Proteomika i analize citokina razlikuju slučajeve mijalgičnog encefalomijelitisa/sindroma kroničnog umora od kontrolnih slučajeva, 2. dio

Korelacije razina proteina s kliničkim metapodacima ukazuju na njihovu važnost u stanju bolesti

Svi proteini su analizirani na korelacije s kliničkim metapodacima korištenjem istih prethodno opisanih metoda. Samo značajni rezultati nakon prilagodbe za višestruke usporedbe (q<0.1) are shown in Table 2. There were significant correlations between plasma cytokines, plasma proteomics, and the clinical metadata, but none were found with the EV cytokine dataset (Table 2).

Cistanche može djelovati kao sredstvo protiv umora i pojačivač izdržljivosti, a eksperimentalne studije su pokazale da dekokcija Cistanche tubulosa može učinkovito zaštititi jetrene hepatocite i endotelne stanice oštećene kod plivajućih miševa koji nose težinu, pojačati ekspresiju NOS3 i pospješiti jetreni glikogen sinteza, čime se postiže učinkovitost protiv umora. Ekstrakt Cistanche tubulosa bogat feniletanoidnim glikozidom mogao bi značajno smanjiti razinu serumske kreatin kinaze, laktat dehidrogenaze i laktata te povećati razinu hemoglobina (HB) i glukoze u ICR miševa, a to bi moglo igrati ulogu protiv umora smanjujući oštećenje mišića i odgađanje obogaćivanja mliječne kiseline za skladištenje energije kod miševa. Tablete Compound Cistanche Tubulosa značajno su produžile vrijeme plivanja s utezima, povećale rezervu glikogena u jetri i smanjile razinu uree u serumu nakon vježbanja kod miševa, pokazujući svoj učinak protiv umora. Uvarak Cistanchis može poboljšati izdržljivost i ubrzati uklanjanje umora kod miševa koji vježbaju, a također može smanjiti povišenje serumske kreatin kinaze nakon vježbanja s opterećenjem i održavati normalnu ultrastrukturu skeletnih mišića miševa nakon vježbanja, što ukazuje da ima učinke za povećanje fizičke snage i protiv umora. Cistanchis je također značajno produljio vrijeme preživljavanja miševa otrovanih nitritima i povećao otpornost na hipoksiju i umor.

Kliknite na umor

Zašto ćemo biti umorni? Kako možemo riješiti probleme s umorom?

【Kontakt】E-pošta: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501

Unutar skupa podataka o citokinima u plazmi, i čimbenik stimulacije kolonije 2 (CSF2) i leptin bili su u negativnoj korelaciji sa spolom i pozitivnoj korelaciji s BMI u ME/CFS i kontrolnim skupinama (Slika 6a). Zanimljivo je da osobe s ME/CFS i IBS imaju više koncentracije CSF2 i leptina nego osobe s ME/CFS i bez IBS-a, a te korelacije nisu uočene u kontrolnoj skupini (Slika 6b).

ME/CFS kohorta također je otkrila jedinstvene značajne korelacije s podacima iz zdravstvenog upitnika koji se odnose na fizičku funkciju (SF{{0}}) i umor (MFI-20) koje nisu pronađene u kontrolnoj skupini. CSF2 i leptin bili su u negativnoj korelaciji s fizičkom funkcijom (r=− {{10}}.539, q=0.002 za CSF2; r{{9 }}− 0,558, q=0,002 za leptin) i sažetak fizičke komponente (r=− 0,459, q=0,035 za CSF2; r=− 0,445 , q=0.035 za leptin), iu pozitivnoj korelaciji s općim umorom (r=0.439, q=0.047 za CSF2; r=0.436, q =0.047 za leptin) (Tablica 2, Slika 6c).

