Oznake kvalitete Cistanches Herba temeljene na odnosu spektra antioksidansa i učinka

Sažetak: Cilj: Uspostaviti metodu istraživanja za markere kvalitete (Q-markeri) zaCistanches Herba(CH) na temeljuodnos spektra antioksidansa i učinka, pružajući osnovu za proučavanje njegovih farmakoloških tvari i kontrolu kvalitete. Metode: Tekućinska kromatografija ultravisoke učinkovitosti (UPLC) korištena je za određivanje profila otisaka prstiju za 10 serija CH. Model staničnog oksidativnog oštećenja uspostavljen je korištenjem H2O2, a antioksidativni kapacitet CH određen je na temelju polumaksimalne inhibitorne koncentracije reaktivnih vrsta kisika, kao i razinesuperoksidedizmutazaikatalazakaofarmakološki pokazatelji. Odnos spektar-učinak konstruiran je analizom glavnih komponenti, Pearsonovom korelacijskom analizom i djelomičnom regresijskom analizom najmanjih kvadrata. Theaktivne komponentebili podvrgnutifarmakološka validacija. 

Rezultati:Profili otisaka prstiju za CH uspostavljeni su korištenjem UPLC, identificirajući 17 uobičajenih vrhova. Na temelju korelacijske analize spektar-učinak odabrano je devet komponenti. Rezultati farmakološke validacije pokazali su da genipozidna kiselina, 8-epiloganska kiselina,ehinakozid,akteozid, izoakteozid, itubulozid Apokazao antioksidativno djelovanje na način ovisan o koncentraciji.

Zaključak: Ova studija istraživala je Q-markere za CH na temelju odnosa spektar-učinak, pružajući referentne informacije za temelj farmakološke tvari i poboljšanje standarda kvalitete.

Ključne riječi:Cistanches Herba; Q-marker;odnos spektar-učinak; antioksidans

Cistanche deserticola je osušena mesnata stabljika s ljuskastim listovima Cistanche deserticola YCMa ili Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, biljke koja pripada obitelji Cistanche deserticola orbaceae. Tople je naravi, slatkog i slanog okusa; vraća se u meridijane bubrega i debelog crijeva; ima učinke njegovanja yanga bubrega, obnavljanja esencije i krvi, vlaženja crijeva i laksativa te je važan lijek za toniziranje bubrega i obnavljanje esencije [2-3]. Bubrezi pohranjuju esencija, a esencija i krv dolaze iz istog izvora. Ako su esencija i krv manjkavi, to će utjecati na ukupne životne aktivnosti ljudskog tijela; srž koja proizvodi esenciju pohranjena je u kostima, a mozak je more srži. Ako je bubrežna esencija nedostatna, kosti će izgubiti hranu, a mozak će biti manjkav, što će rezultirati degenerativnim promjenama kostiju kao što su opuštena tekstura, gubitak zuba, gubitak pamćenja, demencija i smanjena imunološka funkcija [4-6]. Cistanche deserticola sadrži feniletanoidne glikozide, iridoide, lignane i druge strukturne komponente, uključujući ehinakozid, verbaskozid, verbaskozid, genipinsku kiselinu i 8-epistrijansku kiselinu. , tubulin A, itd. [7]. Trenutna kontrola kvalitete Cistanche deserticola u izdanju "Farmakopeje Narodne Republike Kine" iz 2020. propisuje samo sadržaj ehinakozida i verbaskozida, što ne može u potpunosti odražavati karakteristike višekomponentnog i višeciljnog djelovanja tradicionalne kineske medicine. , što ne pogoduje njegovoj kontroli i ocjeni kvalitete.

Kako bi se poboljšala razina kontrole kvalitete tradicionalne kineske medicine i optimizirala procjena kvalitete tradicionalne kineske medicine, akademik Liu Changxiao predložio je novi koncept markera kvalitete (Q-marker) tradicionalne kineske medicine [8]. Među njima, "učinkovitost" je ključni element u "Pet principa" Q-markera [9] i također je srž procjene kvalitete tradicionalnih kineskih lijekova.

