Produljena ex-vivo normotermna perfuzija bubrega: utjecaj sastava perfuzata

edmund.chen@wecistanche.com

Sažetak

Normotermna strojna perfuzija (NMP) donorabubrega pruža priliku za poboljšano očuvanje presatka i objektivnu ex-vivo procjenu organa prije transplantacije. Trenutno postoji mnoštvo perfuzijskih rješenja za bubrežni NMP. Ovo je istraživanje imalo za cilj procijeniti četiri različite perfuzijske otopine jedna uz drugu i odrediti utjecaj različitih sastava perfuzata na izmjerenebubrežniparametri perfuzije. Svinjskibubregaa krv su dobivali iz klaonice.Bubrezipodvrgnuti NMP-u na 37˚C tijekom 7 sati, s 4 različite perfuzijske otopine (n=5 po skupini). Grupa 1 sastojala se od crvenih krvnih stanica (eritrocita) i perfuzijske otopine temeljene na Williamsovom mediju E. Skupina 2 sastojala se od crvenih krvnih zrnaca, albumina i uravnoteženog sastava elektrolita. Skupina 3 sadržavala je eritrocite i medij temeljen na britanskoj kliničkoj NMP otopini. Skupina 4 sadržavala je eritrocite i medij korišten u 24--satnim perfuzijskim eksperimentima. Obrasci protoka NMP za otopine 1 i 2 bili su slični, otopine 3 i 4 pokazale su niže, ali stabilnije brzine protoka. Reaktivne tvari tiobarbiturne kiseline bile su značajno veće u otopini 1 i 4 u usporedbi s ostalim skupinama. Razine markera ozljede N-acetil- -D glukozaminidaze bile su značajno niže u otopini 2 u usporedbi s otopinom 3 i 4. Ova studija pokazuje da sastav perfuzata tijekom NMP-a značajno utječe na izmjerene parametre perfuzije i ozljede i tako utječe na tumačenje potencijalnih markera održivosti. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se istražili pojedinačni utjecaji glavnih komponenata perfuzata kako bi se odredili najoptimalniji uvjeti tijekom NMP i na kraju razvili univerzalni kriteriji za procjenu organa.

Ključne riječi:bubrežna funkcija; bubreg; ozljeda bubrega; bubrezi prokrvljeni; bubrežni tubularni

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA

Uvod

U cijelom svijetu, standardni donatorbubregmetoda konzerviranja je statično hladno skladištenje (SCS). Međutim, u Nizozemskoj se hipotermička strojna perfuzija (HMP) klinički koristi za očuvanje svih preminulih darivateljabubrega.HMP je pokazao smanjenje odgođene funkcije presatka i poboljšanu 1- i 3-godinububrežnipreživljenje presatka u usporedbi s očuvanjem SCS [1,2]. Kako bi se smanjio značajan jaz između ponude i potražnje za donatorimabubrezi,suboptimalni umrli darivateljbubregasve više se koriste. Zbog povećane upotrebe ovih donora kvalitete manje od optimalnebubrezi,od najveće je važnosti uspostaviti još optimizirane strategije za robusnu i objektivnu procjenu prije transplantacije, kao i očuvanje. Korištenje normotermne strojne perfuzije (NMP) za ove preminule davateljebubregasve više se razmatra. Pretkliničke studije su pokazale da NMP može dovesti do boljeg ishoda transplantacije u usporedbi sa samim SCS [3]. Kao donacija nakon srčane smrti i davatelj proširenih kriterijabubregamanje tolerantni na pohranjivanje u hipotermiji u usporedbi s organima dobivenim postupcima darivanja standardnih kriterija, organima donora marginalne kvalitete moglo bi pomoći očuvanje NMP-a [4,5]. Trenutno samo jedna kliničkabubrežniIspitivanje NMP-a provodi se u Ujedinjenom Kraljevstvu, s relativno kratkim periodom perfuzije prije transplantacije od 1 sata [6]. Za odgovarajuću procjenu organa i reanimaciju, međutim, moguće je da su potrebna dulja vremena NMP [7]. Ova metoda pruža priliku za dijagnostiku organa prije transplantacije, poboljšano očuvanje i ex-vivo intervencije prije transplantacije kako bi se poboljšala posttransplantacijabubrežna funkcija. Danas su mnogi transplantacijski centri počeli ulagati u ovu obećavajuću strategiju normotermne ex-vivo perfuzije. Među tim centrima postoji širok izbor NMP perfuzijskih rješenja. Velika heterogenost u sastavu mogla bi spriječiti krajnji cilj definiranja jedinstvenih i robusnih kriterija procjene NMP-a. Ova heterogenost djelomično je uzrokovana trenutno ograničenim razumijevanjem točne formulacije NMP rješenja. Najvjerojatnije, normotermna perfuzijska otopina mora sadržavati nosač kisika, koloid i uravnotežen sastav elektrolita [8]. Sastav će također ovisiti o trajanju NMP-a, budući da će duža razdoblja perfuzije zahtijevati optimizirane sastave perfuzata za održavanje stabilnog okruženja gotovo fiziološkog tijekom cijele perfuzije. Ova studija procijenila je četiri različite normotermne perfuzijske otopine, tri uobičajeno korištene postojeće otopine koje nisu mijenjane i jednu novo dizajniranu otopinu. Proveli smo produljeni (7h) NMP u svinjebubregmodel donacije. Naš je cilj bio analizirati u kojoj mjeri različiti sastavi perfuzata u cjelini utječu na ravnotežu elektrolita,bubrežna funkcija, i markeri ozljeda izmjereni tijekom NMP.