Pronašli smo druge značajne korelacije između citokina i kliničkih podataka u ispitanika s ME/CFS-om koje nisu pronađene u kontrolama: CCL2, CXCL1{{30}} i CCL11 bili su u pozitivnoj korelaciji s dobi (r{{3} }.440, q=0.060 za CCL2; r=0.394, q=0.099 za CXCL10; r=0.431, q=0 .060 za CCL2) (Slika 6d). Oba (TNF i IL1RA bili su u pozitivnoj korelaciji s BMI (r=0.543, q=0.001 i r=0.468, q=0.010), i u negativnoj korelaciji s kategorijom fizičke funkcije SF-36 (r=− 0,508, q=0.004 i r=− 0,480, q=0). 007 za TNF odnosno IL1RA) (Slika 6e). Na kraju, IL13 pozitivno je korelirao s rezultatom smanjene aktivnosti iz MFI- 20 upitnika (r=0.482, q=0.025 ).

Kao što je gore spomenuto, pronađene su dodatne značajne korelacije između skupa podataka o proteomici plazme i kliničkih metapodataka. Bilo je 9 značajnih korelacija u kontrolnoj skupini i samo dvije u ME/CFS subjektima (Tablica 2, donji dio). U kontrolnim uzorcima, protein S (PROS1) i Fc receptor-Like 3 (FCRL3) bili su u negativnoj korelaciji s vitalnošću (r=− 0.590, q=0 .015 za PROS1, r=− 0.538, q=0.039 za FCRL3). Dodatno, PROS1 je bio u negativnoj korelaciji sa SF-36 sažetkom fizičke komponente (r=− 0,608, q=0.008) i pozitivnoj korelaciji s MFI-20 općim rezultatom umora (r=0.590, q=0.016). Protein prijenosa kolesteril estera (CETP) bio je u pozitivnoj korelaciji s općim umorom (r=0.547, q=0.032) i ukupnim rezultatima iz MFI-20 (r{{35} }.557, q=0.025), a hemoglobinska podjedinica alfa 1 (HBA1) bila je u negativnoj korelaciji s dva ista rezultata (r=− 0.558, q=0.046 i r=− 0,556, q=0,025 respektivno) (slika 7a). U skupini ME/CFS, član 5 obitelji Serpin A (SERPINA5) bio je u pozitivnoj korelaciji s općim zdravljem (r=0.646, q=0.004) i društvenim funkcioniranjem (r=0 .593, q=0.027) iz SF-36 upitnika (Sl. 7b).

Robusna linearna regresija otkriva dodatne odnose između određenih proteina i kliničkih informacija

Kako bismo bolje razumjeli odnos između proteina i metapodataka, proveli smo robusnu linearnu regresiju i t-testove za procijenjene koeficijente. Robusna linearna regresija provedena je za EV citokine, citokine plazme i proteomiku plazme, redom. Svaki model uključivao je određenu razinu proteina kao predviđenu varijablu i kohortu (ME/CFS ili kontrola), spol, dob, BMI i sindrom iritabilnog crijeva (IBS) kao kovarijabu. Interakcije između kohorte i kovarijata metapodataka također su uključene u model. Interakcije testiraju hipotezu da je odnos između metapodataka i razine proteina drugačiji u ME/CFS nego u kontrolnoj skupini. Značajni učinci sažeti su u tablici 3. Standardna je praksa u biostatistici uključiti oba glavna učinka kad god dvije varijable imaju statistički značajnu interakciju. Obrazloženje je da interakcija pokazuje da varijable imaju učinke čak i ako glavni učinak ne postiže statističku značajnost. Mi smo slijedili tu praksu. U tablici 3, muškarac je lažna (indikator ili 0–1) varijabla koja je jednaka 1 za muškarce i 0 za žene. Slično tome, ME/CFS je lažna varijabla koja je 1 ili 0 za slučajeve odnosno kontrole, a IBS je lažna varijabla jednaka 1 ili {{10}} za subjekte sa ili bez IBS, odnosno. ME/CFS: Dob je umnožak ME/CFS i dobi, pa je jednaka 1 za slučajeve ME/CFS i jednaka 0 za kontrole. ME/CFS: Muškarci su proizvod dviju lažnih varijabli i stoga je jednak 1 za muškarce u skupini ME/CFS i jednak 0 za sve ostale subjekte. ME/CFS: (+) IBS je jednak 1 za ME/CFS slučajeve s IBS-om i 0 inače.

