Renoprotektivni učinak izolikviritigenina na akutnu ozljedu bubrega izazvanu cisplatinom putem inhibicije FPR2 u makrofagu

Za više informacija kontaktirajte: ali.ma@wecistanche.com

Tan Rui-Zhi i sur

Kliknite na Cistanche za liječenje bolesti bubrega

Sažetak

Akutna ozljeda bubrega (AKI) je ozbiljna komplikacija kod kritično bolesnih pacijenata. Prikupljeni dokazi pokazuju da makrofagi igraju važnu proupalnu ulogu uAkutna ozljeda bubregai izolikviritigenin (ISL) mogu inhibirati makrofagnu upalu, ali njegova uloga uAkutna ozljeda bubregaa temeljni mehanizam je nepoznat. Cilj ove studije je istražiti renoprotektivni učinak ISL-a na AKI i ulogu formilpeptidnih receptora 2 (FPR2) u ovom procesu. U ovoj studiji, model AKI izazvan cisplatinom i model upale makrofaga izazvan lipopolisaharidom korišteni su za izvođenje in vivo i in vitro eksperimenata. Rezultati su pokazali da je ISL snažno olakšanozljeda bubregai inhibira bubrežnu upalu in vivo i potiskuje makrofagni upalni odgovor in vitro. Važno je da je otkriveno da je FPR2 značajno pojačan u usporedbi s kontrolnom skupinom kod AKI i LPS-induciranog makrofaga, dok ga je ISL snažno potisnuo. Zanimljivo je da je prekomjerna ekspresija FPR2 s transfekcijom pcDNA3.1-FPR2 učinkovito poništio protuupalni učinak ISL-a u makrofagima, sugerirajući da bi FPR2 mogao biti potencijalna meta za ISL za sprječavanje upale i poboljšanjeozljeda bubregaodAkutna ozljeda bubrega. Uzeti zajedno, ovi nalazi pokazuju da je ISL poboljšao induciranu cisplatinomozljeda bubregainhibicijom FPR2 uključena je makrofagna upala, koja može pružiti potencijalnu terapijsku opciju za AKI.

1. Uvod

Akutnabubregozljeda (AKI) česta je teška vrstabubregbolest s visokim mortalitetom.1 Karakterizira ga brzi pad bubrežne funkcije koji se javlja unutar 7 dana ili manje. Nedavne publikacije izvijestile su da je incidencija AKI čak 5 posto bolničkih bolesnika i 30 posto teških bolesnika, aAKIuzrokuje 2 milijuna smrti diljem svijeta svake godine, što je postalo globalni zdravstveni problem. Iako je definicija uobičajena i ujednačena, AKI može biti uzrokovan raznim razlozima, uključujući uzimanje nefrotoksičnih lijekova, ishemijsko-reperfuzijsku ozljedu (ishemijsko-reperfuzijska ozljeda, IRI), sepsu, kardiovaskularnu kirurgiju, hipertenziju i dijabetes.2,3 Stari dob, dijabetes i zatajenje srca povećavaju rizik od AKI, što obično dovodi do ireverzibilne kronične bolesti bubrega (CKD) i završnog stadija bubrežne bolesti (ESRD) kod nekih pacijenata.4 Značajno, studije su pokazale da su uključene gotovo sve imunološke stanice kod imunološke upale bubrega u AKI.5 Među njima, makrofagi su pokazali važnu ulogu u promicanju upale bubrega.6 Brisanje makrofaga poboljšava ozljedu i upalu AKI bubrega.7 Stoga, učinkovita inhibicija makrofagne upale može biti korisna za poboljšanje trenutnih terapijskih pristupa za upravljanje AKI.

