Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Kontakt: joanna.jia@wecistanche.com

Sažetak

LC tehnologija je priznata metoda koja se koristi u cijelom svijetu za procjenu kvalitete tradicionalnih kineskih lijekova (TCM). Kvaliteta TKM-a ima izravan utjecaj na njegovu učinkovitost. Stoga, da bi se temeljito otkrilo kako TCM ispoljava svoju učinkovitost, prije svega je potrebno razumjeti materijalnu osnovu za njegovu učinkovitost, a potom i kontrolirati kvalitetu aktivnih spojeva. Primjena metode odnosa spektar-učinak ključna je za određivanje osnove farmakološkog materijala. Cilj ovog rada bio je istražiti temeljne korelacije između kemijskih profila i estrogene aktivnostiCistanche, otkriti aktivne spojeve. Kemijski profiliCistanchezabilježeni su pomoću HPLC/Q-TOF-MS/MS, a estrogena aktivnost određena je testom rasta maternice i MTT testom. Potom je kombiniranjem rezultata bivarijatne analize, analize glavnih komponenti i metode analize sive korelacije identificirano petnaest aktivnih spojeva. To su 8-epiloganska kiselina, salidrozid, siringalid A 3'- -l-ramnopiranozid, cistanozid A,ehinakozid, cistanozid F, cistanozid B, cistanozid C, osmantusid B, akteozid, izoakteozid, tubulozid B, 2'-acetilakteozid i dva nepoznata spoja. Ova studija postavlja temelj za in vivo studijeCistanche, te za razvoj njegove kliničke primjene.

Cistanche može potaknuti estrogen, kliknite ovdje da biste saznali više

Ključne riječi:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; estrogena aktivnost; analiza glavnih komponenti (PCA); Test rasta maternice.

Kratice

TCM: Tradicionalna kineska medicina

HPLC/Q-TOF-MS: Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti/kvadrupolna time-of-flight masena spektrometrija

BA: bivarijatna analiza

PCA: analiza glavnih komponenti

GCAM: metoda analize sive korelacije

MTT: Tripsin, 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolijbromid

DMSO: dimetil sulfoksid

RPMI1640 Memorijalni institut Roswell Park 1640

1. Uvod

Nedavno je TKM postao sve popularniji u azijskim i zapadnim zemljama zbog svojih stabilnih terapijskih učinaka i niske toksičnosti u klinici. Kao rezultat toga, potrebno je razviti nove vrste TKM-a i razumjeti učinkovite sastave koji se koriste tijekom njihove kliničke primjene [1-6].

Prvo, proučava se odnos spektar-učinak kako bi se uočila korelacija između kromatografskog otiska prsta i farmakodinamičke učinkovitosti. Zatim korištenje odnosa za traženje učinkovitih komponenti u TCM-u i formuliranje standarda kontrole koji odražavaju njihovu unutarnju kvalitetu. Odnos spektar-učinak primijenjen je u mnogim područjima istraživanja TCM-a, kao što je materijalna osnova pojedinačnog i složenog TCM-a, kompatibilnost komponenti, mehanizam obrade, predviđanje farmakološkog učinka i optimizacija tehnologije [7-12]. Odnos spektar-učinak koristi se za iznošenje novih ideja i metoda za istraživanje aktivnih tvari, optimiziranje formula, poboljšanje procesa pripreme, praćenje i odvajanje ciljnih sastojaka te za razvoj novih TCM lijekova [13-17].

Cistanchenaširoko se koristi za liječenje seksualne disfunkcije, zatvora, prostatitisa i nedostatka bubrega. Ima širok spektar bioaktivnosti uključujući estrogenski učinak, usporavanje starenja, antioksidaciju i imunološko djelovanje [18-19]. Općenito, feniletanoidni glikozidi (kao što su cistanozid A, tubulozid A), lignani i iridoidni glikozidi smatrani su farmakološkim sastojcima i kemijskim markerima za kontrolu kvalitete Cistanche i njegovih proizvoda [20-21]. Kemijski spektriCistancheiz različitih područja zabilježeni su tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) [22-23]. U ovoj studiji odabiremo test rasta maternice i test proliferacije stanica MCF7 kako bismo procijenili njihovu estrogenu aktivnost. Analiza glavnih komponenti, bivarijatna analiza i metode analize sive korelacije korištene su za korelaciju estrogene aktivnosti s pojedinačnim komponentama. Ovo je istraživanje imalo za cilj identificirati bioaktivne spojeve Cistanche odgovorne za in vivo estrogene učinke. Studija postavlja temelje za dubinska proučavanjaCistanche.