S obzirom na trenutni status istraživanja slabe korelacije između standarda kvalitete i učinkovitosti lijekova, istraživanje Q-markera tradicionalnih kineskih lijekova i uspostavljanje znanstvenijih i razumnijih standarda kvalitete od velikog je značaja za poboljšanje kvalitete tradicionalnih kineskih lijekova. Odnos spektar-učinak povezuje kromatografske vrhove otiska prsta tradicionalne kineske medicine sa specifičnim farmakodinamičkim podacima kako bi se pronašle učinkovite tvari tradicionalne kineske medicine, čime se odražava inherentna kvaliteta tradicionalne kineske medicine [10]. Uspostavljanje matematičkog modela spektralne učinkovitosti može razjasniti QMarker tradicionalne kineske medicine iz perspektive "holističkog pogleda", pružajući više referenci za kasniju kontrolu kvalitete tradicionalne kineske medicine, formuliranje standarda kvalitete i provjeru aktivnih sastojaka. Ova studija koristi otiske prstiju u kombinaciji sa stopom poluinhibicije reaktivnih kisikovih vrsta (ROS IC50), sadržajem superoksid dismutaze (SOD) i katalaze (CAT) za proučavanje odnosa spektra i učinka tradicionalne kineske medicine, te koristi analizu glavnih komponenti (PCA) ), Pearsonovu korelacijsku analizu (PCC) i djelomičnu regresijsku analizu najmanjih kvadrata (PLS) za sveobuhvatnu analizu Q-markera Cistanche deserticola kako bi se osigurala osnova za kontrolu kvalitete.

1 materijal

1.1 Uzorak

Cistanche deserticola ubrana je u okrugu Yutian, Xinjiang, iu bazi dobre poljoprivredne prakse (GAP) Cistanche deserticola u unutarnjoj Mongoliji. Identificirao ga je istraživač Zhang Tiejun iz Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. kao Cistanche tubulosa (Schenk) Wight i Cistanche deserticola.

YC Ma, detaljne informacije prikazane su u tablici 1.

1.2 Testni lijek

Ehinaceazid (broj serije: 111670-201907, čistoća: 91,8%) i verbaskozid (broj serije: 111530-201914, čistoća: 95,2%) kupljeni su od Kineskog instituta za kontrolu hrane i lijekova; izoreskozid (broj serije: 61303-13 -7), salidrozid (broj serije: 10338-51-9), 8-epistrihnoična kiselina (broj serije: 82509-41-9), genipinska kiselina (broj serije: Z24A10X95926) , tuberoza B (Broj serije: 112516-04-08), 2-acetil eugenol glikozid (Broj serije: 94492-24-7) kupljeni su od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., čistoća veća ili jednaka 98%; Cistanche glikozid A (Broj serije: MUST -20062806, čistoća: 98,51%), floridin A (broj serije: MUST19110102, čistoća: 98,57%) kupljeni su od Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; kromatografski čisti acetonitril i mravlja kiselina kupljeni su od Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Pročišćena voda (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamin E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company); dimetil sulfoksid (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company iz Sjedinjenih Država); CellTiter 96® AQueous komplet za detekciju proliferacije stanica s jednom otopinom (G3580, Promega Company iz Sjedinjenih Država); CAT detekcija Komplet (S0051), pribor za otkrivanje aktivnosti SOD (S0101M) i pribor za otkrivanje ROS (S0033S) kupljeni su od Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrumenti

Waters H-class-PDA tekućinski kromatograf ultravisoke učinkovitosti (Waters Company, SAD); Sartorius BT25S elektronička vaga (Sartorius Company, Njemačka); Stolna centrifuga velike brzine H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Čitač mikropločica (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Biološki mikroskop WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 ćelije

Bubrežne stanice ljudskog embrija Stanice HEK 293 korištene su u ovom eksperimentu i kupljene su od banke stanica Kineske akademije znanosti.

2 metode

2.1 Uspostava karte otisaka prstiju

2.1.1 Priprema ispitne otopine: Izvažite 2 g ljekovitog materijala Cistanche deserticola, dodajte 10 puta više vode, zagrijte i refluksirajte 3 puta, 1 h svaki put, centrifugirajte na 1.0 ×105r·min-1 tijekom 15 minuta (centrifugalni radijus je 300 mm), Spojite supernatante i koncentrirajte kako biste dobili temeljnu otopinu s masenom koncentracijom od 100 mg·mL-1, razrijedite je 10 puta, i filtrirati kroz mikroporoznu filtarsku membranu od 0,22 µm da se dobije.