Isoliquiritigenin (ISL) je flavonoid sa strukturom kalkona, koji je ukorijenjen u poznatoj tradicionalnoj kineskoj biljnoj medicini.8 Posljednjih godina privukao je veliku pozornost znanstvenika zbog svog antioksidativnog, protuupalnog, antiagregacijskog djelovanja, antibakterijskog djelovanja , antivirusna, antitumorska, hepatoprotektivna, neuroprotektivna, srčana zaštita i svojstva detoksikacije.9 Pokazalo se da ISL inhibira proliferaciju stanica, smanjuje ROS i izaziva apoptozu, nekrotiku i smrt stanica raka u različitim stupnjevima.10 Nedavno izvješća pokazuju da izolikviritigenin može inhibirati proizvodnju IL-6 i TNF-a induciranu lipidnim A dijelom LPS-a u makrofagima RAW264.7 i oslabiti stvaranje kompleksa LPS-TLR4/MD-2. Osim toga, ISL može inducirati staničnu apoptozu HepG2 putem ROS-posredovanih MAPK, STAT3 i NF-kB signalnih putova.11 Eksperimentalni dokazi također su pokazali da ISL inducira ROS-posredovanu unutarnju aktivaciju i aktivira mehanizam mitohondrijske citokroma c-cistein proteaze apoptoze PC-12 stanica. Vrijedno je napomenuti da se ISL često koristi kao dodatak prehrani za žene.12 Nedavne studije su pokazale da ISL ima značajan protuupalni učinak na AKI, ali je specifični mehanizam djelovanja još uvijek nejasan.

Prethodno istraživanje našeg tima otkrilo je da je Mincle, lektin C-tipa induciran makrofagom, transmembranski receptor za prepoznavanje uzoraka uključen u bubrežnu upalu,13 kroz koji smo pregledali formil peptidne receptore 2 (FPR2) koji su u određenoj vezi s Mincleom iz GEO bazu podataka. Međutim, njegova uloga u akutnoj bolesti bubrega nije potvrđena. FPR2 je gen za kodiranje proteina koji pripada obitelji receptora vezanih za G protein i sadrži 351 aminokiselinske ostatke.14,15 Oni su 7- transmembranski receptori vezani za G proteine ​​koji mogu posredovati u imunološkoj regulaciji, lučenju faktora upale, stanične kemotaksije i stanične adhezije, koji su usko povezani s nastankom i razvojem raznih bolesti.16 Njegova homologija s FPR1 i FPR3 iznosi čak 69 posto i 83 posto. FPR2 podstanice su lokalizirane u staničnoj membrani i višeprolazni su membranski proteini. Uglavnom su izraženi u neutrofilima, eozinofilima, monocitima, epitelnim stanicama, fibroblastima, glijalnim stanicama, mezangijskim stanicama itd., raspoređenim u različitim organima kao što su pluća, slezena i jetra. Značajno, FPR2 je obilno izražen u bubrežnom intersticiju,17 gdje se nalaze upalne stanice. Glavna funkcija FPR2 je kombiniranje određenih specijaliziranih medija za poticanje razgradnje (SPM) za posredovanje aktivnosti ovih metabolita u suzbijanju i uklanjanju upale. Međutim, još uvijek je nepoznata uloga FPR2 u upali AKI i može li se koristiti kao cilj za intervenciju lijekovima.

U ovoj studiji koristili smo model mišje AKI izazvan nefrotoksičnim lijekom cisplatinom i model upalnih stanica izazvanih LPS-om kako bismo istražili učinak poboljšanja ISL-a na ozljedu i upalu bubrega u AKI, kao i ključnu ulogu FPR2 u bubrežnoj upali i ISL liječenje AKI. Ova će studija pružiti nove smjernice za razumijevanje mehanizma upalne ozljede i strategije liječenja AKI.

2. Materijali i metode

2.1. Droge

Isoliquiritigenin (purity>98 posto) je izoflavonski spoj ekstrahiran iz korijena sladića. Njegova molekularna formula je C15H12O4. U ovoj studiji, izolikviritigenin je kupljen od Chengdu Bio purify Phytochemicals Ltd. (BP0787), otopljen u 10 posto DMSO-a (ST038, Beyotime, Kina), a miševima izazvanim cisplatinom intragastrično je primijenjena doza od 7,5 mg/kg i 30 mg. /kg, odnosno.

2.2. Izolacija BMDM

Muški C57BL/6 miševi u dobi od 6 do 8 tjedana odabrani su za izolaciju BMDM stanica. Pažljivo odvojite kost stražnje noge od bedrene kosti i uklonite pričvršćene mišiće. Samljeti kosti u PBS-u pomoću mužara dok se boja kostiju ne promijeni iz crvene u bijelu. Nakon toga skupite supernatant i filtrirajte kroz cjedilo 70, nakon čega slijedi centrifugiranje na 1500 okretaja u minuti tijekom 5 minuta. Eritrociti su razbijeni u filtriranoj tekućini s 10 - PBS, koja je zatim filtrirana na cjedilu za stanice od 40 mm. Inkubirajte dobivene stanice u zdjelici za kulture od 10 cm i inducirajte s 30 posto L929 supernatanta tijekom 7 dana. BMDM stanice su stimulirane sa 100 ng/ml LPS da se konstruira model upalnih stanica.