Sve eksperimentalne postupke pregledao je i odobrio Etički odbor za životinje Harbinskog sveučilišta za trgovinu.

Cistanchedeserticola(cd-20120227-005) kupljen je na tržištu lijekova, a identificirao ga je prof. Zhang Delian (Harbin University of Commerce). Diethylstilbestrol je kupljen od HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 i RPMI1640 bez fenol crvenog kupljeni su od HyClone Company (SAD). MTT i DMSO su nabavljeni od Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, SAD). Liniju stanica raka dojke kod ljudi MCF7 osigurao je Istraživački centar znanosti o životu i znanosti o okolišu (Sveučilište za trgovinu u Harbinu). Korišteni standardi bili su sljedeći: akteozid (111530- 200505), ehinakozid (111670-200503) i salidrozid (110736-200628) dobiveni su od Nacionalnog instituta za kontrolu farmaceutskih i bioloških proizvoda (Peking). , Kina). Acetonitril, metanol i mravlja kiselina bili su MS stupnja, dok je voda bila ultračista. Ostali reagensi bili su analitičke kvalitete i bili su komercijalno dostupni.

EhinakoziduCistanchetubulosa ima mnoge učinke

2 Eksperimentalni postupak

2.1 Materijali

Za analitičke kemijske pokuse i obradu podataka korišteni su Agilent 1290 HPLC sustav, Agilent 6530 Series Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF) sustav i Chemical HPLC-3D radne stanice. Za pripremu uzoraka i standarda korištena je Milli-Q ultračista voda. Dodatni instrumenti uključivali su elektroničku analitičku vagu AR1140 (Ohaus International Ltd), čitač mikropločica 680 (Bio-Rad Corporation) i centrifugu velike brzine 64R (Beckman Coulter Allegra).

Nezrele ženke Kunming miševa (oko 21 dan od rođenja, odbijene) težine (12 ± 2) g, kupljene su od Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Center (Changchun, Kina). Miševi su bili smješteni u prostoriji s reguliranom temperaturom (22 ± 2 stupnja) s neograničenim pristupom hrani i vodi. Pokusi na životinjama započeli su nakon pet dana aklimatizacije. Miševi su izgladnjeli preko noći sa slobodnim pristupom vodi prije davanja ispitnih otopina. Ova studija je provedena u strogom skladu s preporukama u Vodiču za njegu i korištenje laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje.

2.2 Priprema otopine uzorka

Uzorci Cistanche prikupljeni su iz deset različitih staništa, naime Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan i provincija Hubei.

Otopina (1.0 g/mL) uzorka Cistanche pripremljena je u destiliranoj vodi za oralnu primjenu. Koncentracija dietilstilboestrola bila je 20ug/mL i korišten je kao otopina pozitivne kontrole. Otopina (10 g/mL) uzorka Cistanche pripravljena je u 50 posto acetonitrila. Akteozid, ehinakozid i salidrozid (2,0 mg svaki) otopljeni su u 10 mL 50 postotne otopine acetonitrila. I uzorak i standardna otopina filtrirane su pomoću filtra od 0.45-μm prije analize.

