Istraživanje o antidepresivima i mehanizmima Cistanche feniletanol glikozida kod miševa
Dec 17, 2024
Sažetak:
Ova studija ima za cilj istražiti terapijske učinke i mehanizmeCistanche feniletanol glikozidi(CPHG) o ponašanju nalik depresiji izazvano kroničnim nepredvidivim blagim stresom (Cums) kod miševa. Miševi su nasumično podijeljeni u kontrolnu skupinu, grupu modela, grupu CPHGS visoke doze (700 mg/kg), grupu CPHG -a u srednjoj dozi (350 mg/kg), grupu CPHG -a s malim dozama (175 mg/kg) i skupinu fluoksetina (15 mg/kg). Nakon četiri tjedna odgovarajuće intervencije lijeka, provedena su neurobehevioralna ispitivanja; Imunosorbentni test vezan za enzim korišten je za otkrivanje razine neurotransmitera u serumu, kao i sadržaj upalnih faktora i posrednika u hipokampalnom tkivu. Za promatranje patoloških promjena u hipokampalnom tkivu korišteno je bojenje hematoksilinom-eozinom i NISSL. Metode imunohistokemije i imunofluorescencije korištene su za analizu gustoće astrocita i mikroglije u hipokampalnom tkivu miševa, kao i razine ekspresije receptora 4/nuklearnog faktora κB/NILE-NILE-NISKE receptora proteina 3 (TLR4/NF-κB/NLRP/NLRP/NLRP/NLRP/NLRP/NLRP/NLRP/NLRP/NLRP. Rezultati su pokazali da CPHG-ovi mogu poboljšati ponašanje nalik depresiji kod miševa, povećati sklonost slatkoj vodi i smanjiti vrijeme nepokretnosti, značajno povećavajući razinu serotonina i dopamina u mišjem serumu, istovremeno inhibirajući ekspresiju upalnih medijatora i faktora u hipokampusu. Imunohistokemijska analiza pokazala je da CPHG-ovi mogu povećati gustoću astrocita u hipokampusu, smanjiti aktivaciju mikroglije i inhibirati ekspresiju proteina povezanih s NLRP3 upalama. Imunofluorescentni eksperimenti pokazali su da mehanizam putem kojeg CPHG-ovi smanjuju formiranje upala je smanjenjem aktivacije signalnog puta TLR4/NF-κB u hipokampalnom tkivu. Ukratko, CPHG pokazuju značajne antidepresivne učinke naCums-inducirana depresija poput ponašanja, potencijalno regulacijom razine neurotransmitera i inhibicije neuroinflamalnih odgovora, pružajući eksperimentalne dokaze za njegovu primjenu u liječenju depresije.
Ključne riječi: Cistanche feniletanol glikozidi; depresija; neuroinflamatorni odgovor; astrociti; TLR4/NFκB/NLRP3
Depresija je čest i složen afektivni mentalni poremećaj koji karakterizira simptomi poput slabog raspoloženja, anhedonije, sporog razmišljanja i fiziološke disfunkcije. U teškim slučajevima mogu se pojaviti samoubilačke tendencije [1]. Prema "Izvješće o statusu prehrane i kronične bolesti kineskih stanovnika (2020.)", rasprostranjenost depresije u mojoj zemlji dosegla je 2,1%, a Svjetska zdravstvena organizacija je nabrojala kao jednu od bolesti s najvišim stopama invalidnosti na svijetu [2]. Budući da je patogeneza depresije vrlo složena, specifični mehanizam do danas ostaje nejasan, što predstavlja ogroman izazov za njegovo liječenje. Posljednjih godina, domaći i strani učenjaci otkrili su da depresija može biti usko povezana s imunološkom aktivacijom. U procesu aktivacije upalnog odgovora u središnjem živčanom sustavu, aktivacija upalnih stanica hipokampa je njegova karakteristična manifestacija. Kontinuirano aktivirane upalne stanice hipokampa induciraju oslobađanje višestrukih upalnih citokina, formirajući upalni citokin "kaskadni učinak", sudjelujući u patogenezi i patološkom procesu mentalnih bolesti poput depresije [3]. Trenutno se liječenje ove bolesti uglavnom oslanja na zapadnu medicinu, poput fluoksetina, venlafaksina, duloksetina, itd. Međutim, postoje nedostaci poput niske stope kliničkog izlječenja, istaknutih rezidealnih simptoma, visoke stope ponavljanja i lako uzrokovati disfunkciju organa, što ograničava kliničku primjenu [4]. Tradicionalna kineska medicina ima prednosti više ciljeva i manje nuspojava u liječenju emocionalnih bolesti i ima široke izglede za primjenu u liječenju depresije i njegovih komplikacija [5].
