–746. [CrossRef]

37. Shcherbo, D.; Murphy, CS; Ermakova, GV; Solovjeva, EA; Čepurnih, TV; Shcheglov, AS; Verkhusha, V.; Pletnev, VZ; Hazelwood, KL; Roche, PM; et al. Dalekocrvene fluorescentne oznake za prikaz proteina u živim tkivima. Biochem. J. 2009, 418, 567–574. [CrossRef]

37. Oliinyk, OS; Chernov, KG; Verkhusha, VV Bakterijski fitokromi, cijanobakteriokromi i alofikocijanini kao izvor bliskih infracrvenih fluorescentnih sondi. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1691. [CrossRef]

38. Šu, X.; Royant, A.; Lin, MZ; Aguilera, TA; Lev-Ram, V.; Steinbach, PA; Tsien, RY Ekspresija infracrvenih fluorescentnih proteina kod sisavaca proizvedenih iz bakterijskog fitokroma. Znanost 2009, 324, 804–807. [CrossRef]

39. Yu, D.; Gustafson, WC; Han, C.; Lafaye, C.; Noirclerc-Savoye, M.; Ge, W.-P.; Thayer, DA; Huang, H.; Kornberg, TB; Royant, A.; et al. Poboljšani monomerni infracrveni fluorescentni protein za oslikavanje neurona i tumora mozga. Nat. Komun. 2014, 5, 3626. [CrossRef]

40. Yu, D.; Baird, MA; Allen, JR; Howe, ES; Klassen, MP; Reade, A.; Makhijani, K.; Pjesma, Y.; Liu, S.; Murthy, Z.; et al. Prirodni monomerni infracrveni fluorescentni protein za označavanje proteina in vivo. Nat. Metode 2015, 12, 763–765. [CrossRef]

42. Shcherbakova, DM; Balaban, M.; Emelyanov, AV; Brenowitz, M.; Guo, P.; Verkhusha, VV Svijetli monomerni bliski infracrveni fluorescentni proteini kao oznake i biosenzori za višesmjerno oslikavanje. Nat. Komun. 2016, 7, 12405. [CrossRef] [PubMed]

42. Rodriguez, EA; Tran, GN; Gross, LA; Crisp, JL; Shu, X.; Lin, JY; Tsien, RY Dalekocrveni fluorescentni protein evoluirao je iz cijanobakterijskog fikobiliproteina. Nat. Metode 2016, 13, 763–769. [CrossRef] [PubMed]

43. Oliinyk, OS; Shemetov, AA; Pletnev, S.; Shcherbakova, DM; Verkhusha, VV Najmanji fluorescentni protein blizu infracrvenog zračenja razvio se iz cijanobakteriokroma kao svestrane oznake za spektralno multipleksiranje. Nat. Komun. 2019, 10, 279. [CrossRef]

44. Oliinyk, OS; Balaban, M.; Clark, CL; Carey, E.; Pletnev, S.; Nimmerjahn, A.; Verkhusha, VV Jednodomenski protein blizu infracrvenog zračenja pruža skelu za fluorescentna nanotijela ovisna o antigenu. Nat. Metode 2022, 19, 740–750. [CrossRef] [PubMed]

45. Tiller, KE; Tessier, PM Napredak u dizajnu antitijela. Annu. vlč. Biomed. inž. 2015, 17, 191–216. [CrossRef]

47. Gengyo-Ando, ​​K.; Mitani, S. 1020 Proizvodnja i karakterizacija monoklonskog antitijela protiv zelenog fluorescentnog proteina (GFP). Neurosci. Res. 1997, 28, S122. [CrossRef]

48. Zhuang, R.; Zhang, Y.; Zhang, R.; Pjesma, C.; Yang, K.; Yang, A.; Jin, B. Pročišćavanje GFP fuzijskih proteina visoke čistoće i prinosa kromatografijom na afinitetnoj koloni s monoklonskim protutijelima. Protein Expr. Purif. 2008., 59, 138–143. [CrossRef]

48. Ward, ES; Güssow, D.; Griffiths, AD; Jones, PT; Winter, G. Vezujuće aktivnosti repertoara pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina izlučenih iz Escherichia coli. Nature 1989, 341, 544–546. [CrossRef]

49. Hamers-Casterman, C.; Atarhouch, T.; Muyldermans, S.; Robinson, G.; Hammers, C.; Songa, EB; Bendahman, N.; Hammers, R. Prirodna antitijela bez lakih lanaca. Nature 1993, 363, 446–448. [CrossRef]