Materijali i metode

Vađenje bubrega i krviOdrživa svinjabubregaod domaćih landrace svinja (krmača; tip Topigs 20), a krv je dobivena iz lokalne klaonice (Kroon Vlees, Groningen, Nizozemska). Svinje su omamljene bi-temporalnim električnim šokom, a zatim su iskrvarene u skladu s uobičajenim klaoničkim postupcima. Prikupljena je autologna krv i dodan je heparin (5000 međunarodnih jedinica po ml (IU), LEO1 pharma, Ballerup, Danska) kako bi se spriječilo zgrušavanje krvi.Bubreziizvučeni su brzo nakon cirkulacijske smrti svinje, što je rezultiralo približno 20 minuta toplom ishemijom (WI) prije hladnog čuvanja. Nakon WI razdoblja,bubregaisprani su i ohlađeni s 180 ml natrijeva klorida (NaCl) (0,9 posto) (Baxter BV, Utrecht, Nizozemska) na 4˚C, što je označilo početak hladne ishemije (CI).Bubrezisu secirani bez viška masnog tkiva i krvne žile su bile izložene. Sljedeći,bubregabili su povezani s aBubregAssist Transport HMP uređaj (Organ Assist, Groningen, Nizozemska). Ovaj HMP stroj sačuvanbubregahladnom (0–4˚C) UW strojnom perfuzijskom otopinom (Belzer UW-MP otopina, Bridge to Life Ltd, Columbia, SC) tijekom 2-4 sata koristeći oksigenirani pulsirajući HMP pri srednjem arterijskom tlaku od 25 mmHg . Heparinizirana autologna krv je depletirana leukocitima korištenjem leukocitnog filtra (BioR 02 plus BS PF, Fresenius Kabi, Zeist, Nizozemska), centrifugirana i naknadno je uklonjen supernatant plazme.

Perfuzijske otopineDefinirane su četiri eksperimentalne skupine (n=5 po skupini), s različitom NMP otopinom u svakoj skupini. Prijebubregretrieva, određena je perfuzijska otopina koja će se koristiti tijekom eksperimenta. Sve četiri perfuzijske otopine sadržavale su autologne svinjske crvene krvne stanice (eritrocite), ali je sastav svakog NMP medija bio različit (Tablica 1). U našem laboratoriju stečeno je veliko iskustvo s perfuzijom svinjabubregai jetre glodavaca korištenjem Williamsovog medija E (WME) (Life Technologies Ltd, Bleiswijk, Nizozemska) [9-11]. Ovaj perfuzat ne sadrži vazodilatator i odlučili smo da ga nećemo napraviti