Pustinaje sušena mesnata stabljika s lišćem fosfora Cistanche Deserticola YCMA i/ili Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight, a obje su biljke obitelji Orobanchaceae. To je dobar proizvod za hranu i lijekove. Moderna farmakološka istraživanja potvrdila su da Cistanche Deserticola ima neuroprotektivni učinak (može inhibirati Alzheimerovu bolest, Parkinsonovu bolest itd.). Kapsule "Cistanche Total glikozida", koje se uglavnom sastoje od feniletanolnih glikozida u Cistanche deserticola, široko se koriste u liječenju neuroloških bolesti [6]. Feniletanol glikozidi (CPHG) važni su aktivni sastojci u ukupnim glikozidima Cistanche. Imaju više bioloških funkcija kao što su anti-tumor, imunomodulacija i antioksidans, te pokazuju dobre izglede za primjenu [7]. Prethodne studije pokazale su da CPHG -ovi mogu zaštititi učinke monoamina i ublažiti depresivne simptome povećanjem metaboličkog puta ceramida u supstanci nigra i sadržaja dopamina (DA) u striatumu [8]; Također može prilagoditi depresivno ponašanje miševa s sindromom perimenopauze poboljšavajući razinu monoaminskih neurotransmitera u mozgu [9]. Međutim, nije bilo izvještaja o njegovoj upotrebi u liječenju kroničnog nepredvidivog blagih stresa (CUMS) izazvanog modelu depresije miša, a njegov mehanizam djelovanja ostaje da se razjasni. Na temelju prethodnih istraživanja i u kombinaciji s trenutnim potencijalom CPHG-a u antioksidativnom stresu, regulirajući neuroinflamaciju i inhibirajući apoptozu neurona, ovo je istraživanje koristilo model depresije izazvanog Cums-induciranim za proučavanje antidepresiva CPHG-a i mehanizma za poboljšanje TLR4/NF-NLRP/NLRB/NLRB/NLRB/NLRB/NLRB/NLRB/NLRB/NLRB/NLRB. Antidepresivni učinak CPHG -a, proširivši njegovu kliničku primjenu, razvijanje i korištenje kao zdravu hranu.
1 Materijali i metode
1.1 Materijali i instrumenti
CPHGS ekstrakt (feniletanol glikozidi u ekstraktu većim ili jednakim 85%, uključujući ehinakozid veći ili jednak 40%, verbaskozid veći od ili jednak 16%; serijski broj: 20231221, Xinjiang Hotan Dichen Farmaceutički biološki Co., LTD.) Fluoksetin hidrokloridne kapsule (fluoksetin, flx) (šarži: 8533c, Patheon France Pharmaceutska kompanija, Francuska); 5- hidroxytryptamine ({5- ht), Da detection Kit (serijski broj: 20240305, 20240305, Shanghai Future Industrial Co., Ltd.); Inducibilna sintaza dušičnog oksida (iNOS), ciklooksigenaza -2 (ciklooksigenaza {-2, cox -2), prostaglandin E2 (prostaglandin E2, PGE2), tumorski faktor (tumRal NecRa (tumRur (interleukin -1, il -1), il -18 (interleukin -18, il -18), il -6 (interleukin 6, interleun {) enzyme-linked immunosorbent assay kits (Batch No.: ER050A332132, ER035PD09812, ER048H753146, ER10X6398452, ER051H648219, ER09X2865471, ER049H746823, ER07X1729784, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Ionizirana molekula adaptera 1 (Molekula adaptera za vezanje ioniziranog kalcija molekula 1, iba -1) monoklonsko antitijelo, glijalno fibrilarni kiseli protein (GFAP) Monoklonalno antitijelo (BASLIBOLY PROTEIN 3), NLOCLONA Gr 3379124-30, Gr 3285067-28, Abcam, UK); Toll-sličan receptor 4 (TLR4) monoklonsko antitijelo, fosforilirani nuklearni faktor-κB p65 (fosfo-nuklearni faktor-κB p65, P-NF-κB p65) monoklonsko antitijelo (serija br. 10032512, 00128965, WuhhnnAnnAnnAnn Sawyng Sawyng Sawyngyngyngyyng Sawyngyyng Sawyng Sawyng Sandhnn. 4% paraformaldehid, komplet za bojenje imunofluorescencije (serija br. 20240106, 20240315, Shanghai Bio-Technology Co., Ltd.); Hematoksilin i Eosin (Hexa) Eozin, HE) Kit za bojenje, Nissl Kit za bojenje (serijski broj: 20240401, 20240402, Liaoning Meilun Biology); Univerzalni komplet imunohistokemije (serijski broj: 43731A, Peking Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.).