U uzorcima citokina EV, dob je bila značajna za predviđanje razine CXCL1 (=− 0.013, q=0.035) i razine CCL11 (=0.032, q{ {9}}.035). Dakle, CXCL1 opada s godinama, ali CCL11 raste s godinama. (Tablica 3).

U citokinima u plazmi, i BMI i muškarci značajno su predvidjeli razine leptina i CSF2. Učinak za lažnu varijablu Muško je razlika između srednjih vrijednosti za muškarce i žene. Na primjer, srednja vrijednost varijable Leptin (ili CSF2) je, ako je sve ostalo jednako, 1,119 (ili 1,230) niža za muškarce u usporedbi sa ženama. I za CCL2 i za CSF3, glavni učinak dobi i pojam interakcije između dobi i skupine bili su značajni. Odsjeci za regresiju CCL2 na dob su 0.690 i 0.690− 2.696= − 2.{{27} }06 za kontrole i slučajeve. Za svako jednogodišnje povećanje starosti, prosjek CCL2 smanjit će se za 0.037 u kontrolama i povećati za 0.075–0.037=0.038 u slučajevima. Odsjeci za regresiju CSF3 na dob su 0,576 i 0,576−1.994=− 1,418 za kontrole odnosno slučajeve. Za svako jednogodišnje povećanje dobi, prosjek CFS3 smanjit će se za 0,047 u kontrolama i povećati za 0,075–0.047=0.028 u slučajevima.

U podacima o proteomici plazme, dob je također bila značajna za predviđanje razine SAA1 (=0.047, q=0.049). Za PFN1, interakcija između ME/CFS i spola bila je značajna (=− 1,901, q=0.03{{20} }). Srednja vrijednost PFN1 je 0.809 za ženske kontrole, 0.809−0.996=− 0.187 za ženske slučajeve, 0.809+0 .081=0.890 za muške kontrole i 0.809+0.081−0.996−1.901=− 2.007 za muške slučajeve. Prema tome, srednja vrijednost PFN1 veća je u kontrolama nego u slučajevima za oba spola, ali razlika je mnogo veća u muškaraca (0.809+0.187=0.996 za žene naspram 0.890+2). 007=2.897 za muškarce).

Za IGHA2, interakcija između ME/CFS i IBS bila je značajna (=3.467, q < 0.001). Srednja vrijednost IGHA2 je 0.454 za kontrole bez IBS-a, {{20}}.454−2.048=− 1.594 za ME/CFS slučajeve bez IBS-a, {{33 }}.454−2.811=− 2,357 za kontrole s IBS-om i 0.45 4−2.048−2.811+3.{ {26}}− 0.938 za slučajeve s IBS-om. Stoga je srednja vrijednost IGHA2 viša za kontrolne skupine nego slučajeve za subjekte bez IBS-a, ali viša u slučajevima nego za kontrolne skupine za subjekte s IBS-om. Za LRG1, interakcija između ME/CFS i IBS bila je značajna (=3.093, q < 0.001). Srednja vrijednost LRG1 je 0,261 za kontrole bez IBS-a, 0,261−1.082=− 0,821 za ME/CFS slučajeve bez IBS-a, 0,261−2.502=− 2,241 za kontrole s IBS-om i 0,261−1,082 −2.502+3.093= 0.230 za slučajeve s IBS-om. Vidimo da je srednja vrijednost LRG1 veća u kontrolama nego u slučajevima za subjekte bez IBS-a, ali viša u slučajevima nego u kontrolama za subjekte s IBS-om (Tablica 4).