izmjene prvobitnog rješenja. Perfuzijsku otopinu skupine 2 razvila je naša skupina kako bi sadržavala elektrolite u fiziološkim koncentracijama i vršila fiziološki koloidno-osmotski tlak na glomerularnu membranu. Perfuzat skupine 3 bio je klinički korištena britanska NMP otopina bez koloida, koja se trenutno koristi u randomiziranom kontroliranom ispitivanju uspoređujući 1h NMP sa SCS preminulog donorabubregau Ujedinjenom Kraljevstvu [12]. Što se tiče skupine 4, ova je otopina uspješno korištena u studiji autotransplantacije svinja u Aarhusu, Danska [13]. Temelji se na perfuzatu koji su osmislili Weissenbacher i dr., koji su spojili odbačene ljudskebubregatijekom 24 sata [7]. Osim gore navedenih sastojaka, perfuzatu u skupini 1 dodana je glukoza kada je koncentracija pala ispod 4 mmol/l. Proizvedeni urin je bio

svaki sat zamijenjen s WME. U skupini 2 infuzijska pumpa štrcaljke ulijevala je potpunu parenteralnu prehranu (SmofKabiven) (Fresenius Kabi Nederland BV, Zeist, Nizozemska) brzinom od 0.5 ml/ruci inzulina (10{{1{ {12}}}}0 IU, također Novo Nordisk A/S) brzinom od 0,005 ml/h. Nakon svakog sata, proizvodnja urina je ponovno kružila u skupini 2 kako bi se održala stabilna ravnoteža elektrolita. U trećoj skupini, 170 ml čistih crvenih krvnih zrnaca pomiješano je sa 120 ml fiziološke otopine, adeninom, glukozom i manitolom (SAG-M), što je dovelo do hematokrita od 0,5–0,65 l/l, kako bi se oponašao sastav tipične klinički korištene jedinice RBCs (koji se koristi u britanskom kliničkom NMP perfuzatu). Tijekom ovih pokusa korištene su tri infuzijske pumpe sa štrcaljkama za infuziju Flolana (GlaxoSmithKline BV, Zeist, Nizozemska) brzinom od 5 ml/h, glukoze 5 posto (Baxter BV, Utrecht, Nizozemska) brzinom od 4 ml/h. h i mješavina od 150 ml Synthamina-17 10 posto (Baxter Healthcare Ltd., Norfolk, Ujedinjeno Kraljevstvo), 6 ml natrijevog bikarbonata (NaHCO 3 ) 8,4 posto (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Njemačka) , 30 IU inzulina (1000 IU, Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Danska) i Cernevit (Baxter BV, Utrecht, Nizozemska) brzinom od 20 ml/h, prema protokolu trenutne kliničke studije u Velikoj Britaniji. Proizvodnja urina je svaki sat zamijenjena Ringerovim laktatom (također Baxter BV). Tijekom NMP četvrte skupine, infuzijska pumpa na štrcaljku infundirala je verapamil (2,5 mg/ml, također Sandoz BV) otopljen u fiziološkoj otopini brzinom od 0,3 ml/h. Proizvodnja urina također je ponovno kružila u ovoj skupini nakon svakog sata kako bi se održala stabilna ravnoteža elektrolita. Volumeni uzorka u svakoj skupini korigirani su različitim komponentama. Volumen u skupini 1 zamijenjen je s WME, u skupini 2 s perfuzijskim medijem, u skupini 3 s Ringerovim laktatom i u skupini 4 sa Sterofundinom1 (također B. Braun).

NMP postavaPostavka perfuzije bila je identična onoj koju je prethodno opisala naša skupina [14]. Thebubregasu perfundirani na asinusoidni pulsirajući način, s frekvencijom od 60 impulsa u minuti, ata set, reguliran bez povratne sprege, tlak od 110/70 mmHg i oksigenirani s 95 posto kisika/5 posto ugljičnog dioksida (karbogen) tijekom svih eksperimenata. Ova suprafiziološka razina kisika standardna je procedura u sva četiri postojeća protokola. Perfuziju je kontroliralo posebno izrađeno elektroničko sučelje i upravljački softver (LabView Software, National Instruments Netherlands BV, Woerden, Nizozemska). Shematski prikaz tenormotermnog perfuzijskog kruga prikazan je na slici 1.