2.3 LC-MS uvjeti

Za analizu uzoraka korišten je Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm × 150 mm, 5 μm; Waters Corporation, Milford, MA, SAD). Mobilna faza sastojala se od acetonitrila (A) i 0.2 posto (v/v) vodene otopine mravlje kiseline (B) i pumpana je brzinom protoka od 0,5 mL/min. Volumen injekcije svakog uzorka bio je 10 μL. Gradijentni program eluiranja bio je sljedeći: Mobilna faza A započeta je s 5 posto i linearno povećana na 23 posto nakon 35 minuta. Otopina A je naknadno povećana na 25 posto (35 do 65 min). Mobilna faza A zatim je smanjena na 5 posto u zadnjih 5 minuta ciklusa (65 do 70 minuta). Temperatura kolone je održavana na 30 stupnjeva. Kromatogrami su praćeni na 254 nm. Tlak atomizacijskog plina bio je 30 psi, a kapilarni napon bio je 3,5 kV. Brzina protoka suhog plina postavljena je na 8 L/min uz temperaturu od 30 stupnjeva. Maseni spektri su snimljeni unutar raspona skeniranja od 100- 3,000 Da i bili su u načinu skeniranja negativnih iona.

2.4 Procjena otiska prsta

LC otisci prstiju uzoraka prikupljenih iz 10 različitih serija uspostavljeni su i automatski upareni korištenjem Sustava za procjenu sličnosti za kromatografske otiske prstiju TCM-a (verzija 2012; Kineski farmakopejski odbor, Peking, Kina). Nadalje, referentna karta kromatograma generirana je metodom medijana. Osim toga, primijenjena je klaster analiza za procjenu kvalitete uzoraka iz deset različitih staništa.

2.5 Analiza glavne komponente (PCA)

PCA je multivarijantna statistička metoda. Može zadržati dovoljno informacija iz prikupljanja podataka. U ovoj studiji, karakteristični pikovi iz LC kromatograma dodatno su ispitani PCA-om s ciljem identificiranja aktivnih spojeva na temelju odnosa spektar-učinak.

2.6 Ispitivanje rasta maternice

Miševi su podijeljeni u 12 skupina (10 po skupini). Otopine uzoraka koje su pripremljene iz Cistanche prikupljene su iz deset različitih staništa i davane su dva puta dnevno (ujutro i navečer) gavažom u dozi od 30 g/kg tjelesne težine tijekom četiri dana. Slijepa i pozitivna kontrolna skupina sadržavale su jednake količine destilirane vode i dietilstilboestrolne otopine i primjenjivane su dva puta dnevno tijekom četiri dana. Petog dana, uzorci krvi koji su sadržavali lijek povučeni su iz anesteziranih miševa. Uzorci su centrifugirani (5,000 rpm, 10 min), a supernatanti (uzorci seruma koji sadrže lijek) su odvojeni. Uzorci seruma koji sadrže lijek inaktivirani su zagrijavanjem na 56 stupnjeva u vodenoj kupelji 30 minuta i filtrirani kroz filter od 0.22- μm prije MTT testa. Istodobno, maternice miševa su odmah izrezane i izvagane da se izračunaju indeksi težine maternice. Pokusi na životinjama započeli su nakon pet dana aklimatizacije. Miševi su gladovali preko noći sa slobodnim pristupom vodi prije primjene ispitnih otopina. Ovo istraživanje provedeno je u strogom skladu s preporukama Vodiča za njegu i korištenje laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje. Sve eksperimentalne postupke pregledao je i odobrio Etički odbor za životinje Harbinskog sveučilišta za trgovinu. Svi potencijalno stresni zahvati izvedeni su u anesteziji natrijevim pentobarbitalom.

2.7 MTT test

MCF7 stanice su zajedno uzgajane s RPMI 1640 bez fenol crvenog (koji sadrži 5 posto CDT-FBS) četiri dana. Stanice su nasađene u 96-ploče s jažicom pri gustoći od 2,000 stanice/jažici. Postignuta je prianjajuća kultura i nakon 72 sata kulture, stanice su kokultivirane u mediju RPMI 1640 koji je sadržavao uzorke seruma miševa tretiranih Cistancheom. Pokusi su provedeni u šest ponavljanja. Zatim je u svaku jažicu dodano 20 µL otopine MTT (5 mg/mL u PBS-u) i stanice su inkubirane 4 sata. Nakon uklanjanja medija, dodano je 150 µL DMSO da se dobije proizvod formazan, a ploče su protresene u mraku da se potpuno otope. Apsorpcija je izmjerena na 570 nm čitačem mikropločica. Stopa proliferacije izračunata je kao prosječna vrijednost apsorbancije skupine koja je sadržavala lijek u serumu podijeljena s prosječnom vrijednošću apsorbancije slijepe kontrolne skupine (stanice kokultivirane u RPMI 1640 bez seruma).