IBS ima suprotne učinke u slučajevima i kontrolama na IGHA2 i LRG1 (Tablica 4). Iako su ove razlike statistički značajne, treba napomenuti da je postojao samo jedan kontrolni subjekt s IBS-om.

Tri pristupa strojnom učenju rezultiraju prediktivnim i diskriminativnim modelima

Prva 20 proteinska analita i vrijednosti važnosti značajki za svaki od tri pristupa strojnog učenja mogu se pronaći u tablici 5. Sve tri metode imale su izvrsnu izvedbu u razlikovanju ME/CFS-a od kontrola korištenjem najbolja 2{{ 16}} proteinskih analita s 250 ponavljanja peterostruke unakrsne provjere. Slika 8 prikazuje ROC krivulje i AUROC vrijednosti iz ova tri klasifikatora s prva 20 proteina rangirana prema mjerenjima važnosti. Klasifikator XGBoost pokazao se najboljim s visokim stupnjem točnosti (86.1%, Dodatna datoteka 1: Slika S3a) s unakrsno validiranom AUROC vrijednošću od 0.947 (95% CI { {26}}.895–0.998). Nadalje, korištenjem prvih 8 proteina iz svakog klasifikatora, logistička regresija (LASSO) dala je najbolje rezultate s AUC od 0.873 (95% CI 0.792–0.953) i točnošću od 78,6% (Slika 8b i Dodatna datoteka 1: Slika S3b). Konačno, Random Forest sa 7 proteinskih analita zajedničkih za sva tri top 20 popisa (podebljani proteini u tablici 5) razlikovao je ME/CFS od kontrola s AUROC vrijednošću od 0,891 (95% CI 0,817–0,966) i točnošću od 79,1% (slika 8c i Dodatna datoteka 1: Slika S3c).

Rasprava

U ovoj smo studiji koristili uzorke i podatke od 98 od 100 subjekata koji su prethodno dali uzorke koji su analizirani na fekalnu metagenomiju i citokine u plazmi [26] te također na proteine ​​plazme ispitane spektrometrijom mase [14]. Nadalje, iz ovih 98 uzoraka izolirani su izvanstanični mjehurići i otkrili smo da su srednja veličina i koncentracije čestica značajno veće u ME/CFS (slika 2). Iako je prethodno izvješće koristeći istu metodu pročišćavanja EV-a kao i ova studija otkrilo da je srednja veličina ME/CFS EVs smanjena [42], autori su analizirali EVs izolirane od 10 ME/CFS pacijenata i 5 zdravih kontrolnih osoba naspram 49 ME/ CFS i 49 kontrola u ovoj studiji nisu koristili trombin za uklanjanje fibrinogena i koristili su niske centrifugalne sile za peletiranje EV (1500 g naspram 12,000 g u ovoj studiji). Sve zajedno ovo bi moglo objasniti različite rezultate opažene u našoj trenutnoj studiji. Naposljetku, naši su rezultati potvrdili druge nalaze koji govore o višim koncentracijama vezikula u ME/CFS [24, 25, 42], a ta su opažanja također vidljiva u stanjima kao što su Alzheimerova bolest [17] i cerebrovaskularna bolest [20].

Naš rad pokazuje vrijednost korištenja višestrukih testova na istim uzorcima, kao i važnost izvođenja korelacija s kliničkim podacima. To nam je omogućilo da identificiramo nekoliko povezanosti određenih proteina sa simptomima pacijenata. Ono što je važno, pokazujemo da podaci mogu razlikovati pacijente od kontrola s visokom točnošću. Neki su ME/CFS dugo netočno smatrali psihološkom bolešću. Sposobnost odvajanja pacijenata i kontrola putem analiza plazme je snažan dokaz biološke prirode bolesti. Sažetak naših eksperimentalnih analiza i ključnih nalaza prikazan je na slici 9.

