Kvantitativna proteomska studija razotkriva put fibrinogena kod policistične bolesti jetre Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Rezultati
3.1. Bubrezi i jetra ne slijede iste cistične mehanizme
Prethodne studije pokazale su da rana inaktivacija gena Pkd1 (prije p12) izaziva brzi razvoj policistične bolesti (cistični prozor), dok inaktivacija nakon p14 dovodi do kasnog stvaranja ciste nakon 4-5 mjeseci, s blagim fenotipom (ne-cistični prozor) [19]. Koristeći isti ortologni model ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], istražili smo odgovara li ovaj prozor bubrežnog razvoja u vremenu sličnom prozoru jetrenog razvoja. Da bismo napravili izravnu usporedbu s našim prethodnim studijama [37], miševi su inducirani s tamoksifenom da inaktiviraju gen Pkd1 u postnatalnim danima 14 (p14) i 12 (p12) i žrtvovani su u dobi od 30 dana (p30). Zanimljivo je da smo uočili cistični fenotip u obje vremenske točke s različitim stupnjem bolesti (blagi i teški), što sugerira da bubreg i jetra imaju neovisne cistične razvojne prozore (Slika 1a) i/ili moguće različito vrijeme i progresiju bolesti. . Nisu pronađene razlike između mužjaka i ženki u ovoj dobi klanja između oba prozora inaktivacije (n=6 korišteno je za svaku skupinu mutanata). Životinje mutanti p14 pokazale su blaži fenotip od skupine mutanata p12 s nižim vrijednostima cističnog indeksa, broja cista i funkcije jetre prema vrijednosti ALP u serumu (Slika 1b–d). Ovo je prva studija koja pokazuje različite razvojne prozore/mehanizme za Pkd1 nedostatak jetre i bubrega. Te molekularne razlike morat će se utvrditi u budućim studijama.
Slika 1. Karakterizacija fenotipa cistične jetre 3. dana 0 iz stadija p12 i p14. Pkd1 delecija na p12 nosi težu cistogenezu. (a) Reprezentativne makroskopske i mikroskopske slike hematoksilin-eozina obojenog iz jetre divljeg tipa Pkd1cond/cond;Tam-Cre miša (WT, Pkd1cond/cond;Tam-Cre−) i mutanta (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ ) s delecijom gena Pkd1 induciranom tamoksifenom 14. (p14 skupina) i 12. (p12 skupina) postnatalnog dana. Svi miševi su žrtvovani na p30. Mjerna traka, 2 mm (gornja ploča) 100 µm (donja ploča). n predstavlja broj uzoraka po skupini, a Bd označava žučni kanal. (b,c) Jetreni cistični indeks i broj cista različitih fenotipova. (d,e) Vrijednosti ALP i ALT u krvnom serumu. Stupci predstavljaju srednje vrijednosti ± SEM u svim slučajevima. Značajnim rezultatom smatra se p < 0,05 prema Studentovom t-testu (dvostrani). ns ne predstavlja značaj. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Kliknite za cistanche herba za bolesti bubrega
3.2. Sačmarica i SWATH-MS proteomska analiza u PLD-u
Kao što je navedeno na slici 2, izvršili smo diferencijalnu analizu proteoma u oba cistična stadija (p12—teška cistična bolest- i p14—blaga cistična bolest-) mutanata (KO) u usporedbi s životinjama divljeg tipa (WT), kako bismo identificirali i karakterizirati relevantne molekularne mehanizme koji prolaze kroz cistogenezu jetre i napredovanje bolesti.