2.8 Statistička analiza

T-test uparenog uzorka (dvostrani) korišten je za utvrđivanje statistički značajnih razlika između vrijednosti u slijepoj kontrolnoj i eksperimentalnoj skupini. Razlike su smatrane značajnima na razini pouzdanosti od 95 posto (p <>

PCA je korišten za procjenu karakterističnih vrhova u kromatogramima uzoraka iz deset različitih staništa. Bivarijatna analiza i analiza Grayeve korelacije korištene su za procjenu korelacije područja vrhova i njihove estrogene aktivnosti. Korelacija je izračunata statističkim softverom SPSS Statistic (SPSS za Windows 21.0, SPSS Inc., SAD). Razlike su smatrane značajnima na razini pouzdanosti od 95 posto (dvosmjerno).

Etičko odobrenje: Provedeno istraživanje nije povezano ni s ljudskom ni s životinjskom uporabom.

cistanche acteoside ima mnogo funkcija

3. Rezultati i rasprava

3.1 Analiza klastera i procjena sličnosti

Relativna standardna devijacija vremena zadržavanja i površine vrha karakterističnih vrhova bila je {{0}}.58 i 0.34 posto za preciznost, 0.52 i {{8} }.31 posto za ponovljivost, odnosno {{10}}.19 i 0.13 posto za stabilnost. Ovi su nalazi pokazali da je naša LC metoda utvrđivanja otiska prsta razumna i pouzdana. Sličnosti kromatograma deset uzoraka bile su veće od 0,9. Zajednički vrhovi za sve uzorke nisu mogli u potpunosti predstavljati karakteristične sastojke Cistanche, jer je vrh mogao biti izgubljen. Stoga je broj podudaranja uzorka podešen s 26 na 20 kako bi se dobila točnija karta kromatograma. Dobiveno je ukupno 26 pikova, a zbroj njihovih površina bio je veći od 0,8 u usporedbi s onima ukupne površine pikova u uzorku. Stoga smo zaključili da ti kromatografski vrhovi mogu učinkovito odražavati glavne kemijske sastojke Cistanche. Rezultati klaster analize prikazani su na slici 1. Ukupno deset različitih staništa podijeljeno je u tri kategorije kako slijedi: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang i 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia i 5, Alashan. (C) 9, Hubei. Trend klaster analize pokazao je da su staništa ljekovitog bilja slična kada su na dnu praga. Ali s povećanjem praga, klima i uvjeti rasta staništa su bliski. To pokazuje da klaster analiza ne samo da može dobro razlikovati različita staništa, već također odražava srodnosti među njima.

3.2 Identifikacija kemijskih sastojaka

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Što je viša apsolutna vrijednost Eigenovog opterećenja, veći je utjecaj spojeva na estrogenske indekse.