Analiza urina i perfuzataSvakih sat vremena uzimani su uzorci arterijskog perfuzata i urina. U skupinama 2 i 4, u kojima je urin bio recirkulacijski, uzorci perfuzata su uzeti prije recirkulacije urina. Uzorci plina arterijske krvi perfuzata analizirani su nakon 0, 240 i 420 minuta NMP. Parametri perfuzije dokumentirani su svakih pola sata. Koncentracije laktat dehidrogenaze (LDH) i aspartat aminotransferaze (ASAT), natrija, kalija, glukoze i kreatinina mjerene su standardnim kliničkim testovima u perfuzatu. Klirens kreatinina, frakcijsko izlučivanje kreatinina na 100 g (FE kreatinin/100 g) i frakcijsko izlučivanje natrija (FENa plus) izračunati su kako bi se odredilobubrežna funkcija. Jednadžbe se mogu pronaći u S1 dodatku. I N-acetil- -D glukozaminidaza (NAG) (također Sigma-Aldrich), kao markerbubrežnitubularna disfunkcija/ozljeda i tvari reaktivne na tiobarbiturnu kiselinu (TBARS) (Lipid Peroxidation–malondialdehyde (MDA)) Assay Kit, Sigma-Aldrich BV, Zwijndrecht, Nizozemska), za kvantificiranje oksidativnog stresa, izmjerene su u perfuzatu.

HistologijaBiopsija gornjeg dijela iglomkora bubregasnimljen je prije početka NMP-a. Na kraju svakog eksperimenta prikupljeni su uzorci kirurškog tkiva iz gornjeg korteksa. Ove biopsije bile su

Statistička analizaAnaliza podataka provedena je korištenjem GraphPad Prism Version 8.3.1 (GraphPad software Inc., La Jolla, CA, SAD). Za sve kontinuirane longitudinalno mjerene varijable, kao što su ASAT i LDH, izračunata je površina ispod krivulje (AUC). Jednosmjerna ANOVA s višestrukim usporedbama korištena je za usporedbu AUC vrijednosti između skupina ako su podaci bili normalno distribuirani (Shapiro Wilk test) i imali homogenost varijanci (testirano pomoću Bartlett testa). Ako podaci nisu zadovoljili ove pretpostavke, korišten je Kruskal-Wallisov test s Dunnovim testom višestrukih usporedbi. Smatralo se da dvostrane p-vrijednosti od 0.05 ili manje ukazuju na statističku značajnost.

Rezultati

Parametri perfuzijeU tablici 2 podaci (srednja vrijednost, minimum i maksimum) o toploj i hladnoj ishemiji, trajanju HMP i težini prije početka i nakon NMP kao i delta težini (razlika u težini pri t=420 u odnosu na t {{2 }}). Delta težina bila je značajno veća u skupini 1 u usporedbi sa skupinom 2 (p=0.041). Nije bilo drugih značajnih razlika između vrijednosti svih eksperimentalnih skupina. Tijekom NMPbubrežniarterijski protok se povećao tijekom prvih 60 minuta reperfuzije u skupini 1 i 2. Nakon 60 minuta brzine protoka obično su se počele smanjivati. Perfuzije u skupini 3 i 4 započele su s nižim vrijednostima protoka, ali su pokazale konstantniji protok kroz NMP. Završne vrijednosti nakon 7 sati NMP bile su približno 75 ml/min/100g u svim skupinama (Slika 2).

Analiza urina i perfuzataPojedinačni podaci o funkcionalnim parametrima i parametrima ozljede tijekom perfuzije mogu se pronaći u tablici 3.Funkcija bubrega.Grupa 3 pokazala je najviše razine izlučenog urina (Slika 3). Kumulativna diureza u skupini 3 bila je značajno viša u usporedbi sa skupinom 1 (p=0.003), skupinom 2 (p < 0,001)="" i="" skupinom="" 4="" (p="0,008)." neki="">bubregau skupini 2 nisu proizvodili urin u t=180 i t=300, što je dovelo do nižih prosječnih razina kumulativne proizvodnje urina u t=360 i t=420. Razine natrija i kalija značajno su se razlikovale između skupina (Slika 4). Razine na t=0 označavaju početne početne vrijednosti pri perfuziji. Osobito je skupina 3 pokazala visoko