2.3. Smanjenje i prekomjerna ekspresija FPR2 u BMDM

FPR2 je smanjen transfekcijom sa Zeta LifeAdvanced Transfection Reagensom (AD600050, Zeta life, SAD) i FPR2 siRNA u BMDM (slijedovi FPR2 siRNA: Sense, 5'-GGAGAUGUGUAUUGUACAUTT-3'; Antisense, 5'-AUGUACAAUACA CAUCUCCTT-3'. Sangon Biotech, Kina). Slično, plazmid pcDNA3.1-FPR2 (konstruirao Fenghui Biotech, Kina) transfektiran je u BMDM sa ZETA-om kako bi se prekomjerno eksprimirao FPR2 u stanicama.

2.4. Pokusi na životinjama

Svi pokusi na životinjama izvedeni su u skladu sa smjernicama Etičkog odbora Southwest MedicalUniversity. 32 muška miša C57BL/6 kupljena su od ChengduDaShuo Animal Co., Ltd, koji su nasumično podijeljeni u 4 skupine: lažna skupina, modelna skupina (skupina AKI izazvana cisplatinom), skupina niske doze ISL (7,5 mg/kg, skupina L), i skupina visoke doze (30 mg/kg, skupina H). Modelnoj skupini ubrizgano je 20 mg/kg cisplatina (P4394, Sigma-Aldrich, SAD) prvog dana, dok je skupini s niskom dozom dano 7,5 mg/kg ISL, a skupini s visokom dozom 30 mg/kg ISL tijekom 3 dana . Nakon 3 dana, serum i bubrezi su sakupljeni od žrtvovanih miševa.

2.5. Ispitivanje bubrežne funkcije

Nakon prikupljanja seruma svake skupine miševa, strogo slijedite upute kompleta za otkrivanje razina serumskog kreatinina (C011-2-1, Jiancheng Biotech, Kina) i dušika iz uree (C013-2-1, Jiancheng Biotech, Kina).

2.6. Patološko bojenje

Bojanje H&E: rutinska deparafinacija i rehidracija presjeka, bojenje hematoksilinom 5 minuta, RO ispiranje vodom, 1 postotno odvajanje alkohola klorovodične kiseline 2 sekunde, ispiranje vodom iz slavine, uranjanje u 75 postotni etanol 2 sekunde, 1 postotni eozin topiv u alkoholu 30 sekundi , ispiranje vodom iz slavine, 100-postotni etanol Dehidrirajte 1 minutu, sušite, prozirni ksilen 10 minuta, sušite, zatvorite neutralnim balzamom za pričvršćivanje (36313ES60, Yepsen, Kina).

PAS bojanje: Kriške su stavljene u otopinu periodne kiseline na sobnoj temperaturi 5 do 8 minuta, nakon čega je dva puta isprano RO vodom. Zatim stavite ove rezove u Schiffov reagens na 10-20 minuta, isperite vodom iz slavine 10 minuta, obojite u hematoksilinu 1-2 minute, osušene i prozirne u 100 postotnom alkoholu, osušite, zatvorite neutralnim balzamom za pričvršćivanje.

2.7. Imunoflfluorescencija

Stavite zamrznute dijelove tkiva u PBS, isperite dva puta, fiksirajte 10 postotnim formaldehidom 10 minuta. Tkivo na rezovima je blokirano s 5 posto kozjeg seruma tijekom 30 minuta, nakon čega je uslijedila inkubacija s primarnim mišjim anti-mišjim FPR2 (1:200, sc-57141, Santa Cruz, SAD) i štakorskim anti-mišjim F4/80 antitijela (1:200, sc-52664, Santa Cruz, SAD) na 4 - C preko noći. Sljedeći dan dvaput isperite rezove s PBS-om, inkubirajte sa sekundarnim protutijelom (1:200) na sobnoj temperaturi tijekom 1 sata i obojite jezgru s DAPI. Slike su snimljene sustavom EVOS.

2.8. Elisa

Koncentracija IL-1b, IL-6, TNF-a u serumu i staničnom supernatantu analizirana je pomoću ELISA kompleta (EMC001B, EMC004, EMC102A, Neobioscience, Kina) prema uputama za komplet.