Kromatogrami Cistanche i standardnih uzoraka uspoređeni su kako bi se identificirale pojedinačne komponente pod istim LC-MS uvjetima. Kao što je prikazano u Tablici 1, identificirano je ukupno 26 sastojaka na temelju vremena zadržavanja i MS podataka [24-26]. Aktivni sastojci se daju oralno u obliku mješavina, a ne monomera jer tradicionalna kineska medicina ima terapeutsku ulogu u obliku mješavine. Nije utvrđeno da pojedinačni spoj nakon pojedinačnog odvajanja igra ulogu. Naš cilj je otkriti spojeve koji imaju estrogenu aktivnost u poznatim komponentama Cistanche [23-30], te stoga nismo odabrali NMR i druga tehnička sredstva za provjeru njihovog identiteta. Vršak 1 označava predominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 373 (C16H22O10), koji je bio identičan elementarnom sastavu genipozidne kiseline. Ovo je potkrijepljeno gubitkom glukoznog dijela koji je dao fragment ion s m/z omjerom od 211. Vršak 2 je ukazao na prevladavajući deprotonirani ion s m/z omjerom od 461 (C20H30O12), koji je bio identičan elementarnom sastavu dekafeoilakteozida, a potkrijepljeno je gubitkom ramnozilnog ostatka, stvarajući fragmentaciju s m/z omjerom od 315. Vršak 4 ukazuje na prevladavajući deprotonirani ion s m/z omjerom od 375 (C16H24O10), koji je bio identičan elementarni sastav 8-epiloganske kiseline. Gubitak glukoznog dijela, formirao je fragmentaciju s m/z omjerom od 213, dodatno je podupro zaključak. Vrh 6 je ukazivao na prevladavajući deprotonirani ion s m/z omjerom od 607 (C29H36O14), koji je bio identičan elementarnom sastavu siringalida A3'- - l-ramnopiranozida.

Gubitak caff ostatka, koji je formirao fragmentni ion s m/z omjerom od 445, dodatno je potkrijepio zaključak. Vrh 8 je ukazivao na prevladavajući deprotonirani ion s m/z omjerom od 799 (C36H48O20), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida A. Gubitak caff dijela formirao je fragment ion s m/z omjerom od 637, dodatno potkrijepio zaključak. Vrh 11 ukazuje na prevladavajući deprotonirani ion s m/z omjerom od 487 (C21H28O13), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida F. Ovo je potkrijepljeno gubitkom ramnozilnog dijela koji je dao fragment iona s m/z omjer od 341, a gubitak druge caff jedinice formirao je fragmentni ion s omjerom m/z od 179, što je dodatno poduprlo zaključak. Vršak 12 ukazuje na dominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 813 (C37H50O20), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida B. Gubitak glukoznog dijela formirao je fragment ion s m/z omjerom 651, dodatno potkrijepio zaključak. Vršak 13 ukazuje na predominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 827 (C37H48O21), koji je bio identičan elementarnom sastavu tubulozida A. Gubitak ramnozilnog dijela formirao je fragmentaciju s m/z omjerom od 681, nadalje podržao zaključak. Vršak 14 ukazuje na dominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 637 (C30H38O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida C. Gubitak ramnozilnog dijela formirao je fragment ion s m/z omjerom od 491, dodatno potkrijepio zaključak.

Vršak 15 ukazuje na predominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 591 (C29H36O13), koji je bio identičan elementarnom sastavu osmantusida B. Gubitak ramnozilnog dijela formirao je fragment ion s m/z omjerom od 445, dodatno potkrijepio zaključak. Vršak 16 označava predominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 623 (C29H36O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu akteozida. Gubitak caff dijela formirao je fragment ion s m/z omjerom od 461,dodatno potkrijepio zaključak. Vršak 18 ukazuje na prevladavajući deprotonirani ion s m/z omjerom od 623 (C29H36O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu izoakteozida. Gubitak caff dijela, forepeak15 ukazuje na prevladavajući deprotonirani ion s m/z omjerom od 591 (C29H36O13), koji je bio identičan elementarnom sastavu osmantusida B. Gubitak ramnozilnog dijela formirao je fragmentni ion s m/z omjerom od 445, nadalje podržao zaključak. Vršak 16 označava predominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 623 (C29H36O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu akteozida. Gubitak caff dijela, koji je formirao fragment ion s m/z omjerom od 461, dodatno je podupro zaključak. Vršak 17 ukazuje na prevladavajući deprotonirani ion s m/z omjerom od 623 (C29H36O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu cis-akteozida. Gubitak caff dijela, formirao je fragment ioda fragment ion s m/z omjerom od 461, dodatno podupire zaključak. Vrh 21 je ukazivao na prevladavajući deprotonirani ion s m/z omjerom od 653 (C30H38O16), koji je bio identičan elementarnom sastavu kampneozida Ⅰ.