Tijekom perfuzije, pH u skupini 3 je opao bez stabilizacije, dok su druge skupine postigle uravnoteženiju razinu od približno 7,4 nakon 7 sati NMP-a (Slika 5). Klirens kreatinina bio je nizak u svim skupinama (Slika 6A i 6B). Ipak, bio je značajno veći nego u skupini 3 u usporedbi sa skupinom 2 (p=0.039). Frakcijsko izlučivanje kreatinina na 100 g (Slika 6C i 6D) bilo je značajno veće u skupini 3 u usporedbi sa skupinom 1 (p=0.026), skupinom 2 (p=0.017) i skupinom 4 ( p=0.045). FENa plus bio je visok u svim skupinama, što ukazuje da je tubularna funkcija bila ozbiljno oštećena (Slika 6E i 6F) u ovim ishemijski oštećenimbubrega. FENa plus u skupini 3 bio je značajno veći u usporedbi sa skupinom 2 (p=0.037) i skupinom 4 (p=0.019). Sve ostale skupine nisu se značajno razlikovale.Ozljeda bubrega.Razine ASAT tijekom NMP-a analizirane su (Slike 7A i 7B) kao marker za opće oštećenje stanica. Prosječna vrijednost AUC određena je za svaku skupinu. Razine u skupini 4 bile su značajno više u usporedbi sa skupinom 1 (p=0.022) i skupinom 2 (p=0.011). Razine LDH također su izmjerene u perfuzatu kao opći marker ozljede (Slika 7C i 7D). Izračunata je AUC koja je pokazala najniže razine LDH u skupinama 1 i 2. Skupina 2 bila je značajno niža u usporedbi sa skupinom 4 (p=0.020). Grupa 1 pokazala je značajno niže razine u usporedbi sa skupinom 4 (p=0.022). Razine NAG bile su značajno više u skupini 3 u usporedbi sa skupinom 1 (p=0.043) i grupom 2 (p=0.006) (Slika 8A i 8B). TBARS, koncentracija malondialdehida (MDA), izmjerena je u sve četiri skupine kao marker za peroksidaciju lipida (Slika 8C i 8D). Razine MDA bile su značajno više u skupini 1 u usporedbi sa skupinom 2 (p=0.003) i skupinom 3 (p < 0.001).="" grupa="" 2="" pokazala="" je="" značajno="" niže="" razine="" mda="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" 4="" (p="0.006)." grupa="" 3="" pokazala="" je="" značajno="" niže="" razine="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" 4=""><>

Histologija

Točkasti dijagrami na slici 9 pokazujububrežnioštećenje tubula/ATN, dilatacija tubula i rezultati dilatacije glomerula prije početka NMP (t {{0}}) i nakon 7 sati NMP (t=420). Početne vrijednosti histološke nekroze i tubularne dilatacije bile su usporedive između skupina, uz samo marginalne razlike u rezultatima krajnjih točaka. Glomerularna dilatacija na t=420 bila je značajno niža u skupini 2 u usporedbi s druge 3 skupine. Histološke brojke po skupini mogu se pronaći na slici S1. Indukcija nabora Bax i Bcl-2, indikatori za pro- i anti-apoptotičku ekspresiju gena, oba su pokazala pomak u krajnjim razinama NMP u usporedbi s razinama na t=0 (Slika 10). Delta Bax ekspresija gena (razlika između t=0 i t=420) izračunata je u svim skupinama i bila je značajno viša u skupini 1 u usporedbi s skupinom 2 (p=0.046), skupina 3 (p < 0,001)="" i="" skupina="" 4="" (p="0,003)." ekspresija="" bcl-2="" smanjila="" se="" u="" svim="" skupinama="" nakon="" 7="" sati="" perfuzije="" bez="" značajnih="" razlika="" između="">

Rasprava

Opći interes zabubrežninormotermne ex-vivo strojne perfuzijske tehnike su u porastu, ali klinički dokazi ostaju ograničeni sa samo jednim kliničkim NMP ispitivanjem u tijeku. Provedene su opsežne pretkliničke studije koje su istraživale potencijal NMP-a. Mnoštvo različitihbubrežninormotermni perfuzati postoje među različitim istraživačkim skupinama. Međutim, postavlja se pitanje u kojoj mjeri sastav perfuzata utječebubrežna funkcijai kako to utječe na tumačenje potencijalnih markera održivosti ostaje. Stoga je ova studija procijenila utjecaj četiri različite normotermne ex-vivo perfuzijske otopine jedna uz drugu nabubrežna funkcijaiozljeda bubregatijekom produljene NMP korištenjem svinjskogbubregmodel donacije nakon cirkulacijske smrti.

ocijeniti izoliranobubrežna funkcijaprije transplantacije. Hosgood i kolege dali su prve kliničke dokaze o izvedivosti procjene održivosti prije transplantacije tijekombubrežniNMP. Njihova perfuzijska otopina trenutno se najčešće koristi tijekom NMP-a i prvobitno je razvijena za procjenububrežna funkcijaprije transplantacije u roku od 1-2 sata [16].Bubreziperfundirani ovom otopinom obično pokazuju visoku proizvodnju urina [17]. Doista, najveća proizvodnja urina primijećena je u skupini 3, koja se temelji na ovom kliničkom UK perfuzatu, što je dovelo do više nego potpunog izlučivanja mokraćom cirkulirajućeg volumena perfuzata u ovoj skupini tijekom 7 sati NMP-a. Kontinuirani gubitak volumena cirkulirajuće perfuzijske tekućine morao se nadoknaditi povremenim dodavanjem sličnih volumena Ringerova laktata, u skladu s kliničkim protokolom za ovu perfuzijsku otopinu. U našoj studiji, to je rezultiralo značajnim promjenama sastava elektrolita i pH, budući da urin nije bio recirkuliran. Ova velika proizvodnja urina najvjerojatnije se može pripisati nedostatku koloida samo u ovoj perfuzijskoj otopini. Perfuzijske otopine sve tri druge skupine sadržavale su značajnu količinu albumina. U intravaskularnom prostoru albumin je glavna komponenta koja održava normalan koloidno-osmotski tlak [18]. Ravnoteža između hidrostatskog tlaka i koloidno-osmotskog tlaka rezultira fiziološkom brzinom ultrafiltracije preko glomerularne membrane [19]. Kaths i sur. pokazalo je da proizvodnja urina tijekom NMP nije u korelaciji s funkcijom nakon transplantacije. Pretpostavili su da na stvaranje urina uvelike utječe sastav perfuzata, posebice onkotski tlak i osmolarnost, što je u skladu s našim rezultatima [20].

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI ZATAJENJE BUBREGA/BUBREGA

Glavni odgovorni organ za regulaciju elektrolita jebubregali postoje dokazi da jebubregtakođer ima koristi od ravnoteže elektrolita. Utvrđeno je da neravnoteža kalija, a posebno hipokalijemija, može dovesti do raznih promjena ububrežna funkcijauključujući poremećeni tubularni transport, poremećenu sposobnost koncentracije urina, promijenjenu reapsorpciju natrija i unutarstaničnu acidozu [21-23]. Kako bi objasnili neizbježni gubitak važnih perfuznih elektrolita mokraćom, Weissenbacher et al. predložio je korištenje recirkulacije urina tijekom NMP. Pokazali su da olakšava pravilno održavanje volumena perfuzije i homeostaze u odbačenih ljudibubrega, čak i nakon 24 sata NMP [7]. Izmjerena koncentracija albumina u perfuzatu smanjivala se tijekom vremena tijekom perfuzije. Ovo smanjenje je najvjerojatnije uzrokovano prianjanjem albumina na plastičnu cijev perfuzijskog kruga i samo se mala količina može pripisati gubitku u proizvedenom urinu, što je također primijećeno u drugim NMP studijama [24]. Ovaj gubitak albumina mokraćom može se objasniti oštećenjem endotelnih stanica izazvanim toplom ishemijom s prekidom dijafragme filtera što rezultira proteinurijom, što je u skladu s našim opaženim razinama albuminurije tijekom NMP [25].

Ne možemo u potpunosti objasniti mehanizam razlika između skupina koje smo promatralibubregpovećanje tjelesne težine tijekom NMP. Histološki pregled nije bio odlučujući za moguća područja nastanka edema. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razjasnili potencijalno multifaktorijalni mehanizmi povećanja tjelesne težine u odnosu na korištenu perfuzijsku otopinu. Mjereni su različiti parametri perfuzije, gdjebubrežnitok je pokazao najupečatljivije razlike.Bubrežnaprotok u skupinama 3 i 4 održavao je najstabilnije razine tijekom 7--satnog NMP razdoblja. Otopine u ovim skupinama bile su nadopunjene vazodilatatorom, dok otopine u prve dvije skupine nisu. Endogeni vazodilatatori potiču relaksaciju glatkih mišića krvnih žila i time reguliraju regionalni protok krvi [26]. Budući da skupine 1 i 2 nisu bile nadopunjene vazodilatatorom, vazospazmi su mogli rezultirati smanjenimbubrežniarterijski protok. Štoviše, postoje dokazi da se medularni i kortikalni protok mogu individualno regulirati [27,28]. Preliminarni neobjavljeni podaci naše grupe, temeljeni na preciznim i kvantitativnim funkcionalnim MRI (ASL) mjerenjima protoka tijekom NMP-a snažno podržavaju ovaj mehanizam. U tim eksperimentima,bubrežniprotok tijekom prvog sata NMP je uglavnom medularni, koji prelazi na kortikalni protok nakon više od sat vremena perfuzije. Ova regionalna preraspodjela protoka mogla bi objasniti vrhunac koji se vidi u perfuzijama skupina 1 i 2, vjerojatno zbog medularnog ranžiranja tijekom prvog sata. Dodatak vazodilatatora na početku NMP-a mogao bi poboljšati pretežno kortikalnu mikroperfuziju odmah na početku NMP-a, što bi rezultiralo stabilnijim protokom kao što je primijećeno u skupini 3 i 4. Stoga, ako je stabilan uzorak protoka i moguće fiziološkiji pretežno kortikalni tijekom NMP-a je poželjna perfuzija, može biti preporučljivo dodati vazodilatator u perfuzijsku otopinu. Alternativno, opetovano ispiranje eritrocita prije perfuzije može smanjitibubrežnivazokonstrikciju smanjenjem vazokonstrikcijske aktivnosti eritrocita [29].

Funkcija bubregatijekom NMP-a bio je izrazito oslabljen kod svih svinjabubrega, vjerojatno zbog inicijalnog toplotnog ishemijskog oštećenja i nedostatka fizioloških humoralnih regulatornih mehanizama, poput onih koje pokreću antidiuretski hormon i aldosteron. Klirens kreatinina bio je nizak, a visoke vrijednosti FENa plus primijećene su u svim skupinama. Nagli porast FENa plus nakon 3 sata NMP-a u skupini 2 mogao je biti rezultat izostanka proizvodnje urina u nekolikobubregana t=240 i t=300, dok je na kraju perfuzijebubregaponovno počeo proizvoditi urin. Povišene vrijednosti FENa plus vjerojatno su rezultat tubularne nekroze, kao što je također prijavljeno u prethodnim studijama [30,31]. Dodatno, in vivo klirens kreatinina i razine FENa plus u velikoj su mjeri pod utjecajem humoralne regulacije. Kao humoralna regulacija

nedostajao tijekom NMP eksperimenata, fiziološki klirens kreatinina i razine FENa plus ne mogu se očekivati ​​u našem NMP postavu.