50. Greenberg, AS; Avila, D.; Hughes, M.; Hughes, A.; McKinney, EC; Flajnik, MF Nova familija gena za antigenske receptore koja prolazi kroz preuređivanje i opsežnu somatsku diverzifikaciju u morskih pasa. Nat. Cell Biol. 1995., 374, 168–173. [CrossRef]

51. De Meyer, T.; Muyldermans, S.; Depicker, A. Proizvodi temeljeni na nanotijelima kao alati za istraživanje i dijagnostiku. Trendovi Biotehnologija. 2014, 32, 263–270. [CrossRef]

52. Skerra, A. Alternativne skele bez protutijela za molekularno prepoznavanje. Curr. Opin. biotehnologija. 2007., 18, 295–304. [CrossRef]

53. Muyldermans, S.; Baral, T.; Retamozzo, VC; De Baetselier, P.; De Genst, E.; Kinne, J.; Leonhardt, H.; Magez, S.; Nguyen, V.; Revets, H.; et al. Kamelidni imunoglobulini i tehnologija nanotijela. Veter. Immunol. Immunopathol. 2009., 128, 178–183. [CrossRef]

54. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Tillib, S.; Nowak, D.; Schermelleh, L.; Gahl, A.; Backmann, N.; Conrath, K.; Muyldermans, S.; Cardoso, MC; et al. Ciljanje i praćenje antigena u živim stanicama s fluorescentnim nanotijelima. Nat. Metode 2006, 3, 887–889. [CrossRef]

56. Kubala, MH; Kovtun, O.; Aleksandrov, K.; Collins, BM. Strukturna i termodinamička analiza GFP-a: kompleks GFP-nanotijelo. Protein Sci. 2010, 19, 2389–2401. [CrossRef]

57. Očnjak, Z.; Cao, D.; Qiu, J. Razvoj i proizvodnja nanotijela posebno protiv zelenog fluorescentnog proteina. Appl. Microbiol. biotehnologija. 2020, 104, 4837–4848. [CrossRef]

58. Kirchhofer, A.; Helma, J.; Schmidthals, K.; Frauer, C.; Cui, S.; Karcher, A.; Pellis, M.; Muyldermans, S.; Casas-Delucchi, CS; Cardoso, MC; et al. Modulacija svojstava proteina u živim stanicama pomoću nanotijela. Nat. Struktura Mol. Biol. 2009, 17, 133–138. [CrossRef]

59. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Muyldermans, S.; Schepers, A.; Cardoso, MC; Leonhardt, H. Svestrana nanozamka za biokemijske i funkcionalne studije s fluorescentnim fuzijskim proteinima. Mol. Ćelija. Proteom. 2008, 7, 282–289. [CrossRef]

60. Fridy, P.; Li, Y.; Keegan, S.; Thompson, MK; Nudelman, I.; Scheid, JF; Oeffinger, M.; Nussenzweig, MC; Fenyö, D.; Chait, BT; et al. Robusni cjevovod za brzu proizvodnju svestranih repertoara nanotijela. Nat. Metode 2014, 11, 1253–1260. [CrossRef]

60. Zhang, Z.; Wang, Y.; Ding, Y.; Hattori, M. Inženjering temeljen na strukturi tandema anti-GFP nanotijela kao reagensa ultra visokog afiniteta za pročišćavanje. Sci. Rep. 2020, 10, 6239. [CrossRef]

61. Twair, A.; Al-Okla, S.; Zarkawi, M.; Abbady, AQ Karakterizacija devinih nanotijela specifičnih za superfolder GFP fuzijske proteine. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 6887–6898. [CrossRef] [PubMed]

62. Zhong, P.; Wang, Z.; Cheng, S.; Zhang, Y.; Jiang, H.; Liu, R.; Ding, Y. Strukturalni uvidi u dva različita nanotijela koja prepoznaju isti epitop zelenog fluorescentnog proteina. Biochem. Biophys. Res. Komun. 2021, 565, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

63. Zhou, X.; Hao, R.; Chen, C.; Su, Z.; Zhao, L.; Luo, Z.; Xie, W. Brza dostava nanotijela/VHH u žive stanice putem ekspresije in vitro transkribirane mRNA. Mol. Ther.-Methods Clin. Dev. 2020, 17, 401–408. [CrossRef] [PubMed]

64. Wei, L.; Wang, M.; Xiang, H.; Jiang, Y.; Gong, J.; Su, D.; Al Azad, MAR; Dong, H.; Feng, L.; Wu, J.; et al. Bambusov morski pas kao mali životinjski model za proizvodnju protutijela s jednom domenom. Ispred. bioinž. biotehnologija. 2021, 9, 792111. [CrossRef]