Gubitak caff ostatka formirao je fragmentni ion s m/z omjerom od 491, a gubitak drugog ramnozilnog dijela formirao je fragmentni ion s m/z omjerom od 345, što dodatno podupire zaključak. Vršak 22 ukazuje na predominantni deprotonirani ion s m/z omjerom 665 (C31H38O16), koji je bio identičan elementarnom sastavu tubulozida B. Gubitak CH3 CO dijela formira fragment iona s m/z omjerom 623, i gubitak drugog caff dijela formirao je fragmentni ion s m/z omjerom od 461, što dalje podupire zaključak. Vršak 23 označava predominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 639 (C29H36O16), koji je bio identičan elementarnom sastavu kampneozida. Gubitak ramnozilnog dijela, koji je formirao fragmentni ion s m/z omjerom od 493, dodatno je podupro zaključak. Vršak 24 označava predominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 665 (C31H38O16), koji je bio identičan elementarnom sastavu 2'-acetilakteozida. Gubitak Ac ostatka formirao je fragment ion s omjerom m/z od 623, a gubitak drugog caff dijela formirao je fragment iona s omjerom m/z 461, što dodatno podupire zaključak. Vršak 25 ukazuje na predominantni deprotonirani ion s m/z omjerom od 445 (C20H30O11), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida G. Gubitak ramnozilnog dijela formirao je fragment ion s m/z omjerom od 299, dodatno potkrijepio zaključak. Strukture spojeva navedene su na slici 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Ti su vrhovi bili sljedeći: 9, 12, 14 i 15. Posljedično, ehinakozid, cistanozid B, osmantusid B i akteozid, koji odgovaraju ukupno 4 vrha, odabrani su kao reprezentativne varijable za estrogenu aktivnost (Slika 3).

.

3.4 Određivanje estrogenske aktivnosti

Izračunat je omjer mokre težine maternice i tjelesne težine svakog miša (Slika 4). Životinje izložene Cistancheu iz devet staništa pokazale su značajne estrogene aktivnosti povećanjem težine maternice u usporedbi s miševima u slijepoj kontrolnoj skupini. Slika 4 dalje prikazuje brzinu proliferacije MCF7 stanica tretiranih sa serumom miševa tretiranih Cistancheom. Stanice tretirane serumima miševa kojima je primijenjen Cistanche iz deset staništa pokazale su značajno veći rast u usporedbi sa stanicama koje nisu tretirane.

3.5 Bivarijatna analiza

U ovoj studiji primijetili smo da se težina maternice nezrelih ženki Kunming miševa povećala i da je pospješena proliferacija MCF7 stanica raka dojke kod ljudi. Ovi nalazi potvrdili su estrogenu aktivnost Cistanche. Slika 5 pokazuje indekse maternice i stope proliferacije stanica MCF7 ovih sastojaka. Pearsonov koeficijent korelacije korišten je za izračunavanje relativnih površina vrhova, koje su odgovarale estrogenskoj aktivnosti uzoraka. Koeficijenti korelacije viši od 0.3 smatraju se značajnima (p < 0.05),="" dok="" se="" koeficijenti="" korelacije="" viši="" od="" 0.5="" smatraju="" visoko="" značajnim="" (p="">< 0,01).="" na="" temelju="" rezultata="" pokazalo="" se="" da="" cistanche="" posjeduje="" estrogensko="">

Ukupno devet spojeva značajno je koreliralo s povećanjem težine maternice (p < {{0}}.05),="" dok="" je="" deset="" spojeva="" značajno="" koreliralo="" sa="" staničnom="" proliferacijom="" mcf7="" (p="">< 0,05).="" spojevi="" koji="" značajno="" koreliraju="" s="" težinom="" maternice="" i="" proliferacijom="" stanica="" bili="" su="" 8-epiloganska="" kiselina,="" salidrozid,="" siringalid="" a3'-="" -="" l-ramnopiranozid,="" cistanozid="" a,="" cistanozid="" b,="" cistanozid="" c,="" osmantusid="" b,="" akteozid,="" izoakteozid,="" tubulozid="" b,="" 2'-acetilakteozid="" i="" dva="" nepoznata="" spoja="" (slika="" 5).="" ovih="" trinaest="" spojeva="" ispoljilo="" je="" estrogensko="">