2.9. RealTime-PCR

Ukupna RNA ekstrahirana je pomoću kompleta za ekstrakciju RNA (Tiangen, Kina) prema uputama proizvođača. Nakon obrnute transkripcije ekstrahirane RNA u cDNA, dodavanja u reakcijski sustav od 10 mL za izvođenje PCR-a u stvarnom vremenu pomoću Roche LightCycler 480 sustava, a reakcijski sustav je sljedeći: Eastep® qPCR MasterMix 2 -, 5 mL; cDNA šablona, ​​1 mL; uzvodni primer (10 mM), 0,5 mL; nizvodni primer (10 mM), 0,5 mL; Voda bez nukleaza, 3 mL. Primere korištene u ovom eksperimentu sintetizirao je Sangon (Šangaj, Kina), a sekvence svih primera navedene su u tablici 1.

2.10. Western blot

RIPA pufer za lizu korišten je za ekstrakciju proteina iz tkiva bubrega i BMDM stanica. Nakon otapanja proteina u 10 postotnom SDS-PAGEgelu i prijenosa na PVDF membranu, blokiranja membrane u 5 postotnom BSA tijekom 1 sata i ispiranja s TBST 3 puta, nakon čega slijedi inkubacija membrane s primarnim protutijelima na 4 - C preko noći (pripremljeno s 5 posto BSA, 1:1000). Zatim su membrane inkubirane sa sekundarnim antitijelom (kozji anti-mišji IgG konjugirani s peroksidazom (ZB-2305, 1:3000), kozji anti-zečji IgG (ZB-2301, 1:3000)) na sobnoj temperaturi 1 h. Slike su snimljene gel imaging sustavom (BIORAD, SAD). Intenzitet sive trake izračunat je softverom Image J.

2.11. Statistička analiza

Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Analiza podataka provedena je jednosmjernim ANOVA testom nakon čega je uslijedila višestruka usporedba s LSD testom pomoću SPSS softvera 21.0. P < 0.05="" smatra="" se="" statistički="" značajnim.="" svaka="" grupa="" eksperimenata="" se="" duplira="" 3="">

3. Rezultati

3.1. Izolikviritigenin je poboljšao oštećenje bubrega izazvano cisplatinom i inhibirao upalu bubrega

Kako bismo istražili renoprotektivne i protuupalne učinke izolikviritigenina u AKI, otkrili smo razine Cre i BUN u serumu svake skupine, kao i ekspresiju i izlučivanje upalnog citokina PCR-om u stvarnom vremenu i ELISA-om. Uz to, bubrežna patologija je mjerena H&E i PAS bojenjem. Rezultati su pokazali da su u usporedbi s normalnom skupinom razine Cre i BUN u serumu bile povećane u modelu AKI, dok je tretman sa 7,5 mg/kg ili 30 mg/kg ISL značajno smanjio razine Cre i BUN u serumu, među njima , doza od 30 mg/kg ima najbolji terapeutski učinak (Slika 1A i B). Naime, 30 mg/kg ISL-a može poboljšati oštećenje bubrežnih tubula prema procijenjenom postotku nekroze tubula (Slika 1C). Rezultati ELISA i PCR pokazali su da je izlučivanje IL-1b, IL-6 i TNF-a smanjeno nakon intervencije ISL (7,5 mg/kg i 30 mg/kg), a ekspresija mRNA IL-1b, IL-6 i TNF-a također su značajno smanjeni primjenom 30 mg/kg ISL-a (Slika 1DeI). S druge strane, rezultati H&E i PAS bojenja pokazali su da je bubreg u skupini s akutnom insuficijencijom pokazao ozbiljno oštećenje bubrežnih tubula, odliveni bubrežni epitel, mezangijalnu intersticijsku hiperplaziju stanica i infiltraciju upalnih stanica, iznenađujuće, 30 mg/kg ISL-a. može učinkovito preokrenuti ozljedu bubrega kod AKI (slika 1J). Svi rezultati su otkrili da primjena ISL-a od 7,5 mg/kg i 30 mg/kg može poboljšati ozljedu bubrega izazvanu cisplatinom i inhibirati upalu bubrega, pri čemu 30 mg/kg ISL-a ima najbolji učinak.

