Ekstrakt svinjske placente povećava stanične razine NAD u ljudskim epidermalnim keratinocitima

Najbolje biljke protiv starenja-Herbal Cistanche

Nikotinamid adenin dinukleotid(NAD) je klasični kofaktor za mnoge redoks reakcije i prisutan je u svim živim stanicama u oksidiranom (NAD plus ) i reduciranom (NADH) obliku. NAD plus je također poznat kao esencijalni ko-supstrat za enzime koji troše NAD plus kao što su sirtuin (SIRT) i poli ADP-riboza polimeraza (PARP). Budući da ti enzimi igraju središnju ulogu u raznim biološkim procesima, uključujući popravak DNA, metabolizam mitohondrija i otpornost na stres, neuravnotežena homeostaza NAD utječe na njihove ključne procese1. Razina NAD u tkivima/organima opada s godinama, što rezultira neuravnoteženom homeostazom NAD2-6. Stoga sada postoji konsenzus da održavanje razine NAD dovodi do prevencije i liječenja starenja i bolesti povezanih sa starenjem7. NAD se biosintetizira različitim putovima, uključujući de novo biosintezu iz triptofana, Preiss–Handlerov put iz nikotinske kiseline i put spašavanja iz nikotinamida (NAM)8. Kod sisavaca, put spašavanja je glavni put za održavanje stanične razine NAD9. U ovom putu, NAM se pretvara u nikotinamid mononukleotid (NMN) pomoću NAM fosforiboziltransferaze (NAMPT), a zatim se pretvara u NAD pomoću NMN adenililtransferaza. Nikotinamid ribozid (NR) se pomoću NR kinaza pretvara u NMN i zatim integrira u put spašavanja. Intermedijarni metaboliti NAD, kao što su NMN i NR, pokazali su da podižu razine NAD u različitim stanicama i tkivima i poboljšavaju bolesti povezane sa starenjem10,11.

Ekstrakt posteljice (PE) naširoko se koristi u tradicionalnoj medicini za zacjeljivanje rana. PE je bogat izvor brojnih bioaktivnih komponenti, uključujući aminokiseline, nukleinske kiseline, masne kiseline, minerale, vitamine, hormone, bioaktivne peptide, citokine i faktore rasta. Poznato je da ima različita farmakološka djelovanja, poput protuupalnog, antioksidativnog, regenerativnog i imunomodulatornog djelovanja12. Stoga se supkutane i intramuskularne injekcije ljudskog PE (HPE) klinički koriste za liječenje nekoliko bolesti, uključujući simptome menopauze i kronične bolesti jetre13. Nadalje, HPE se klinički koristi kao sredstvo protiv bora uglavnom u azijskim zemljama zbog njegovih učinaka na rast stanica i sintezu kolagena14. Budući da je uporaba HPE-a ograničena na medicinske primjene u nekim zemljama poput Japana, svinjski PE (PPE) nedavno je razvijen kao alternativa HPE-u i korišten kao sirovi sastojak u zdravoj hrani i kozmetici. Studija in vivo na modelu mišjeg kontaktnog dermatitisa pokazala je da lokalna OZO ima protuupalne i antioksidativne učinke na kožu15. Kliničke studije su pokazale da je lokalna OZO korisna za liječenje kroničnih rana koje ne zacjeljuju i za sprječavanje stvaranja bora16,17. Nadalje, randomizirano, dvostruko slijepo, placebom kontrolirano kliničko ispitivanje provedeno je na zdravim odraslim ženama kako bi se potvrdile prednosti oralnog uzimanja OZO za kožu i pokazalo se da se stanje kože u skupini koja je uzimala OZO značajno poboljšalo18. Ova izvješća podupiru koncept da OZO tretman može ublažiti ili spriječiti starenje kože.

PE se konvencionalno koristi kaosredstvo protiv starenja, a brojne kliničke studije su to utvrdilesvojstva protiv starenja. Međutim, mehanizam na kojem se temelji učinak PE protiv starenja ostaje nejasan. Ovo izvješće pokazalo je da PPE sadrži nekoliko prekursora NAD-a, kao što su NMN i NR, te povećava unutarstanične razine NAD-a u normalnim ljudskim epidermalnim keratinocitima (NHEK). Naša otkrića pružaju nove uvide u mehanizam putem kojeg PE ispoljava svoje učinke protiv starenja održavanjem unutarstanične homeostaze NAD.

Rezultati

PPE povećava unutarstanične razine NAD. Kako bismo istražili mijenja li PPE stanična NAD stanja, uzgojili smo NHEK u mediju dopunjenom PPE i kvantificirali njihove unutarstanične razine NAD plus i NADH. Rezultati su pokazali da je PPE značajno povećao količinu i NAD plus i NADH u NHEK-ima na način ovisan o dozi (slika 1A). Ukupna razina NAD (NAD plus plus NADH) u stanicama tretiranim s 1 mg/mL PPE bila je približno 1,5 puta viša nego u netretiranim stanicama (Slika 1A). Osim toga, u eksperimentu vremenskog tijeka, značajno povišenje NAD plus, NADH i ukupnih razina NAD primijećeno je nakon 4 sata tretmana s 1 mg/mL PPE (Slika 1B). Ispitivanje {{10}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolij bromida (MTT) potvrdilo je da {{20} }.5–2 mg/mL PPE nije imalo učinka na metaboličku aktivnost stanica, dok je 5 mg/mL PPE ili pozitivna kontrola (0,2 posto Triton X-100 [TX-100]) pokazalo značajnu toksičnost za stanice (Slika 1C). Budući da je NAD jedva otkriven u samoj PPE (podaci nisu prikazani), čini se da učinak PPE na stvaranje NAD-a nije posljedica priljeva NAD-a izvedenog iz PPE-a u NHEK. Stoga ovi rezultati sugeriraju da PPE može povećati unutarstanične razine NAD. Aktivni sastojci PPE su male molekule, a ne proteini. Kako bismo utvrdili potiče li PPE staničnu biosintezu NAD-a putem NAMPT reakcije u putu spašavanja NAD-a, proveli smo test oporavka NAD-a pomoću NAMPT inhibitora FK866 (Slika 2A). FK866 značajno je smanjio ukupne razine NAD 24 sata nakon dodavanja (slika 2B).