Naša trenutna analiza 98 uzoraka slaže se s prethodnom usporedbom citokina u plazmi u 100 ME/CFS i kontrolama, koja nije identificirala nikakve značajne razlike između kohorti nakon prilagodbe za višestruko testiranje [26]. Nasuprot tome, identificirali smo 17 EV citokina koji razlikuju pacijente i kontrolne skupine s prilagođenim p-vrijednostima manjim od 0,2, a svi su viši u ME/CFS ispitanika. Od ovih 17 proteina, za većinu (10 od 17) se zna da su proupalni citokini/kemokini (TNF, IL1, CXCL8, CXCL1, IL15, CCL7, IL17, CCL5, IL1 i IL1R1), 5 je povezanih na adaptivni imunitet (IL2, CSF2, IL3, IL4 i IL7), IL12p40 ima protuupalna svojstva, a NGF je i pro- i protuupalni. Više razine proupalnih citokina u skladu su s prethodnim izvješćima [43-45].

Iako razlike u razinama EV citokina nisu postigle statističku značajnost nakon korekcije za višestruke usporedbe u prethodnoj pilot studiji sa samo 38 ispitanika, 13 od 17 EV citokina u ovoj studiji također je pronađeno na višim razinama u EV iz ME/CFS subjekata u usporedba s kontrolama [25]. Najznačajnija razlika bila je IL2 (q=0.007, slika 3). IL2 je izlučeni citokin kojeg proizvode aktivirani CD4+ i CD8+T limfociti i potiče snažnu proliferaciju aktiviranih B-stanica, a potom i proizvodnju imunoglobulina. Ima ključnu ulogu u regulaciji adaptivnog imunološkog sustava kontrolirajući preživljavanje i proliferaciju regulatornih T-stanica. Utvrđeno je da su razine IL2 više u cerebrospinalnoj tekućini [46] i plazmi pacijenata s ME/CFS [47]. Više razine IL2 pronađene u EV u ovoj studiji mogle bi biti dio specifičnog imunološkog odgovora kod ME/CFS. Nekoliko citokina/kemokina za koje je uočeno da su disregulirani ili proizvode B stanice ili su također regulatori B stanica (npr. CXCL1 i CXCL12).

Korelacije citokina s drugim citokinima pružaju informacije o mrežama interakcija između signalnih molekula. Nekoliko drugih studija pokazalo je da se mreže citokina plazme ili izvanstaničnih vezikula razlikuju između ispitanika s ME/CFS-om i kontrolne skupine [25, 41, 44, 48]. Odlučili smo prikazati korelacije između tri vrste podataka: plazma i EV citokini i proteomika plazme—upotrebom korelograma. Inspekcija vizualnog prikaza ovih protein-protein interakcija odmah otkriva da postoje pozitivne korelacije između EV citokina i između citokina u plazmi koje se javljaju u slučajevima, ali ne iu kontrolama i obrnuto (slika 5). Posebno upečatljivo opažanje je veći broj pozitivnih korelacija između citokina u plazmi u ME/CFS nego u kontrolama (Slika 5b), što ukazuje da je signalizacija citokina bitno drugačija, možda odražavajući upalno okruženje.

Sedamdeset i jedan protein karakteriziran spektrometrijom mase pokazao je značajne korelacije s drugim proteinima plazme (slika 5c). Na primjer, F2 je pokazao 31 pozitivnu korelaciju s drugim proteinima, od kojih je jedanaest viđeno u slučajevima, ali ne iu kontrolama. F2 je faktor koagulacije II ili trombin i pretvara fibrinogen u fibrin i aktivira faktore V, VII, VIII i XIII. Trombin potiče aktivaciju i agregaciju trombocita, ali se također smatra da ima i druge funkcije tijekom upale i zacjeljivanja rana [49].