3.2. Izolikviritigenin je smanjio ekspresiju FPR2 u makrofagima AKI miševa

Puno prethodnih izvješća pokazalo je da FPR2 igra vitalnu ulogu u imunološkom odgovoru i bolestima povezanim s upalom. Međutim, potencijalni učinak FPR2 na AKI bubrega je nedefiniran. U ovoj studiji proveli smo imunofluorescenciju kako bismo locirali FPR2 i makrofage (F4/80, proizvođač makrofaga). Rezultati su pokazali da su makrofagi (zelene mrlje) voluminozno infiltrirani u bubreg AKI miševa, dok je FPR2 (crvene mrlje) bio smješten zajedno s F4/80, što pokazuje da je FPR2 uglavnom izražen na makrofagu i da je razina FPR2 bila značajno povećana u bubrezima AKI miševa (slika 2A). Nadalje smo detektirali ekspresiju FPR2 mRNA i proteina povezanih s upalom pomoću PCR-a u stvarnom vremenu i Western blottinga u bubregu, a rezultati su pokazali da 30 mg/kg ISL-a može učinkovito sniziti razinu mRNA i proteina FPR2 u bubregu. bubrega AKI miševa u usporedbi sa 7,5 mg/kg ISL skupine (Slika 2B, G, H). Važno je da su rezultati Western blottinga pokazali da 30 mg/kg ISL-a također inhibira aktivaciju p-65 i smanjuje razine proteina TNF-a, IL-6 i IL{{28} }b u bubregu AKI miševa (Sl. 2CeF). Svi gornji podaci sugeriraju da ISL ublažava bubrežnu upalu AKI miševa može biti povezana sa smanjenjem ekspresije FPR2 u makrofazima.

3.3. Izolikviritigenin je potisnuo ekspresiju i izlučivanje FPR2 i upalnih citokina u BMDM stanicama izazvanim LPS-om

Kako bismo dodatno otkrili učinke ISL-a na BMDM stanice inducirane s LPS-om, ispitali smo razinu mRNA FPR2, ekspresiju i izlučivanje upalnih citokina u BMDM stanicama izazvanim LPS-om nakon primjene ISL-a pomoću PCR-a u stvarnom vremenu i ELISA-e. Rezultati su pokazali da je ISL smanjio razinu mRNA FPR2, IL-1b, IL-6 i TNF-a (slika 3AeD), kao i izlučivanje IL-1b , IL-6 i TNF-a u staničnom supernatantu u BMDM stanicama izazvanim LPS-om (slika 3EeG). Gornji rezultati upućuju na to da liječenje ISL s koncentracijom od 40 mM snažno inhibira upalu u BMDM stanicama izazvanim LPS-om.

3.4. Izolikviritigenin je smanjio razinu proteina FPR2 i upalnih citokina u BMDM stanicama izazvanim LPS-om

Također smo otkrili razine proteina FPR2 i upalnih citokina u LPS-induciranim BMDM stanicama nakon primjene ISL western blotingom. Podaci su pokazali da su u usporedbi s kontrolnom skupinom, razine proteina FPR2, p-p65, IL-6 i TNF-a značajno povećane u LPS-induciranim BMDM stanicama, te snažno smanjene s primjenom 40 mM ISL ( sl. 4AeE). Ovi rezultati dodatno pokazuju da ISL može potisnuti aktivaciju NF-kB i smanjiti razine proteina upalnih citokina u BMDM stanicama induciranim s LPS-om.

3.5. Inhibicija FPR2 potisnula je LPS-induciranu upalu u BMDM stanicama

Kako bismo istražili ulogu FPR2 u upali makrofaga, upotrijebili smo siRNA da srušimo FPR2 u BMDM stanicama. Rezultati su pokazali da transfekcija siRNA može značajno inhibirati ekspresiju FPR2 u makrofagu izazvanom LPS-om (Slika 5A) i učinkovito smanjiti ekspresiju IL-1b i TNF-a (Slika 5B i C). Osim toga, rezultati Western blota dokazali su da je nakon transfekcije siRNA, razina proteina FPR2 značajno inhibirana, bez obzira na to je li stimuliran LPS (Slika 5D i E). Značajno je da je obaranje FPR2 značajno smanjilo razine proteina upalnih citokina i inhibiralo aktivnost NF-kB signalizacije (Slika 5FeK), što ukazuje da FPR2 igra važnu ulogu u promicanju upalnog odgovora u makrofagima. Također, može biti ključna meta ISL-a za inhibiciju upale makrofaga.