Slika 2. Ilustrirana shema tijeka rada. Koristili smo ADPKD mišji model (Pkd1cond/cond; Tam-Cre miševi) u kojem je genetska inaktivacija Pkd1 bila inducirana primjenom tamoksifena postnatalnog dana 10 (p10) i p11 (brzo napredovanje bolesti) ili p15 i p16 (odgođeno napredovanje bolesti). ) prema razvojnoj skretnici za bubrežnu cistogenezu, definirajući dvije skupine studije nazvane p12 i p14 [19]. Za obje skupine koristili smo n jednak ili veći od šest jedinki divljeg tipa (WT) i mutanata (KO) u svakom stanju, a sve su životinje žrtvovane na p30. Proučavali smo diferencijalni proteom WT i KO jetre u obje težine cistične bolesti jetre (Slika 1), koristeći kvantitativnu proteomsku SWATH–MS i DDA-MS analizu koja ovisi o podacima sačmarice. Od proteina sa značajnom promjenom u obilju koristili smo bioinformatiku Slika 2. Ilustrirana shema tijeka rada. Koristili smo ADPKD mišji model (Pkd1cond/cond;Tam-Cre miševi) u kojem je genetska inaktivacija Pkd1 bila inducirana primjenom tamoksifena 10. dana postporođaja (p10) i p11 (brzo napredovanje bolesti) ili p15 i p16 (odgođeno napredovanje bolesti). ) prema razvojnoj skretnici za bubrežnu cistogenezu, definirajući dvije skupine studije nazvane p12 i p14 [19]. Za obje skupine koristili smo n jednak ili veći od šest jedinki divljeg tipa (WT) i mutanata (KO) u svakom stanju, a sve su životinje žrtvovane na p30. Proučavali smo diferencijalni proteom WT i KO jetre u obje težine cistične bolesti jetre (Slika 1), koristeći kvantitativnu proteomsku SWATH–MS i DDA-MS analizu koja ovisi o prikupljanju podataka sačmarice. Od proteina sa značajnom promjenom u obilju, koristili smo bioinformatičke alate za otkrivanje novih terapijskih ciljeva i putova uključenih u bolest. Naposljetku, potvrdili smo te mete koristeći prvo in silico (DDA vs SWATH analiza) i konačno in vivo strategije, kao i RT-qPCR, Western blotting i imunohistokemiju. p znači postnatalni dan
Uzorak ekspresije proteina u jetrenoj cistogenezi Prvo smo izvršili analizu proteomske masene spektrometrije DDA-MS ili DDA ovisno o prikupljanju podataka. Ova analiza omogućuje karakterizaciju proteoma iz kompletnih i pojedinačnih uzoraka, osiguravajući prisutnost/odsutnost proteina s visokom osjetljivošću, ali bez pružanja njihove kvantifikacije. Isključivo smo uzeli u obzir sve proteine koji su različito izraženi u više od pet neovisnih uzoraka od ukupno šest uzoraka, za p14 i p12 faze divljeg tipa i mutantnih jedinki (slika S1). Na p14 identificiran je 1 protein koji isključuje WT (ili smanjen za bolest) i 7 proteina koji isključuje MUT (reguliran na gore), dok je na p12 uočeno osam proteina koji isključuju WT i šest proteina koji isključuju MUT (slika S1).
Zatim smo upotrijebili metodu koja nam je omogućila kvantificiranje različito izraženih proteina. Proveli smo SWATH–MS kvantitativnu proteomsku analizu na istim uzorcima koje smo koristili za DDA, dobivši ~1500 proteina po uzorku i više od 2000 proteina u svakoj studijskoj skupini. Prvo smo izvršili normalizaciju zbroja ukupne površine (TAS) kako bismo procijenili da naši uzorci slijede normalan obrazac distribucije, kao što je prikazano na slikama S2 i S3. Zatim smo proučavali protein sa značajnim razlikama između divljeg tipa i mutantnih skupina. Tablica 1 prikazuje proteine sa značajnom promjenom u obilju s dvostrukim povećanjem (regulirano prema gore) ili smanjenjem (regulirano prema dolje) i značajnom prilagođenom p-vrijednošću (prema parametarskom Studentovom t-testu) u WT vs MUT uzorci na p14 i p12. Ukupno je šest proteina pokazalo značajne razlike u obilju proteina između skupina WT p14 i MUT-p14 (pet proteina s regulacijom na gore i jedan protein s nižom regulacijom). Između WT-p12 i MUT-p12, 26 proteina (20 proteina s pojačanom regulacijom i 6 proteina s nižom regulacijom) pokazalo je značajne razlike (Slika 3a i Tablica 1). Grafički, ove varijacije mogu se promatrati kroz grafikone vulkana, koji su generirani crtanjem log(2)-strukih promjena za sve identificirane proteine u odnosu na njihovu −log(10) p-vrijednost (Slika 3b). Značajne razlike među razinama obilja proteina mogu se vizualizirati u toplinskoj karti s individualiziranim vrijednostima prema područjima spektralne biblioteke, te njihovoj razini klasteriranja u analizi toplinske karte klastera (slike 3c i S4). Ovi klasteri otkriveni SWATH–MS analizom pomažu nam da identificiramo one kvalitativno odvojene uzorke koji će se uzeti u obzir za kvantitativnu analizu (Slika S5). Provedena je nenadzirana multivarijatna statistička analiza korištenjem analize glavnih komponenti (PCA) za usporedbu podataka između uzoraka (Slika S6). Podaci o toplinskoj karti i PCA pokazali su ponovljivost među triplikatima uzoraka budući da su tri replikata usko grupirana u obje analize. I u PCA i u analizi klastera toplinske karte (slike S5 i S6) možemo primijetiti kako neki uzorci nisu pravilno grupirani, preklapajući se između oba klastera. Unatoč tome, možemo vidjeti tendenciju razdvajanja podataka u klasterima divljeg tipa i mutanata. Manji broj proteina sa značajnim razlikama u p14 u odnosu na p12 mogao bi se opravdati različitim stupnjem ozbiljnosti (Slika 2), što sugerira da se broj proteina i putova povećava na temelju ozbiljnosti i statusa bolesti cističnog fenotipa.