Zanimljivo, unatoč odsutnosti NAMPT aktivnosti unutar NHEK-a, PPE je potisnuo FK{{0}} induciranu depleciju NAD-a na način ovisan o dozi (Slika 2B). Mnoga su izvješća pokazala da PE sadrži proteine ​​poput citokina i faktora rasta13,19,20. Stoga smo pretpostavili da neki bioaktivni proteini ili svinjski NAMPT sadržani u PPE mogu poboljšati unutarstaničnu biosintezu NAD u NHEK-ima. Kako bismo potvrdili našu hipotezu, odvojili smo OZO na frakcije visoke i niske molekularne težine (HMW, LMW) pomoću centrifugalnog filterskog uređaja (granična vrijednost: 3 kDa). Budući da je test oporavka NAD pomoću FK866 jasnije pokazao učinak PPE na biosintezu NAD nego u odsutnosti FK866 (slike 1A i 2B), nastavili smo identificirati aktivne sastojke u PPE pomoću ovog testa. Neočekivano, HMW-PPE je zahtijevao visoku koncentraciju od 1 mg/mL za značajnu obnovu razina NAD-a, dok je LMW-PPE jasno ublažio smanjenje NAD-a izazvano FK866-čak i pri niskoj koncentraciji od 0,25 mg/mL (Slika 2C i D). Stoga ovi rezultati sugeriraju da su primarni aktivni sastojci u PPE male molekule manje od 3 kDa, a ne proteini kao što su faktori rasta i citokini.

OZO sadrži prekursore NAD, kao što su NMN i NR. Nadalje smo frakcionirali LMW-PPE u 12 frakcija pomoću reverzne faze tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC) i istražili koja je frakcija pridonijela obnavljanju smanjenja NAD izazvanog FK866-. Tipični HPLC kromatogram LMW-PPE prikazan je na slici 3A. Test oporavka NAD-a pokazao je da je samo frakcija 3 izrazito povećala razine NAD-a u NHEK-ovima tretiranim FK866- (Slika 3B). Prekursori NAD-a, kao što su NMN i NR, podižu unutarstanične razine NAD-a bez intervencije NAMPT-a u različitim staničnim linijama uključujući NHEKs10,21. Budući da LMW-PPE i dalje povećava sadržaj NAD-a u NHEK-ima, čak i kada je NAMPT bio inhibiran FK866, pretpostavili smo da prekursori NAD-a sadržani u PPE-u povećavaju unutarstaničnu proizvodnju NAD-a. Kako bismo testirali ovu hipotezu, analizirali smo frakciju 3 koristeći tekućinsku kromatografiju – tandemsku masenu spektrometriju (LC–MS/MS) kako bismo otkrili NAD prekursore. Rezultati su pokazali da su tri ionska vrha u skladu s NMN (m/z 335→123), NR (m/z 255→123) i NAM (m/z 123→80) otkrivena u frakciji 3 ( Slika 3C). Kvantifikacijske analize otkrile su da su koncentracije NMN, NR i NAM sadržane u cijeloj PPE bile 0,22, 17,62, odnosno 0,14 ng/mg (Tablica 1). Ovi rezultati sugeriraju da su najmanje tri prekursora NAD-a, NMN, NR i NAM, prisutna u PPE i sudjeluju u intracelularnom jačanju NAD-a.

Slika 2. PPE ublažava smanjenje NAD-a pomoću FK866 u NHEK-ima. (A) Put spašavanja biosinteze NAD. NHEK-ovi su prethodno tretirani s FK866 tijekom 30 minuta i inkubirani s cijelim PPE (B), HMW-PPE (C) ili LMW-PPE (D) u navedenim koncentracijama tijekom 24 sata. Ukupne razine NAD određene su korištenjem pribora za testiranje NAD plus /NADH. †str<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

Lokalna primjena OZO na rekonstruiranu ljudsku epidermu povećava razine NAD u tkivima. Primarni aktivni sastojci u učinku PPE-a na povećanje NAD-a male su molekule za koje se može očekivati ​​da imaju veću transdermalnu sposobnost apsorbiranja od većih proteina kao što su faktori rasta. Stoga se lokalna primjena PPE na kožu čini prikladnom opcijom za povećanje razine NAD u tkivima kože. Kako bi se istražilo utječe li lokalna primjena PPE na razine NAD-a u epidermisu ispod stratum corneuma, 3-dimenzionalno rekonstruirana ljudska epiderma (RHE) tretirana je PPE-om na strani stratum corneuma i uzgajana u mediju s prisustvom ili odsutnošću od FK866 (Slika 4A). Lokalna primjena PPE povećala je razine NAD-a za 9,1 posto (nije značajno) odnosno 7,3 posto (značajno) u odsutnosti ili prisutnosti FK866 (slika 4B). PPE nije imao učinka na metaboličku aktivnost stanice kada je testiran do 10 mg/mL, dok je 1 posto TX-100 značajno smanjeno (Slika 4C). Ovi rezultati sugeriraju da se aktivni sastojci u PPE mogu infiltrirati u subkornealnu kožu i povećati razinu NAD-a u koži bez izazivanja štetnih učinaka.

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950