3.6. Pretjerana ekspresija FPR2 poništila je protuupalni učinak izolikviritigenina u BMDM stanicama izazvanim LPS-om

Kako bismo utvrdili da ISL suzbija upalu u AKI putem inhibicije FPR2 u makrofagu, upotrijebili smo plazmid prekomjerne ekspresije FPR2 da pojačamo ekspresiju FPR2 u ISL tretiranim upalnim BMDM stanicama. Kao što je prikazano na slici 6, razina proteina i mRNA FPR2 bila je značajno povećana u skupini transficiranoj s pcDNA3.1- FPR2 (Slika 6A, B, G), a prekomjerna ekspresija FPR2 učinkovito je ukinula inhibitorni učinak 40 mM ISL na aktivaciju p65 i razine proteina IL-1b, IL-6 i TNF-a u BMDM stanicama izazvanim LPS-om (Slika 6CeF). Slično tome, pojačana FPR2 uklonila je supresivni učinak 40 mM ISL na ekspresiju i izlučivanje upalnih citokina u BMDM stanicama izazvanim LPS-om, kao što su IL-1b, IL-6 i TNF-a (Sl. 6HeM), što sugerira da je ISL smanjio upalu u BMDM stanicama izazvanim LPS-om inhibicijom FPR2.

4. Rasprava

Akutno oštećenje bubrega jedno je od čestih kliničkih oboljenja. Obično dovodi do poremećaja imunološke funkcije bolesnika u kratkom razdoblju. U slučajevima traumatskog gubitka krvi, oštećenja organa, šoka, bubreg je najosjetljiviji organ i sklon je razvoju akutne ozljede.18e20 Brojne studije potvrdile su da upala igra ključnu ulogu u razvoju AKI, što se smatra kao potencijalni cilj intervencije za liječenje AKI. Posljednjih godina, kineski lijekovi su postigli ogroman napredak u intervenciji kod upala, uključujući kurkumin, kvercetin, naringenin i druge monomere. Iso-liquiritigenin je flavonoidni spoj koji ima mnoge biološke aktivnosti, kao što su protuupalni, anti-slobodni radikali, antitumorski i drugi učinci.21 Prethodne studije su otkrile da ISL inhibira apoptozu, upalu i proizvodnju izvanstaničnog matriksa u angiotenzinu II-inducirane HK-2 stanice.22 Studije Wu Yangpinga pokazale su da ISL može smanjiti IL-6 i IL-8 inhibicijom aktivnosti NF-kB u modelu psorijaze, što sugerira ISL bi mogao biti kandidat za liječenje psorijaze i drugih autoimunih upalnih bolesti.23 S druge strane, nedavna studija pokazala je da ISL može ublažiti septičku AKI suzbijanjem translokacije NF-kB p65 i inhibicijom upalnih odgovora.24 U ovoj studiji, mi otkrili su da ISL može učinkovito poboljšati funkciju bubrega kod miševa AKI izazvanih cisplatinom, smanjiti oštećenje bubrega i inhibirati upalu bubrega. Međutim, točan mehanizam inhibicije upale ISL-om nije jasan.

FPR2 pripada obitelji kemotaktičkih receptora i G protein-vezani je receptor 7 puta transmembranski. Prethodne studije su otkrile da je FPR2 uključen u niz fizioloških i patoloških procesa, uključujući obrambene reakcije, upale, neurodegenerativne bolesti, tumore, poremećaje povezane s metabolizmom glukoze i lipida.25,26 FPR2 mogu regulirati lipopolisaharidi, različiti upalni čimbenici, i prostaglandin E2 u upalnom procesu koji može imati protuupalnu i proupalnu ulogu.27,28 Različiti učinci FPR2 na upalu ovise o okolini i ligandima koji aktiviraju različite signalne putove.29 U ovoj studiji otkrili smo da FPR2 se uglavnom eksprimira u makrofagima u bubrežnom intersticiju, a visoko je eksprimiran u bubregu miševa AKI izazvanog cisplatinom, što sugerira da bi FPR2 u makrofagima mogao biti uključen u upalni odgovor makrofaga u AKI bubrega. Sve više dokaza potvrdilo je da se veliki broj makrofaga infiltrirao u bubreg unutar nekoliko sati nakon pojave AKI i pogoršao oštećenje bubrega reagirajući na upalu.30e33 Stoga, smanjenje upale infiltriranih makrofaga u AKI bubrega može biti važan smjer za poboljšanje AKI, a nije poznato je li FPR2 uključen u ovaj proces.