3.6 Metoda analize Grey korelacije

Slika 6 prikazuje relativnu korelaciju karakterističnih vršnih vrijednosti 26 spojeva s indeksima maternice, a Slika 7 prikazuje relativnu korelaciju karakterističnih vršnih vrijednosti 26 spojeva s njihovim stopama stanične proliferacije. Ukupno tri spoja pokazala su najveću korelaciju s indeksima maternice, naime 8-epiloganska kiselina, cistanozid F i akteozid (Slika 6, silaznim redoslijedom); dok je šest spojeva koji su pokazali najveću korelaciju s proliferacijom stanica MCF7 bili ehinakozid, cistanozid F, cistanozid B, osmantusid B, izoakteozid i tubulozid B (Slika 7, silaznim redoslijedom). Relativne korelacije ehinakozida, osmantusida B, akteozida i izoakteozida bile su veće od 0.5.

3.7 Optimizacija LC-MS uvjeta

Kako bi se dobila bolja karta kromatograma, uspoređeni su metanol i acetonitril. Konačno, kombinacija vodene otopine mravlje kiseline (0.2 posto, v/v) - acetonitril bila je najbolja pokretna faza za odvajanje. U rasponu od 200-400nm skeniranja pune valne duljine, 254 nm je odabrano kao optimalno. Osim toga, MS parametri su također poboljšani. Odabran je način skeniranja negativnih iona jer je poboljšao vrijednosti odgovora većine sastojaka u Cistancheu.

4. Zaključak

LC-Q-TOF-MS tehnologija korištena je za identifikaciju estrogenih aktivnih sastojaka Cistanche. Ova studija je pokazala da 8-epiloganska kiselina, salidrozid, siringalidA3'- -l-ramnopiranozid, cistanozid A, ehinakozid, cistanozid F, cistanozid B, cistanozid C, osmantusid B, akteozid, izoakteozid, tubulozid B, 2'-acetilakteozid i dva nepoznata spoja bili su glavni aktivni sastojci Cistanche. Međutim, ovi nalazi zahtijevaju daljnje studije kako bi se istražili in vivo učinci i mehanizam djelovanja sastojaka.

cistancheakteozid ima mnoge funkcije, poput jačanja imunološkog sustava

Zahvale:

Ovaj projekt podržali su Kineska nacionalna zaklada za prirodne znanosti (br. 81073015), Zaklada za prirodoslovlje provincije Heilongjiang (ZD2017014) i plan obuke mladih inovativnih talenata Koledža u provinciji Heilongjiang (UNPYSCT-2017209) . Autori izjavljuju da ne postoji sukob interesa u vezi s objavljivanjem ovog rada.

Reference

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fitokemija, farmakologija , kontrola kvalitete i buduća istraživanja Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: Pregled, J. Ethnopharmacol., 2018., 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Primijenjena integrirana i globalna pseudotargetirana strategija metabolomike probiru markera kontrole kvalitete Citrus TCMs, Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM " Strategija primijenjena na analizu kvalitete injekcija tradicionalne kineske medicine: korištenje KuDieZi injekcije kao studije slučaja, Molecules., 2017., 22(7). PII: E1237.