3.3. Grupiranje, obogaćivanje putanje i analiza protein-protein interakcije ekspresije gena u PLD-u
Kako bismo utvrdili funkciju povezanu s različito izraženim proteinima identificiranim SWATH-MS analizom, upotrijebili smo nekoliko bioinformatičkih alata i oblika analiza. Termini genske ontologije (GO) i analize putova provedene su pomoću FunRich [39,40], String [41] i Reactome [42]. Proteini su sortirani u analizi obogaćivanja gena FunRich. Što se tiče biološkog procesa, najobogaćenija skupina proteina za skupinu p14 (blaga cistična) bila je povezana s transportom masnih kiselina i biosintezom prostaglandina, a za skupinu p12 (teška cistična) s aktivnošću fibrinogena/fibrina, adhezijom stanica-stanica/matriks i metaboličkim procesa (Slika 4a, gornja ploča). ANXA2 i kompleks fibrinogena bile su dvije najobogaćenije stanične komponente u p14 i p12 skupinama. Nadalje, izvanstanični prostor bio je stanična komponenta s najvećim postotkom proteina u obje skupine (Slika 4a, donja ploča). Slično, ista analiza je uspostavljena analizom nizova, identificirajući različite metaboličke procese kao glavne biološke procese, a izvanstanični prostor kao najobogaćeniju staničnu komponentu; u skladu s rezultatima GO (Slika S7a). Konačno, ponovili smo analizu s platformom Reactome, otkrivši da su metabolizam i imunološki sustav najobogaćeniji putovi (Slika S7b).
Protein-protein ili analiza klastera temeljena na string analizi također je provedena kako bi se istražile moguće interakcije protein-protein (interakcije s eksperimentalnim dokazima). Brojne interakcije proteina identificirane su u različitim skupinama (Slika S8), ali jedan klaster na p14 i drugi na p12 bili su najrelevantniji na temelju broja interakcija između proteina i razine ekspresije (Slika 4b). Skupina p14- sadrži protein aneksin A2 (ANXA2_P07356) povezan s nekoliko staničnih funkcija, kao što je fibrinoliza, pokretljivost stanica (u epitelnim stanicama), protein povezan s aktinom interakcije citoskeleta i stanične matrice [43], u interakciji s dva druga proteina uključena u unutarstanični transport lipida (FABP1_P12710 i FABP5_Q05816). Zanimljivo je da je još jedna relevantna skupina proteina identificirana u p12-klasteru s vrlo jakom interakcijom protein-protein između nekoliko fibrinogena (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22 }}E9PV24 i FIBGG_Q8VCM7). Fibrinogeni su uključeni u rast hepatocita i posreduju u širenju krvnih pločica, intersticijskog kolagena i fibroznih lezija [44]. Nadalje, otkriveno je da dodatni proteini stupaju u interakciju s fibrinogenima (Slika S8), kao što je serumska amiloidna p-komponenta (SAMP_P12246), hemopeksin (HEMO_Q91X72) ili oksidaza hidroksi kiseline 2 (HAOX{ {37}}Q9NYQ2). U skladu s rezultatima niza, ANXA2 i kompleksi fibrinogena također su bili najobogaćenije stanične komponente identificirane analizom FunRich (Slika 4a). Zanimljivo, uspoređujući podatke dobivene DDA i SWATH analizom, potvrdili smo da je nekoliko proteina identificiranih SWATH također identificirano DDA analizom, uključujući nekoliko povezanih s proteinima kompleksa fibrinogena (SAMP/Apcs i S10A9/S100a9; Tablica S3).