65. Li, S.; Shan, H.; Wang, T.; Zheng, X.; Shi, M.; Chen, B.; Lu, H.; Zhang, Y.; Zhao, S.; Hua, Z. Generacija mWasabi fluorescentnih protein-vezujućih nanotijela. analno Biochem. 2020, 608, 113875. [CrossRef]

66. Ries, J.; Kaplan, C.; Platonova, E.; Eghlidi, HM; Ewers, H. Jednostavna, svestrana metoda za mikroskopiju super-razlučivosti temeljenu na GFP-u putem nanotijela. Nat. Metode 2012, 9, 582–584. [CrossRef]

67. Beghein, E.; Gettemans, J. Tehnologija nanotijela: Svestrani alat za mikroskopsko oslikavanje, analizu interakcija protein-protein i istraživanje funkcije proteina. Ispred. Immunol. 2017, 8, 771. [CrossRef]

69. Platonova, E.; Zimska poplava, CM; Junemann, A.; Albrecht, D.; Faix, J.; Ewers, H. Jednomolekulska mikroskopija molekula označenih GFP ili RFP derivatima u stanicama sisavaca pomoću veziva nanotijela. Metode 2015, 88, 89–97. [CrossRef]

69. Herce, HD; Schumacher, D.; Schneider, AF; Ludwig, AK; Mann, FA; Fillies, M.; Kasper, M.-A.; Reinke, S.; Krause, E.; Leonhardt, H.; et al. Nanotijela propusna za stanice za ciljano imunoobilježavanje i manipulaciju antigenom u živim stanicama. Nat. Chem. 2017, 9, 762–771. [CrossRef]

70. Payne, NC; Mazitschek, R. Sićušni titani: Nanotijela kao moćni alati za razvoj TR-FRET testa. analno Sens. 2022, 2, e202200020. [CrossRef]

72. Wendel, S.; Fischer, EC; Martínez, V.; Seppälä, S.; Nørholm, MHH Nanotijelo: GFP bakterijska platforma koja omogućuje funkcionalni prikaz enzima i jednostavnu kvantifikaciju kapaciteta prikaza. Microb. Cell Factories 2016, 15, 71. [CrossRef]

73. Seitz, KJ; Rizzoli, SO GFP nanotijela otkrivaju nedavno egzocitozirane molekule pHfluorina. Sci. Rep. 2019, 9, 7773. [CrossRef]

73. Caussinus, E.; Kanca, O.; Affolter, M. Knockout fluorescentnog fuzijskog proteina posredovanog anti-GFP nanotijelima. Nat. Struktura Mol. Biol. 2011, 19, 117–121. [CrossRef]

74. Shin, YJ; Park, SK; Jung, YJ; Na Kim, Y.; Kim, KS; Park, OK; Kwon, S.-H.; Jeon, SH; Trinh, LA; Fraser, S.; et al. Kompleks E3-ubikvitin ligaze usmjeren na nanotijelo razgrađuje nuklearne proteine. Sci. Rep. 2015, 5, 14269. [CrossRef]

75. Baudisch, B.; Pfort, I.; Sorge, E.; Conrad, U. Specifična razgradnja proteina usmjerena nanotijelima putem 26S-proteasoma u biljkama. Ispred. Plant Sci. 2018, 9, 130. [CrossRef]

76. Croucher, DR; Iconomou, M.; Hastings, JF; Kennedy, SP; Han, JZR; Shearer, RF; McKenna, J.; Wan, A.; Lau, J.; Aparicio, S.; et al. Pročišćavanje afiniteta bimolekularne komplementacije (BiCAP) otkriva dimer-specifične proteinske interakcije za ERBB2 dimere. Sci. Signal. 2016, 9, 436. [CrossRef]

77. Tang, JC; Szikra, T.; Kozorovitskiy, Y.; Teixeira, M.; Sabatini, BL; Roska, B.; Cepko, CL Sustav temeljen na nanotijelima koji koristi fluorescentne proteine ​​kao skele za manipulaciju genima specifičnim za stanice. Cell 2013, 154, 928–939. [CrossRef]

78. Sommese, RF; Hariadi, RF; Kim, K.; Liu, M.; Tyska, MJ; Sivaramakrishnan, S. Uzorak proteinskih kompleksa na nanostrukturama DNA pomoću GFP nanotijela. Protein Sci. 2016, 25, 2089–2094. [CrossRef]