Me2 0 4e 1/10, 000 elektronička ravnoteža (Mettler Toledo, USA); Milli-Q Laboratorijski čisti vodeni sustav (Merck, Njemačka); Spectramax ID3 višenamjenski čitač mikroploča (Molecular Devices, USA); Leicadm 2000 fluorescentna uspravni mikroskop (Leica, Njemačka); 63008 Otvoreno polje, 63010 povišeni plus labirint, 63022 prisilno plivanje, DB001 Morris Water Maze, Smart 3.0 Sustav video analiza ponašanja životinja (Shenzhen Ruiwode Life Science Technology Co., Ltd.).
60 SPF C57BL/6 miševa, vaganje 18-22 g, kupljeni su od Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. (Proizvodna dozvola br. SCXK (Beijing) 2020-0033, Eksperimentalna licenca za upotrebu životinja br.
Miševi su se držali u SPF okruženju, a temperatura okoline kontrolirana je na (21 ± 2) stupnju, vlaga održavana na 60% ± 10% i ciklus od 12 h laganog tamnog. Miševi su imali slobodan pristup hrani i vodi, a eksperiment je počeo nakon 1 tjedna adaptivnog hranjenja. Eksperimentalne životinje čuvale su se u eksperimentalnom centru za životinje na Sveučilištu kineske medicine Sveučilišta Shaanxi. Sve eksperimentalne postupke miša u ovoj studiji odobrilo je Etičko povjerenstvo za eksperiment na životinjama sa Sveučilišta za kinesku medicinu Sveučilišta Shaanxi (SucMDL20231015003).
1.2 Eksperimentalne metode
1.2.1 Upravljanje grupiranjem, modeliranjem i lijekovima
Nakon 1 tjedna adaptivnog hranjenja 7- tjedana stare SPF C57BL/6 miševa, neelastični miševi koji su udovoljili zahtjevima sljedećih eksperimenata pregledani su putem testa preferencije šećerne vode i nasumično podijeljeni u grupu modela (CON), srednjoškolska skupina (mod), CPHGS HGGS CGGS (CGGS CGS CGS; (CPHGS-M; 350 mg/kg), grupa CPHGS s malim dozama (CPHGSL; 175 mg/kg) i fluoksetin grupa (FLX; 15 mg/kg), s 10 miševa u svakoj skupini. Osim CON -a, miševi u ostalim skupinama počeli su se podvrgnuti cums stresu 4 tjedna [10]. Ukupno je korišteno 10 stresora, uključujući suzdržanost (1 h), tresenje (1 h), repni suspenzija (1 h), {45- naginjanje kaveza (24 h), vlažna posteljina (24 h), prazan kavez (24 h), noćna rasvjeta (12 h), 41 stupnjeva plivanja na 5 min, 4 minute, i 5 min, i 4 min, i 4 min, i 4 min, i 4 min, i 4 minute, i 4 min, i 4 min, i 4 min, i 4 min, i 4 min, i 4 min. Dva podražaja nasumično su odabrana svaki dan, a isti se podražaj nije pojavio u dva uzastopna dana. Nakon 4 tjedna modeliranja, CPHGS-H, CPHGS-M i CPHGS-L miševi dobili su odgovarajuće doze CPHG-a pomoću gavage u skladu s tjelesnom težinom, a FLX miševi dobili su fluoksetin gavageom (10 mg/kg). Doza CPHGS-M i FLX kod miševa pretvorena je prema ekvivalentnom koeficijentu površine tijela između odraslih i miševa, a fluktuacija 2 puta bila je niske i visoke doze CPHG-a. CON i MOD miševi dobili su jednak volumen deionizirane vode gavageom. Miševi su se zvali jednom dnevno 4 tjedna. Neurobehevioralni testovi provedeni su 8. tjedna.
1.2.2 Neurobehevioralni eksperiment
1.2.2.1 Eksperiment preferencije šećerne vode
Prije ispitivanja preferencije saharoze (SPT), miševi trebaju biti smješteni u jednom kavezu, a zatim prilagođeni šećernoj vodi 3 dana. Prvog dana, dvije boce od 1% vode saharoze dane su 24 sata, a drugog dana jedna boca šećerne vode i jedna boca deionizirane vode dobila je 24 sata. Trećeg dana, položaji šećerne vode i čiste vode izmjenjivali su se 24 sata, a eksperiment je završio 24 sata kasnije. Četvrtog dana miševi su postigli i lišeni vode 24 sata. Petog dana, jedna boca šećerne vode i jedna boca čiste vode dana su nakon vaganja, a položaji su izmjenjeni nakon 12 sati. Nakon 24 sata, dvije su boce izvađene i izvagane, a izračunana je brzina potrošnje šećerne vode (brzina potrošnje šećerne vode {= Konzumiranje šećerne vode/(Potrošnja šećerne vode + potrošnja vode) × 100%).
1.2.2.2 test otvorenog polja
Ispitivanje otvorenog polja (OFT) proveden je u otvorenoj kutiji od 50 cm × 50 cm × 50 cm. Sredina kutije definirana je kao kvadrat sa bočnom duljinom od 25 cm. Miševi su smješteni u sredinu kutije i ostavljeni da se prilagode 5 minuta. Putanje pokreta miševa analizirana je u posljednjih 5 minuta. Pokazatelji evaluacije uključivali su ukupnu udaljenost miševa miševa u otvorenom polju, vrijeme aktivnosti u središtu otvorenog polja i koliko su puta ušli u sredinu. 1.2.2.3 Ispitivanje repnog ovjesa Test repnog ovjesa (TST) je suspendiranje miša repom tako da se glava drži na određenoj udaljenosti od zemlje. Zabilježena je borba miševa u roku od 6 minuta, a analizirano je vrijeme nepokretnosti miševa u posljednja 4 min.
1.2.2.4 test prisilnog plivanja
Ispitivanje prisilnog plivanja (FST) je stavljanje miševa u prozirnu cilindričnu bačvu (visina promjera 15 cm × 50 cm) napunjenom vodom (25 ± 2) stupnjeva, a razina vode doseže 20 cm. Zabilježeno je borbu protiv miševa u vodi u roku od 6 minuta, a analizirano je vrijeme nepokretnosti miševa u posljednja 4 min.
1.2.3 prikupljanje uzoraka
Na kraju 8. tjedna, miševi su duboko anestezirani intraperitonealnom ubrizgavanjem natrijevog pentobarbitala (3%, 10 ml/kg). Nakon anestezije, stanje anestezije potvrđeno je promatranjem sporog disanja, opuštanja mišića i nikakvog odgovora na kiruršku operaciju. Zatim je krv miševa prikupljena uklanjanjem očiju, a miševi su ubijeni dislokacijom grlića maternice. Srce je prožimalo fiziološkom otopinom, a onda je mozak brzo otvoren i uklonjen je netaknuti mozak. Ispran je unaprijed hlađenom fiziološkom otopinom, a polovica je bila fiksirana 4% paraformaldehida 72 h; Hipokampalno tkivo druge polovice razdvojeno je na ledu i pohranjeno u tekućem dušiku za kasniju uporabu. Uzmite 10 mg uzorka tkiva hipokampa miša, dodajte unaprijed hlađenu fiziološku fiziološku otopinu u omjeru masovnog volumena od 1: 9 i mehanički homogenizirajte u kupelji ledene vode. Nakon homogenizacije, centrifuga na 4 000 r/min tijekom 15 minuta (centrifugalni polumjer 4,5 cm), prikupite supernatans za otkrivanje.
1.2.4 Određivanje indeksa neurotransmitera
Uzmite odgovarajuću količinu mišjeg seruma i hipokampalnog tkiva homogenatnog supernatanta i otkrijte sadržaj sadržaja 5- ht i dA prema metodi operacije kompleta.
1.2.5 Određivanje biokemijskog indeksa hipokampa
Uzmite supernatant homogenata hipokampalnog tkiva i upotrijebite BCA komplet za određivanje koncentracije proteina. Prema uputama kompleta, apsorpcija A upalnih posrednika (iNOS, cox -2 i pge2) i upalnih faktora (tnf, il -1, il -18, il {4}, ifN-ifN-ifN-i) u Suppnatu Oznaka i sadržaj svake tvari se izračunava, a podaci se bilježe i statistički analiziraju.
1.2.6 Bojenje hipokampalnog tkiva
Uzorci cijelog mozga tkiva fiksirani više od 72 h i izrađeni su parafinski presjeci s debljinom od 4 µm. Nakon što su dewaxeli s ksilenom, uzorci su hidrirani s gradijentnim etanolom (uronjeni u 100% etanol I i II tijekom 5 min, i u 95%, 90%, 80% i 70% etanol tokom 2 minute), a tri puta su se oprali s PBS -om, obojenim s Eos -om, s Eos -om, rangiranim za 5 min, raščad u TAP -u. Kiseli etanol u trajanju od 2 s, i isprana u vodi iz slavine 10 min. Dehidrirani s gradijentnim etanolom (80% etanol 2 minute, 95% etanola tijekom 2 minute, etanol I i 100% etanol II tijekom po 5 min), proziran s ksilenom, zapečaćen neutralnom gumom i sušenim zrakom. Morfološke promjene stanica hipokampalnih tkiva u svakoj skupini miševa primijećene su pod mikroskopom.
1.2.7 Nissl bojenje hipokampalnog tkiva
Odjeljci parafina pripremljeni pod "1.2.5" su dewaksini i hidrirani, zatim obojeni otopinom bojenja NISSL-a 10 minuta, isprani dva puta destiliranom vodom 3 minute svaki put, dehidrirani gradijentnim etanolom (80% etanol za 2, 95% etanol, s po 2 min, etanol i etanol i ii. Morfološke promjene stanica hipokampalnih tkiva u svakoj skupini miševa primijećene su pod mikroskopom.
1.2.8 Imunohistokemija hipokampalnog tkiva
Uzorci hipokampalnog tkiva ugrađenih parafinom obrađeni su bojenjem imunohistokemije (IHC) prema uputama univerzalnog kompleta imunohistokemije. Nakon dewaksiranja, hidratacije, popravljanja antigena, blokiranja peroksidaze i blokiranja, IBA -1 (1: 400), GFAP (1: 400), LRP31: 300) i CASPSAE1 (1: 400) primarna antitijela su dodana i inkubirana preko noći u 4 stupnja. Nakon razvoja boje DAB -a, nuklearno bojenje, dehidraciju i brtvljenje, pozitivan izraz IBA1, GFAP, NLRP3 i Caspsae -1 primijećen je pod laganim mikroskopom i slike su analizirane slikom J.
1.2.9 Otkrivanje imunofluorescencije tkiva hipokampa
Uzorci hipokampalnog tkiva ugrađenih parafinom obrađeni su imunofluorescentnim bojenjem prema uputama imunofluorescentnog kompleta. Parafinski presjeci pripremljeni pod "1.2.5" su devaksirani, hidratizirani, popravljeni antigen i blokirani, a zatim su TLR4 (1: 400) i P-NF-κB p65 (1: 200) primarna antitijela dodana u dijelove i inkubirana preko noći na 4 stupnja. Primarno antitijelo uklonjeno je sljedeći dan, isprano tri puta s PBS -om, a sekundarno antitijelo (1: 500) dodano je i inkubirano u mraku 1 sat. Nakon pranja tri puta, presjeci su zapečaćeni fiksativom koji sadrži DAPI. Fluorescentna mikroskopija primijećena je fluorescentna signal fluorescentne mikroskopije, a slike su analizirane slikom J.
1.3 Obrada podataka
Eksperimentalni podaci statistički su analizirani pomoću statističkog softvera SPSS 26. 0 i GraphPad Prism 9. 0. Podaci su izraženi kao srednja ± standardna devijacija (x ± S), a analiza je provedena pomoću jednosmjerne ANOVA. Usporedba dviju skupina provedena je pomoću Dunnettovog testa. P<0.05 indicated that the difference was statistically significant.