2.1.2 Priprema miješane referentne otopine

Uzmite 8-epistrihničnu kiselinu, salidrozid, ehinaceazid, cistanhe glikozid A, genipinsku kiselinu, verbaskozid, antocijanozid A, izorbaskozid i 2'-acetil eugenol. Referentne tvari glikozida i angiozida B izmjerene su u odgovarajućim količinama i točno izvagane. Dodajte 50% otopinu metanola za otapanje i pripremite miješanu otopinu referentne tvari s masenom koncentracijom od 20 µg·mL–1.

2.1.3 Kromatografski uvjeti

ACQUITY UPLC®BEH C18 kolona (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); mobilna faza je acetonitril (A) ~ 0.1% otopina mravlje kiseline (B), program gradijenta eluacije (0 ~ 6 min, 5% ~ 8% A; 6 ~ 10 min, 8% ~ 15% A 10~13 min, 15%~19%A, 13~20 min, 19%~25%A); valna duljina detekcije je 237 nm; brzina protoka je 0,4 mL·min –1; temperatura kolone je 40 stupnjeva; volumen injekcije je 3 µL.

2.1.4 Odabir referentnog vrha

U kromatogramu tekućinske kromatografije ultraučinkovitosti (UPLC) Cistanche deserticola, vrh s najvećim omjerom površine vrha, umjerenim vremenom zadržavanja i dobrim odvajanjem odabran je kao referentni vrh spektra otiska prsta. 2.1.5 Metodološko ispitivanje Ispitivanje preciznosti: Uzmite uzorak T1 i pripremite ispitnu otopinu prema metodi pod 2.1.1. Ubrizgajte uzorak 6 puta neprekidno i zabilježite otisak prsta. Rezultati pokazuju da je relativna površina pika RSD svakog pika 0.10%~4.61%. , RSD relativnog vremena zadržavanja je 0,08%~1,32%, što ukazuje da instrument ima dobru preciznost.

Ispitivanje ponovljivosti: Uzmite uzorak T1 i paralelno pripremite 6 uzoraka ispitne otopine u skladu s metodom pod 2.1.1. i kontinuirano ubrizgavajte uzorak. Rezultati pokazuju da je relativna površina pika RSD svakog kromatografskog pika 1,35%~4,80%, a relativno vrijeme zadržavanja RSD 0,10%~1,80%, što zadovoljava zahtjeve otiska prsta i pokazuje da ponovljivost instrumenta je dobar.

Test stabilnosti: Uzmite uzorak T1 i pripremite testnu otopinu u skladu s metodom pod 2.1.1, ubrizgajte uzorke za testiranje na 0, 2, 4, 8 i 12 sati i zabilježite otisak prsta. Izračunati RSD relativne površine vrha svakog kromatografskog vrha je 0,53%~4,82%, a RSD relativnog vremena zadržavanja je 0,09%~2,17%, što ispunjava zahtjeve otiska prsta i pokazuje da je testni proizvod stabilan unutar 12 sati.

2.2. Istraživanje antioksidativnog djelovanja Cistanche deserticola

2.2.1 Priprema matične tekućine Cistanche deserticola:Uzeti matičnicu pod točkom 2.1.1., filtrirati i sterilizirati te prije upotrebe razrijediti s medijom kulture do potrebne koncentracije.

2.2.2 Učinci Cistanche deserticola i pozitivne kontrole VE na održivost stanica HEK 293

Postavite normalnu skupinu (stanična suspenzija), skupinu za primjenu Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), VE skupinu (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), svaki Postavite 6 duplih jažica za svaku koncentraciju i kulturu tijekom 24 sata. Dodajte 20 µL CellTiter 96® AQueous pojedinačne otopine reagensa u svaku jažicu kako biste otkrili vitalnost stanica. Nastavite s uzgojem 2 sata. Upotrijebite čitač mikropločica za detekciju vrijednosti apsorbancije (OD) svake jažice na 490 nm. Izračunajte stopu preživljavanja stanica prema formuli (1). Stopa preživljenja (%)=(OD eksperimentalna skupina/OD prazna skupina) × 100% (1)

2.2.3 Učinak Cistanche deserticola na ROS induciran H2O2 u HEK 293 stanicama

Stanice su podijeljene u normalnu skupinu (suspenzija stanica) i skupinu kojoj je davana Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola i 60 µm·L–1 H2O2) i uzgajane 24 sata. Slijedite korake pribora za otkrivanje ROS-a za sljedeće operacije, izravno promatrajte bojenje stanica kroz mikroskop i koristite čitač mikropločica za otkrivanje intenziteta fluorescencije svake skupine. Postavke parametara koristile su valnu duljinu pobude od 488 nm i valnu duljinu emisije od 525 nm. Eksperiment je ponovljen tri puta.