[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Probir bioaktivnih markera za kontrolu kvalitete QiShenYiQi tableta za kapanje na temelju odnosa između ultra-visoke učinkovitosti tekućinska kromatografija otisak prsta i vaskularna zaštitna aktivnost, J. Sep. Sci., 2017., 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Primjena multivarijantne statističke analize i razmišljanja u kontroli kvalitete kineske medicine, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39 (21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Dai J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS podaci o karakterističnim komponentama set i kemometrijska analiza za holističku kontrolu kvalitete složenih TCM pripravaka: Niuhuang Shangqing pilula kao primjer, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, High Negative Predictive Value, Low Prevalence, and Spectrum Effect: Caution in the Interpretation, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Probir hepatotoksičnih komponenti u Euodia rutaecarpa od UHPLC-QTOF/MS na temelju odnosa spektar-toksičnost, Molecules., 2017., 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Probir i identifikacija hepatotoksične komponente u Evodia rutaecarpa na temelju odnosa spektar-učinak i UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Amnestičko blago kognitivno oštećenje: Koje su kliničke implikacije?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Odnosi spektra i učinaka kao sustavni pristup istraživanju tradicionalne kineske medicine: trenutni status i buduće perspektive, Molecules., 2014., 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Odnosi spektra i učinaka između UPLC otisaka prstiju i bioaktivnosti sirovih sekundarnih korijena Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) i njegova tri prerađena proizvoda na rast mitohondrija zajedno s kanoničkom korelacijskom analizom, J. Ethnopharmacol., 2014., 153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Spectrum-Effect Relationships Between Chemical Fingerprints i Antibakterijski učinci Lonicerae Japonicae Flos i Lonicerae Flos baze na UPLC i mikrokalorimetriji, prednja strana. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Učinak spektra u testovima za predviđanje rizika, probir i dijagnozu, BMJ, 2016., 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Praćenje novih hemostatskih spojeva iz proizvoda zagrijavanja ukupnih flavonoida u Flos Sophorae po spektru -odnosi učinaka i kromatografija na stupcu, J. Sep. Sci., 2015., 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Istraživanje odnosa spektar-učinak Da-Huang-Fu- Zi-Tang u štakora metodom UHPLC-ESI-Q-TOF-MS, J. Ethnopharmacol., 2014., 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Studija o odnosu spektra učinaka rizoma Rhei, kore Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus i njihove formule, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporotička aktivnost ehinakozida u ovariektomiziranih štakora, Phytomedicine., 2013., 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Antihiperglikemijski i hipolipidemijski učinci Cistanche tubulosa kod DB/DB miševa s dijabetesom tipa 2, J. Ethnopharmacol., 2013., 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., Acilirani feniletanoidni glikozidi echinacoside i acteoside iz Cistanche tubulosa, poboljšavaju toleranciju glukoze u miševa, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Feniletanoidni glikozidi s protuupalnim djelovanjem iz stabljika Cistanche deserticola uzgojenih u pustinji Tarim, Fitoterapia., 2013., 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Kvantitativna analiza Cistanches Herba korištenjem tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti u kombinaciji s detekcijom niza dioda i visoko- masena spektrometrija rezolucije u kombinaciji s kemometrijskim metodama, J. Sep. Sci., 2013., 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Strukturalna karakterizacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida iz Cistanches deserticola YC Ma od UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Antiproliferativna aktivnost fenilpropanoida izoliranih iz Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Simultaneous determination of components with wide polarity and content ranges in Cistanche tubulosa korištenjem serijski spojene kromatografije hidrofilne interakcije reverzne faze-tandem masene spektrometrije, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Primjena 1H NMR-bazirane metabolomike za razlikovanje različitih dijelova i razvoj novog tijeka obrade za Cistanche deserticola, Acta. Pharm. Grijeh. B., 2017., 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Studije o sastojcima i bioaktivnosti svježe Cistanche tubulosa, Ph.D. disertacija, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Kina, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Metabolički profil akteozida koji proizvode crijevne bakterije čovjeka ili štakora ili intestinalni enzim in vitro primijenjen UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016., 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Sustavna karakterizacija metabolita ehinakozida i akteozida iz Cistanche tubulosa u plazmi, žuči, urinu i fecesu štakora na temelju UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Metabolički način za istraživanje povezanih prepreka koje uzrokuju lošu bioraspoloživost u oralnoj isporuci izoakteozida u štakora primjenom tekućinske kromatografije ultravisoke učinkovitosti/ quadrupole time-of-flight tandem masena spektrometrija, Rapid. Komun. Mass. Spectrom., 2017(4), 371-380.