3.4. Validacija SWATH–MS analize razotkriva kompleks fibrinogena kao novi molekularni mehanizam povezan s PLD-om
Na temelju ovih podataka odabrali smo iz SWATH–MS analize (Slika S9) promijenjene proteine povezane s kompleksom fibrinogena u stadijima p12 i p14 za in vivo validaciju s RT-qPCR, Western blottingom i imunohistokemijom, kako bismo utvrdili njihovu moguću potvrdu mete bolesti. Osam od 10 ovih odabranih proteina potvrđeno je na razini mRNA pomoću RT-qPCR (Slika 5); jedan naviše reguliran na 14-fazi (ANXA2_P07356) i na p12-skupini (SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 i FIBG_Q8VCM7), i jedan dolje- reguliran na p12 skupini (HAOX2_Q9NYQ2). Zanimljivo, genska ekspresija dvaju proteina s većom udaljenošću ili manjim interakcijama sa skupinom fibrinogena (ILK i S10A9) bila je jedina koja nije potvrđena (Slika 5c).
Pojačana regulacija kompleksa fibrinogena (proteini ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG i HAOX2) dodatno je potvrđena Western blotting (WB) analizom (Slika 6). Sve u svemu, ekspresija gena i WB bili su vrlo konzistentni s proteomskim podacima SWATH-MS. Konačno, također smo proveli imunohistokemijsku validaciju kompleksa fibrinogena u uzorcima mutirane i policistične jetre (Slika 7). Bojenje fibrinogena bilo je snažno pojačano u epitelnim stanicama koje oblažu ciste i dilatacijama žučnih kanala (Slika 7a). Ovi rezultati razotkrivaju, po prvi put, kompleks fibrinogena kao mogući put povezan s jetrenom cistogenezom i kao moguću buduću terapijsku metu za PLD.
Slika 5. Validacija mogućih PLD ciljeva pomoću RT-qPCR. Ekspresija gena 8 do 10 odabranih ciljeva u korelaciji s podacima SWATH-MS. RT-qPCR-ovi pojačano reguliranog odabranog p14 ciljnog aneksina A2 (Anxa2) (a); pojačano regulirani p12 cilja na amiloidnu p komponentu, serum (Apcs, SAMP gen), fibrinogen sličan 1 (Fgl1), fibrinogen beta lanac (Fgb), hemopeksin (Hpx), fibrinogen alfa lanac (Fga), fibrinogen gama lanac (Fgg) (b), kinaza povezana s integrinom (Ilk) i S10{{30}} protein koji veže kalcij A9 (S100a9) (c); i niže regulirana p12 ciljna oksidaza 2 hidroksi kiseline (Hao2) (d). n=6 korišten je za svaku skupinu proteina. Gapdh je korišten kao gen za domaćinstvo. Stupci predstavljaju srednje vrijednosti ± SEM. Korišten je Studentov t-test s dva repa, a vrijednost p < 0,05 smatrana je značajnom. ns: nije značajno (p veće ili jednako 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Slika 7. Kompleks fibrinogena je pojačano reguliran u cističnom epitelu. (a,b) Reprezentativne slike imunohistokemije fibrinogena u žučnom kanalu (gornja slika) i parenhimu jetre (donja slika) (a) i njegova kvantifikacija (b). n=6 korišteno je za svaku grupu. Imunohistokemijska analiza pokazala je pojačanu regulaciju fibrinogena kroz cistični epitel. Uzorci su odgovarali p12 skupini. Ljestvice predstavljaju 100 µm. Bd znači žučni kanal. Stupci predstavljaju srednje vrijednosti ± SEM. Korišten je Studentov t-test s dva repa, a vrijednost p < 0,05 smatrana je značajnom. *** p < 0,001.
Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950
Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