2.2.4 Učinak Cistanche deserticola na H2O2-inducirani SOD stanica HEK 293

Podijelite stanice na normalnu skupinu (stanična suspenzija) i modelnu skupinu

(60 µm·L–1 H2O2), skupina VE (60 µm·L–1 VE i 60 µm·L–1 H2O2), skupina za davanje Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola i 60 µm·L–1 H2O2), sakupite stanice nakon 24 sata kulture, dodajte otopinu za pripremu uzorka SOD za lizu stanica, centrifugirajte na 4 stupnja, 12000 r·min-1 5 minuta (centrifugalni radijus je 300 mm), uzmite supernatant kao uzorak za testiranje, slijedite komplet za detekciju SOD. Slijedite korake u nastavku. Eksperiment je ponovljen tri puta.

2.2.5 Učinak Cistanche deserticola na H2O2-inducirani CAT u HEK 293 stanicama

Slijedite metodu pod 2.2.4 i grupnu primjenu, dodajte otopinu za lizu, centrifugirajte na 4 stupnja, 12000 r·min-1 10 minuta (radijus centrifuge je 300 mm), uzmite supernatant i slijedite korake Komplet za detekciju CAT. Praćenje operacija. Eksperiment je ponovljen tri puta.

2.2.6 Statistička analiza

Za statističku analizu korišten je softver SPSS 26.0. Svaka grupa podataka predstavljena je s (±±(). Jednosmjerna analiza varijance provedena je na podacima koji su bili u skladu s normalnom distribucijom. Ako su varijance bile jednake, korištena je metoda najmanje značajne razlike. Ako su varijance bili neujednačeni, Dunnettova metoda T3 korištena je za crtanje grafikona, a P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Analiza korelacije spektra i učinka antioksidansa Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Površine vrhova zajedničkih vrhova 10 serija Cistanche deserticola koje su uspostavile otiske prstiju standardizirane su prema Z vrijednosti i napravljene u matrici podataka 10 × 17, koja je uvezena u softver SPSS 26.0 za PCA.

2.3.2 PCC Koristite SPSS 26.0 za provođenje bivarijatne analize za proučavanje odnosa spektralne učinkovitosti između otisaka prstiju Cistanche deserticola i antioksidansa.

Testiranje značajnosti koristi dvostrani test (T) s P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Uvezite eksperimentalne rezultate standardizirane površine vrha i antioksidansa Cistanche deserticola u softver SIMCA-P 14.1, postavite područje vrha kao varijablu X i postavite farmakodinamički indeks kao varijablu Y za izvođenje PLS-a.

2.4 Provjera antioksidativne aktivnosti Q-markera Cistanche deserticola

2.4.1 Priprema aktivnog sastojka matične tekućine

Točno izvažite odgovarajuće količine genipinske kiseline, 8-epistrihničke kiseline, ehinaceazida, verbaskozida, izorebaskozida i antocijanozida A i dodajte DMSO da ih otopite u 10 mmol·L–1 za kontrolu. rješenje proizvoda.

2.4.2 Učinak aktivnih sastojaka na citotoksičnost HEK 293

Nakon što su stanice HEK 293 inkubirane 24 sata, 100 µL otopine aktivnog sastojka pod točkom 2.4.1 (0,781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µmol·L–1) od različite koncentracije dodane su u svaku jažicu i stimulacija je nastavljena. Reagens CellTiter 96® AQueous s jednom otopinom dodan je stanicama 24 sata kasnije kako bi se otkrila vitalnost stanica.

2.4.3 Antioksidativni učinak aktivnih sastojaka na H2O2-inducirane HEK 293 stanice

Stanice su grupirane na sljedeći način: normalna skupina, modelna skupina, VE skupina grupirane su kao u 2.2.4, eksperimentalna skupina (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 aktivni sastojak i 60 µm·L–1 H2O2), uzgajan 24 sata. Odredite unutarstanične razine ROS, sadržaj enzima SOD i CAT prema metodama pod 2.2.3, 2.2.4 i 2.2.5.

Služba podrške Wecistanchea

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop