AKT aktiviran predkondicioniranjem kontrolira neuronsku toleranciju na ishemiju kroz put MDM2–p53Ⅰ

Sažetak

Jedan od najvažnijih mehanizama neuroprotekcije posredovane predkondicioniranjem je slabljenje stanične apoptoze, izazivanje tolerancije mozga nakon naknadne ozljede ishemije. U tom kontekstu, antiapoptotski signalni put PI3K/AKT igra ključnu ulogu u regulaciji stanične diferencijacije i preživljavanja.

Kliknite za cistanche tubulosa prah zaneuroprotekcija

Poznato je da aktivni AKT povećava ekspresiju mišje dvostruke minute-2 (MDM2), E3-ubikvitin ligaze koja destabilizira p53 za poticanje preživljavanja stanica raka. U neuronima smo nedavno pokazali da je interakcija MDM2-p53 potencirana farmakološkim predkondicioniranjem, temeljenim na subtoksičnoj stimulaciji NMDA glutamatnog receptora, koji sprječava ishemijom induciranu neuronalnu apoptozu.

Međutim, nije poznato doprinosi li ovaj mehanizam neuronskoj toleranciji tijekom ishemijskog predkondicioniranja (IPC). Ovdje pokazujemo da je IPC inducirao fosforilaciju AKT posredovanu PI3K na Ser473, koja je zauzvrat fosforilirala MDM2 na Ser166. Ova fosforilacija je pokrenula nuklearnu stabilizaciju MDM2, što je dovelo do destabilizacije p53, čime je spriječena apoptoza neurona nakon ishemijskog inzulta. Inhibicija puta PI3K/AKT s wortmaninom ili utišavanjem AKT-a izazvala je nakupljanje citosolnog MDM2, ukidajući neuroprotekciju izazvanu IPC-om.

Stoga IPC pojačava aktivaciju signalnog puta PI3K/AKT i potiče neuronsku toleranciju kontroliranjem interakcije MDM2–p53. Naša otkrića pružaju novi mehanički put uključen u IPC-induciranu neuroprotekciju putem modulacije AKT signalizacije, što sugerira da je AKT potencijalna terapijska meta protiv ishemijske ozljede. Ključne riječi: AKT; MDM2; p53; PI3K; ishemijska tolerancija; predkondicioniranje

1. Uvod

U ljudi je postojanje tranzitornog ishemijskog napadaja (TIA) otkriveno kao endogeno preduvjetno stanje s prednostima funkcionalnih ishoda u pacijenata s moždanim udarom [1-3]. Endogena neuroprotekcija inducirana kratkim, subtoksičnim ishemijskim podražajem, poznata kao ishemijsko predkondicioniranje (IPC), smatra se strategijom u novom polju neuroprotekcije protiv ishemijske ozljede [4-6].

Dokazi pokazuju da neuroprotekcija koju promovira IPC ovisi o transkripciji, translaciji i posttranslacijskim mehanizmima, koji mijenjaju funkciju ključnih proteina nakon ishemije [6-11]. Međutim, mehanizam koji je uključen u IPC-induciranu ishemijsku toleranciju (IT) nije u potpunosti razjašnjen u ljudskom mozgu [12,13].

Razvoj novih eksperimentalnih pristupa razumijevanju neuroprotekcije posredovane IPC-om predstavlja moćan alat za dešifriranje endogenih mehanizama koji leže u pozadini IT mozga [6], koji imaju potencijal za otkrivanje novih terapijskih ciljeva usmjerenih na smanjenje oštećenja mozga kod pacijenata s moždanim udarom. U posljednja dva desetljeća, apoptotička smrt neuronskih stanica pozicionirala se kao bitan mehanizam uključen u cerebralnu ishemijsku ozljedu [14-16]. U tom smislu, protein kinaza B ili AKT, serin/treonin kinaza koja zahtijeva funkcionalnu fosfoinozitid kinazu (PI3K) da se aktivira, smatra se bitnom metom za neuroprotektivne terapije nakon ishemije [17,18].

Nedavno smo pokazali da inhibicija signalnog puta PI3K/AKT povećava osjetljivost neurona na ekscitotoksičnost [19]. AKT je uključen u složenu anti-apoptotičku signalnu mrežu [20], čije komponente mogu biti prisutne na različitim podstaničnim lokacijama ovisno o vrsti tkiva [21,22]. U srcu, AKT je uključen u kardioprotekciju koju potiče predkondicioniranje [23].

Dokazi također pokazuju da fosforilirani AKT potiče preživljavanje neurona na početku cerebralne ishemije [24]. Iako aktivacija AKT-a može pridonijeti indukciji IT-a u mozgu [25], točan mehanizam koji uključuje njegovu aktivaciju posredovanu IPC-om ostaje nepoznat. U tumorskim stanicama, aktivacija signalnog puta PI3K/AKT dovodi do fosforilacije MDM2 na Ser166/186, što potiče nuklearnu translokaciju MDM2 [26,27] i pojačava njegovu aktivnost sveprisutnosti [28].

U jezgri se MDM2 veže za p53 i potiče njegovu ubikvitinaciju i naknadnu proteasomalnu degradaciju, što inhibira funkciju p53 [29]. U uvjetima stresa, p53 bi također mogao izazvati prekomjernu ekspresiju MDM2, što obrnuto potiskuje aktivaciju p53 u petlji negativne povratne sprege [30]. Inhibicija PI3K sprječava aktivaciju AKT [31] i fosforilaciju MDM2 u predkondicioniranom srcu [32].

U tom kontekstu, prethodno smo otkrili da in vivo predkondicioniranje mozga smanjuje volumen infarkta nakon prolazne okluzije srednje cerebralne arterije (tMCAO) povećanjem ekspresije razine proteina MDM2. Posljedično, kompleks MDM2–p53 oslabio je ishemijom izazvanu aktivaciju p53/PUMA/kaspaze-3 signalnog puta u primarnim kortikalnim neuronima [33].

Ovdje istražujemo ulogu PI3K/AKT signalnog puta u IPC-posredovanoj neuronalnoj toleranciji na naknadnu ishemijsku ozljedu, kao i temeljni mehanizam, i uglavnom se usredotočujemo na potencijalnu vezu između aktivacije AKT-a i kompleksa MDM2-p53 .

2. Rezultati

2.1. Neuroprotekcija koju promovira IPC

Posreduje fosforilacija AKT-a na Ser473, fosforilacija MDM2 na Ser166 i destabilizacija p53 Prethodno smo opisali utjecaj interakcije MDM2-p53 na neuronalnu osjetljivost na ishemiju [34] i IT [33]. Ovdje smo istražili potencijalnu ulogu AKT-a u neuroprotekciji posredovanoj IPC-om kao kandidata za uključivanje u put MDM2–p53.

Prvo, potvrdili smo da je ishemija pospješila aktivaciju AKT u neuronima, što je dokazano fosforilacijom AKT na Ser473. Kao što je prikazano na slici 1A, kratki (20 min) OGD značajno je inducirao ekspresiju p(Ser473)AKT i MDM2, dok su razine AKT proteina ostale nepromijenjene (slika S1A). Međutim, fosforilacija AKT nije opažena kada su neuroni bili podvrgnuti produljenom OGD (90 min). Štoviše, razine proteina MDM2 bile su niže, što je u skladu s većom ekspresijom proteina p53 kao što je prikazano na slici 1A.

Vremenski ovisna regulacija ekspresije Mdm2 nakon OGD (Slika 1B) potvrđuje da subakutna ishemija može biti važna za induciranje mehanizama koji sprječavaju stabilizaciju p53 nakon OGD, kao što je prethodno opisano [33]. Koristili smo kratki OGD (20 min) nakon kojeg je uslijedilo 2 h reoksigenacije kao model IPC (Slika S1B) [33]; stoga smo analizirali neuronske ekstrakte prikupljene nakon 4 sata reoksigenacije nakon OGD (OGD/R) ili nakon OGD kojem je prethodio IPC protokol (IPC plus OGD/R). Paralelno, neuroni su inkubirani u postavkama normoksije (Nx) ili predkondicioniranja (IPC) (Slika S1B).

Kao što je prikazano na slici 1C i slici S1C, IPC je inducirao ranu aktivaciju AKT, što je otkriveno fosforilacijom na Ser473 [35], nakon čega je uslijedila stabilizacija proteina MDM2 i fosforilacija na Ser166. IPC je također spriječio stabilizaciju p53 izazvanu OGD/R (Slika 1C). Zanimljivo, imunofluorescentne slike prikazane na slici 1D otkrivaju da IPC potiče fosforilaciju AKT na Ser473 u neuronima, koji se pretežno nakupljaju u jezgri, i smanjuje stabilizaciju p53 nakon OGD/R (IPC plus OGD/R) u usporedbi s neuronima koji nisu prethodno kondicionirani (OGD /R).

Posljedično, IPC je spriječio neuronsku apoptozu i aktivaciju kaspaze-3 uzrokovanu OGD/R, što je izmjereno protočnom citometrijom (Slika S1D) odnosno fluorimetrijskim testovima (Slika S1E). Kako bismo potvrdili ulogu p53 u IPC-posredovanoj neuroprotekciji, koristili smo neurone koji eksprimiraju (divlji tip; wt) ili ne (knockout; ko) protein p53. Naši rezultati pokazuju da su neuroni bez p53 (slika S1F) bili otporniji na apoptozu izazvanu OGD-om od p53 wt neurona.

Štoviše, razine apoptoze u neuronima p53KO bile su slične onima uočenim u predkondicioniranim (IPC plus OGD/R) wt neuronima (Slika S1G), čime se potvrđuje ključna uloga destabilizacije p53 u neuroprotekciji posredovanoj IPC-om [33]. Naši rezultati pokazuju da je IPC inducirao neuroprotekciju protiv ishemijskog inzulta kroz mehanizam koji uključuje fosforilaciju AKT na Ser473, stabilizaciju MDM2 i fosforilaciju na Ser166 i destabilizaciju p53.

2.2. IPC pokreće fosforilaciju MDM2 na Ser166 putem PI3K/AKT puta

PI3K/AKT signalni put uključen je u neuronski IT i in vitro [36] i in vivo [37]. Međutim, uloga IPC-posredovane aktivacije puta PI3K/AKT u regulaciji kompleksa MDM2–p53 ostaje neistražena. Kako bi se to razjasnilo, neuroni su inkubirani s ireverzibilnim i specifičnim inhibitorom puta PI3K/AKT, wortmaninom [19].

Kao što je prikazano na slici 2A, wortmannin je ukinuo IPC-pojačanu (Ser473)AKT fosforilaciju i destabilizaciju p53, kao što je prikazano na slici 1D. Ovi rezultati upućuju na izravnu vezu između aktivacije AKT-a i inhibicije p53-posredovane neuronske apoptoze (Slika S1D) i aktivacije kaspaze-3 (Slika S1E) inducirane nakon OGD/R. Glavni regulator stabilizacije p53, MDM2, cilj je AKT [26], koji fosforilira MDM2 na Ser166 i Ser186 [26]. Inhibicija PI3K s wortmaninom spriječila je fosforilaciju i (Ser473)AKT i (Ser166)MDM2 induciranu IPC-om (Slika 2B).

Specifična Akt-posredovana fosforilacija MDM2 na Ser166 inducirana IPC-om potvrđena je upotrebom male interferirajuće RNA (siRNA) specifično dizajnirane protiv AKT1 proteina (siAkt), snažno izraženog u kortikalnim neuronima, a čija je aktivnost neophodna za preživljavanje neurona nakon ishemije [ 38]. Kao što je prikazano na slici 3, siAkt je smanjio ukupne razine AKT i p(Ser473)AKT proteina 3. dana nakon transfekcije, kako u HEK-293T stanicama (Slika 3A), tako i u kortikalnim neuronima (Slika 3B).

Štoviše, AKT knockdown (siAkt) spriječio je (Ser166)MDM2 fosforilaciju (Slika 3B). Ovi rezultati pokazuju da IPC-aktivirani signalni put PI3K/AKT potiče fosforilaciju MDM2 na Ser166, što može biti odgovorno za stabilizaciju MDM2 i posljedičnu destabilizaciju p53 nakon ishemijske ozljede.

2.3. IPC-aktiviran AKT pokreće stabilizaciju nuklearnog MDM2 proteina nakon ishemije

Aktivacija AKT-a uključena je u nuklearnu translokaciju MDM2 u tumorskim stanicama [26]. Uzimajući u obzir važnost nuklearne stabilizacije MDM2 za preživljavanje neurona nakon ishemije [34] i, točnije, njegovu neuroprotektivnu ulogu u IPC [33], odlučili smo dodatno istražiti važnost PI3K/AKT signalnog puta u regulaciji substanične lokalizacije MDM2 protein.