Unatoč tome što nismo uočili značajne razlike u razinama citokina u plazmi između dviju kohorti, uočili smo korelacije citokina u plazmi s kliničkim podacima. CSF2, također poznat kao faktor stimulacije kolonija granulocitnih monocita (GM-CSF), niži je u muškaraca u ME/CFS iu kontrolama i raste s BMI u obje skupine prema robusnoj linearnoj regresiji i korelacijskim analizama (slika 6a, tablice). 2 i 3). U kohorti ME/CFS, s povećanjem CSF2, rezultati na ljestvici fizičke funkcije SF36 i MFI-umora ukazuju na veći utjecaj fizičkih simptoma i simptoma umora. Povećanje GM-CSF-a povezano je s kroničnom upalom [50]. GM-CSF inducira klasične monocite da se diferenciraju u dendritične stanice i makrofage in vitro [51]. Klasični monociti pokazuju jedinstveni obrazac ekspresije gena u ME/CFS u usporedbi s kontrolama [52], a povišeni GM-CSF mogao bi biti signalni faktor uključen u ovaj odgovor.

Povećanja razina triju citokina, CCL2, CXCL10 i CCL11 povezana su s povećanjem dobi samo u kohorti ME/CFS, prema Spearmanovim korelacijama. CCL2, također poznat kao MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), privlači monocite preko endotela u tkiva [53], a također bi mogao biti faktor u promijenjenom profilu ekspresije gena monocita [54]. Opaženo je da se CCL2 smanjuje s godinama u ukupnoj kohorti i robusnom linearnom regresijom i Spearmanovom korelacijom, ali raste u ME/CFS kohorti s porastom dobi, prema Spearmanovoj korelaciji (Slika 6d, Tablica 3). Koristeći robusnu linearnu regresiju, CCL11 u plazmi nije se značajno povećavao s godinama, ali se predviđalo da će EV CCL11 biti viši s godinama. CXCL10 (IP10) također je uključen u migraciju stanica, posebno u privlačenje makrofaga, monocita i aktiviranih T i NK stanica [55]. Poznato je da CCL11, također poznat kao eotaksin, raste s godinama, a više razine povezane su sa smanjenom neurogenezom [56]. Dvije velike studije prethodno su uočile povezanost leptina, GM-CSF-a, IP10 i eotaksina s težinom ME/CFS-a [43] ili višim eotaksinom u dugotrajnim slučajevima ME/CFS-a [41]. Gotovo svi subjekti ME/CFS-a u ovoj studiji bili su bolesni dulje od 3 godine.

Viši leptin je u korelaciji sa ženskim spolom i višim indeksom tjelesne mase i kod pacijenata i kod kontrolne grupe robusnom linearnom regresijom i korelacijskom analizom (tablice 2 i 3). Viši nivo leptina također je povezan s IBS-om u skupini pacijenata (slika 6b). Porast leptina također je u korelaciji s lošijim rezultatima na SF36 mjerama fizičke funkcije i MFI-ljestvici umora (slika 6c). Leptin je prethodno bio u korelaciji s umorom i težinom ME/CFS [43, 54]. Povećanje razine drugog upalnog citokina, TNF-a, također je u korelaciji s nižim rezultatima fizičke funkcije pacijenta na SF36, a ranije je objavljeno da su povišene u ME/CFS [41, 57, 58] (Slika 6e).

Više razine IL1-RA, koji antagonizira upalne citokine IL1, bile su povezane s višim BMI i nižom SF-36 fizičkom funkcijom u slučajevima ME/CFS (Slika 6e). Iako se IL1-RA može smatrati protuupalnim, poznato je da su razine IL1-RA više kod pretilosti [59], a više razine smatraju se markerom metaboličke disregulacije [60] , što bi moglo rezultirati nižom fizičkom sposobnošću.

Uočili smo da su niže razine protuupalnog citokina IL13 povezane s nižom aktivnošću u slučajevima ME/CFS. Prethodno je objavljeno da je IL-13 niži u žena s ME/CFS u odnosu na kontrolne skupine [61]. Nasuprot tome, viši IL13 bio je u korelaciji s povećanom težinom simptoma u jednoj studiji [43], dok u drugoj nije uočena razlika između slučajeva i kontrola [41].

【Kontakt】E-pošta: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501