Naši eksperimentalni rezultati pokazali su da liječenje niskim i visokim dozama ISL-a kod miševa AKI izazvanih cisplatinom ne samo da može poboljšati strukturu i funkciju bubrega, već i smanjiti razinu upalnih citokina. Osim toga, ISL može učinkovito smanjiti razinu proteina FPR2 i aktivnost p65. Budući da se FPR2 uglavnom eksprimira u makrofagima, to ukazuje da ISL može poboljšati upalu bubrega inhibicijom FPR2 u makrofagima. Zbog važne uloge infiltriranih makrofaga u upali bubrega, zatim smo ekstrahirali primarne makrofage koji potječu iz koštane srži za in vitro detekciju učinka poboljšanja ISL-a na upalu makrofaga i potencijalni mehanizam. Naši su rezultati pokazali da ISL može značajno inhibirati upalu makrofaga izazvanu LPS-om i smanjiti ekspresiju i izlučivanje čimbenika upale IL-1b, IL-6 i TNF-a. U isto vrijeme, ISL također može smanjiti razinu proteina upalnih molekula u makrofagu i inhibira ekspresiju mRNA i razine proteina FPR2 stimulirane LPS-om. Kako bismo potvrdili ključnu ulogu FPR2 inhibicije upale s ISL-om, upotrijebili smo plazmid pcDNA3.1-FPR2 za prekomjernu ekspresiju FPR2 i otkrili da u upalnom makrofagu tretiranom s ISL-om, prekomjerna ekspresija FPR2 neutralizira inhibicijski učinak ISL-a na upalu, što ukazuje da je ISL-regulirana upala makrofaga uglavnom putem inhibicije FPR2. Značajno, koristili smo model AKI izazvan cisplatinom in vivo i odabrali model upalnih stanica induciran LPS in vitro. Iako indukcijski reagensi dvaju modela nisu konzistentni, ove su dvije metode trenutno priznate za konstrukciju modela upale in vivo odnosno in vitro. S obzirom da je ovo istraživanje usredotočeno na upalne reakcije, moguće je koristiti ove dvije metode u jednoj studiji.

Ovi podaci dokazuju da ISL može učinkovito smanjiti ekspresiju upalnih čimbenika in vivo i in vitro, a može se postići inhibicijom ekspresije FPR2. ISL stoga može poslužiti kao potencijalni terapijski lijek za AKI.

Priznanja

Ovaj rad poduprli su Zajednički projekt Luzhou - Southwest MedicalUniversity (2017LZXNYD-P01 i 2018LZXNYD-PT03), Southwest Medical University - Zajednički projekt bolnice tradicionalne medicine (2018XYLH-034), Projekt izgradnje ključnog laboratorija pokrajine Sichuan Medicina (2018#53), Luzhou projekt znanosti i tehnologije (2020-JYJ-56) i Luzhou Municipal - Southwest Medical University Joint Special Grant for the Introduction of High-Level Talents (Tim Lan Hui-Yao ).

Reference

1. Soares DB, Mambrini JVM, Botelho GR, Girundi FF, Botoni FA, Martins MAP. Terapija lijekovima i drugi čimbenici povezani s razvojem akutne ozljede bubrega u kritično bolesnih pacijenata: studija presjeka.PeerJ. 2018;6:e5405. e-pub prije tiska 2018/08/22.

2. Sato Y, Yanagita M. Imunološke stanice i upala u AKI do progresije CKD.Am J Physiol Ren Physiol. 2018;315(6):F1501eF1512. e-pub ispred tiska 2018/ 08/30.

3. Ram P, Mezue K, Pressman G, Rangaswami J. Akutna ozljeda bubrega nakon transkateterske zamjene aortnog zaliska.Clin Cardiol. 2017;40(12):1357e1362. e-pub prije tiska 2017/12/19.

4. YH H, IJ C, YF L, YJ C, YH L, HW C. Laktoferin doprinosi renoprotektivnom učinku kod akutne ozljede bubrega i rane bubrežne fibroze.Farmaceutika. 2020;12(5):434.

5. Bonavia A, Singbartl K. Pregled uloge imunoloških stanica u akutnoj ozljedi bubrega.Pediatr Nephrol. 2018;33(10):1629e1639. e-pub prije tiska 2017/08/13.

6. Li J, Tang Y, Tang PMK, et al. Blokiranje faktora inhibicije migracije makrofaga štiti od akutne ozljede bubrega izazvane cisplatinom kod miševa.Mol Ther. 2018;26(10):2523e2532. e-pub prije tiska 2018/08/06.

7. Ferenbach DA, Sheldrake TA, Dhaliwal K, et al. Deplecija makrofaga/monocita klodronatom, ali ne i toksinom difterije, poboljšava bubrežnu ishemiju/reperfuzijsku ozljedu kod miševa.Kidney Int. 2012;82(8):928e933. e-pub prije tiska 2012/06/08.

8. JQ, JC, BM, et al. Izolikviritigenin inhibira aterosklerozu blokiranjem ekspresije TRPC5 kanala.Kardiovaskularni terapeutici. 2020;2020:1926249.

9. YG, XL, HY, LP, X C. Izolikviritigenin ima antioksidativne i protuupalne učinke putem aktivacije puta KEAP-1/Nrf2 i inhibicije putova NF-kB i NLRP3 kod pleuritisa izazvanog karagenanom.Hrana& funkcija. 2020;11(3):2522e2534.

10. LS, XY, XY, YW, Q Z. Izolikviritigenin inducira apoptozu T24 stanica raka mokraćnog mjehura putem mehanizma neovisnog o ciklinu kinaze.Onkološka pisma. 2017;14(1):241e249.

11. Wang JR, Luo YH, Piao XJ, et al. Mehanizmi koji leže u osnovi apoptoze inducirane izolikviritgeninom i zaustavljanja staničnog ciklusa putem puteva MAPK/STAT3/NF-kapaB posredovanih ROS-om u stanicama ljudskog hepatocelularnog karcinoma.Drug DevRes. 2019;80(4):461e470. e-pub prije tiska 2019/01/31.

12. AH, CS, YY, et al. Procjena estrogenske aktivnosti vrsta sladića u usporedbi s hmeljem koji se koristi u botanici za simptome menopauze.PLoSJedan. 2013;8(7):e67947.

13. LL L, PM T, CJ L, et al. Receptor za prepoznavanje uzoraka, Mincle, bitan je za održavanje fenotipa M1 makrofaga kod akutne upale bubrega.Kidney Int. 2017;91(3):587e602.

14. Schroder N, Schaffrath A, Welter JA, et al. Inhibicija receptora formil peptida poboljšava ishod u mišjem modelu Alzheimerove bolesti.JNeuroinflamacija. 2020;17(1):131. e-pub prije tiska 2020/04/26.

15. Neymeyer H, Labels R, Reverte V, et al. Aktivacija signalizacije aneksina A1 u bubrežnim fibroblastima ima antifibrotske učinke.Acta Physiol. 2015;215(3):144e158. e-pub prije tiska 2015/09/04.

16. FC, MP, RA. Različite signalne kaskade izazvane različitim agonistima receptora formil peptida 2 (FPR2).Int J Mol Sci. 2013;14(4):7193e7230.

17. HW, XP, YG, et al. Spoj izveden iz Ganoderme-A ima inhibitorni učinak putem receptora formil peptida 2.Front Pharmacol. 2020;11:337.

18. Wang Y, Cai J, Tang C, Dong Z. Mitofagija kod akutne ozljede bubrega i popravak bubrega.Stanice. 2020; 9 (2). e-pub prije tiska 2020/02/07.

19. Sato Y, Takahashi M, Yanagita M. Patofiziologija AKI do progresije CKD.Semin Nefrol. 2020;40(2):206e215. e-pub prije tiska 2020/04/19.

20. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Akutna ozljeda bubrega.Lanceta. 2019;394(10212): 1949e1964. e-pub prije tiska 30.11.2019.

21. PZ, HM J, JW Z, et al. Zaštitni učinak izolikviritenina protiv cerebralne ozljede u septičkih miševa putem atenuacije NF-kB.Uflamofarmakologija. 2019;27(4): 809e816.

22. DX, WH, ST Y, YS T. Izolikviritigenin je ublažio hipertenzivnu bubrežnu ozljedu izazvanu Ang II suzbijanjem citokina upale i apoptoze izazvane oksidativnim stresom putem puteva Nrf2 i NF-kB.Biochem BiophysRes Commun. 2018;506(1):161e168.

23. YW, XC, XG, et al. Izolikviritigenin sprječava napredovanje simptoma sličnih psorijazi inhibicijom NF-kB i proinflamatornih citokina.J MolMed(Berl). 2016;94(2):195e206.