Za kvantificiranje ozljedebubrežnistanica, mjerene su razine ASAT i LDH. Najviše razine uočene su u skupinama 3 i 4, što sugerira da se većina ozljeda dogodila u ove dvije skupine. Kaths i sur. pokazalo je da povećane razine ASAT tijekom NMP koreliraju s posttransplantacijombubrežna funkcijastoga bi ASAT mogao biti važan biomarker za procjenu vitalnosti organa [20]. Utjecaj različitih sastava perfuzata na izmjerene razine ASAT naglašava važnost usklađivanja NMP protokola među transplantacijskim centrima, kako bi se omogućilo dosljedno tumačenje NMP podataka na globalnoj razini. Razine NAG-a, markera za promijenjeni cjelovitost tubula i oštećenje tubula [32,33], bile su najviše u skupini 3, što ukazuje da se većina ozljeda tubula dogodila u ovoj skupini. Razine TBARS mjerene su kako bi se kvantificirao oksidativni stres tijekom perfuzije. Najviše razine primijećene su u skupini 1 i 4, što sugerira dabubregau tim su skupinama doživjeli najveći oksidativni stres, što je moglo rezultirati oštećenjem stanične funkcije [34]. Promjena u omjeru Bax/Bcl-2 nakon 7 sati NMP-a u usporedbi s biopsijom prije NMP-a vjerojatno je rezultat početnog toplog ishemijskog razdoblja, a ne potencijalno štetnih učinaka koji se javljaju tijekom NMP-a. Ishemijska ozljeda nakon posljedične reperfuzije inducira regulatornu kaskadu apoptoze, koja igra ključnu ulogu u procesu popravka oštećenog proksimalnog tubula [35]. Iako su predloženi mnogi markeri normotermne ozljede, do danas niti jedan nije potvrđen u dobro utemeljenom kliničkom ispitivanju. Studija koja korelira niz obećavajućih markera ozljeda izmjerenih tijekom NMP s posttransplantacijombubrežna funkcijapotrebno je razjasniti koje bi potencijalne biomarkere trebalo uključiti u kriterije normotermne ex-vivo procjene održivosti.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE INFEKCIJE

Naša NMP postavka korištena je zajedno sa svinjskim modelom DCD-abubregdonacija u kojoj klaonicibubregabili iskorišteni. Ograničenje ove studije je to što se postupak u klaonici temelji na ispuštanju krvi nakon čega slijedi srčani zastoj, što ga čini neznatno drugačijim od stvarnog DCD modela u kojem je zastoj cirkulacije rezultat srčane ishemije i/ili zatajenja. Međutim, primijetili smo dabubregau našoj studiji pokazala je ishemijsku ozljedu sličnu onoj nastaloj nakon DCD [36,37]. Stoga smatramo da će sadašnji klaonički DCD model pomoći u smanjenju upotrebe laboratorijskih životinja uz zadržavanje bitne pouzdanosti i ponovljivosti. Iako su naše pokusne skupine bile relativno male, veličine naših skupina usporedive su s onima kod drugih svinjabubregstudije strojne perfuzije [17,38–40]. Parametri NMP perfuzije koje smo zabilježili u skupini 3, koja se temelji na britanskoj kliničkoj perfuzijskoj otopini koju su koristili Hosgood i sur., ne mogu se u potpunosti usporediti s rezultatima koje je prethodno objavila skupina Leicester/Cambridge [6,12]. U našoj studiji,bubregapodvrgnuti su mnogo duljem razdoblju NMP-a i bili su perfundirani s višim srednjim arterijskim tlakom. Štoviše,bubregaperfuzijom Hosgood et al. transplantirani su nakon strojne perfuzije. Za potpuno pouzdanu usporedbu između četiri perfuzijske otopine, buduća bi studija trebala uključiti transplantacijububreganakon NMP jer će to omogućiti stvarno praćenje i funkcionalnu procjenu in vivo.

Zaključno, perfuzija svinjabubregapokazalo se izvedivim sa sva četiri testirana rješenja. Međutim, postojale su značajne razlike između razina elektrolita,bubrežna funkcijaparametrima i markerima ozljeda u četiri skupine. Ove razlike, u kombinaciji s trenutnom heterogenošću u primijenjenim perfuzijskim rješenjima među skupinama, sprječavaju razvoj standardiziranih kriterija procjene NMP-a. Smatramo da je iu eksperimentalnom iu kliničkom NMP-u bitno pažljivo unaprijed specificirati točnu svrhu i željeno trajanje NMP-a, budući da bi svaki mogao zahtijevati potrebne prilagodbe u perfuziji i protokolu perfuzije. Važno je naglasiti da se ova studija usredotočila na učinke postojećih perfuzata u cjelini na izmjerene rezultate, a ne na istraživanje uloga pojedinačnih komponenti perfuzata. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razjasnili pojedinačni utjecaji i prednosti svakog sastojka perfuzata tijekom NMP-a