Stoga su neuroni ili HEK-293T stanice transficirane ljudskim MDM2-označenim proteinom (MDM2-GFP). Reprezentativni blotovi transficiranih HEK-293T stanica i slike iz neurona koji ektopično izražavaju ljudski protein MDM2 nakon četiri različita eksperimentalna uvjeta (Nx, IPC, OGD/R i IPC plus OGD/R) prikazani su na slici 4A i slici S1H , odnosno.

Ektopična ekspresija MDM2- GFP potvrdila je da IPC potiče MDM2 nuklearnu akumulaciju u usporedbi s nekondicioniranim ishemijskim (OGD/R) ili normoksičnim (Nx) neuronima (Slika 4A, B), kao što je otkriveno kvantifikacijom omjera nuklearne/citosolne fluorescencije (Slika S2B) i intenzitet nuklearne fluorescencije MDM2-GFP (Slika S2C).

2.4. IPC potiče interakciju p(Ser473)AKT i MDM2, što poboljšava stabilizaciju MDM2 u jezgri i smanjuje induciranu apoptozu neurona nakon ishemije

Nakon demonstracije uloge IPC-pojačane aktivacije puta PI3K/AKT u nuklearnoj stabilizaciji MDM2, dodatno smo istražili jesu li p(Ser473)AKT i MDM2 međusobno djelovali unutar jezgre (Slika 6A). Imunoprecipitacija MDM2 iz ekstrakata proteina jezgre, praćena imunoblotingom protiv MDM2 i p(Ser473)AKT, otkrila je da IPC potiče interakciju između p(Ser473)AKT i MDM2, nakon OGD/R, čime se sprječava stabilizacija jezgre p53 izazvana OGD/R, kao što je prikazano na ulazu jezgre (slika 6A).

Na kraju, proučavali smo štetan učinak poremećaja puta PI3K/AKT na apoptozu neurona (Slika 6B). Inhibicija AKT-a poništila je zaštitni učinak IPC-a prije OGD-a, što potvrđuje neurozaštitnu ulogu AKT-MDM2 u kontekstu IT-a. Naši rezultati stoga pokazuju da IPC inducira fosforilaciju i aktivaciju AKT-a, što potiče fosforilaciju MDM2 na Ser166 i nuklearnu translokaciju, gdje stupa u interakciju s p(Ser473)AKT. Ovaj mehanizam može pridonijeti poboljšanoj nuklearnoj stabilizaciji MDM2, koji igra bitnu ulogu u ishemijskoj toleranciji izazvanoj IPC-om.

Kako Cistanche štiti neurone?

Postoje neki dokazi koji sugeriraju da Cistanche može zaštititi neurone smanjenjem apoptoze (programirane stanične smrti) i promicanjem preživljavanja neurona. Apoptoza je prirodni proces koji se događa u tijelu kako bi se uklonile oštećene ili neželjene stanice, ali može biti štetna ako se događa prekomjerno ili neprikladno. U laboratorijskim studijama utvrđeno je da Cistanche inhibira apoptozu, a taj učinak može pomoći u zaštiti neurona od oštećenja.

Osim toga, Cistanche sadrži brojne bioaktivne spojeve za koje se pokazalo da imaju neuroprotektivne učinke. Na primjer, sadrži ehinakozid, za koji se pokazalo da štiti neurone od oksidativnog stresa i upale. Također sadrži akteozid za koji je utvrđeno da ima protuupalna i antioksidativna svojstva.

Nastavit će se...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 i Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Institut za funkcionalnu biologiju i genomiku, Sveučilište u Salamanci, CSIC, 37007 Salamanca, Španjolska; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irena_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Institut za biomedicinska istraživanja u Salamanci, Sveučilišna bolnica u Salamanci, Sveučilište u Salamanci, CSIC, 37007 Salamanca, Španjolska

3 Odjel za biokemiju i molekularnu biologiju, Sveučilište Salamanca, 37007 Salamanca, Španjolska 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Španjolska * Korespondencija: mdesteban@usal.es ; Tel.: plus 34-923-29-4908