Pinocembrin ublažava postinfarktno zatajenje srca putem aktivacije signalnog puta Nrf2/HO-1 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak

Pozadina:Oksidativni stres važan je čimbenik uključen u napredovanje zatajenja srca. Trenutna studija provedena je kako bi se ispitalo može li pinocembrin ublažiti postinfarktno zatajenje srca (PIHF) i mehanizme koji leže u pozadini.

Kliknite ovdje da saznate više

Metode:Štakorima je podvrgnuto podvezivanje prednje silazne lijeve arterije kako bi se inducirao infarkt miokarda, a zatim su uzgajani 6 tjedana kako bi se izazvalo kronično zatajenje srca. Zatim je pinocembrin davan svaki drugi dan tijekom 2 tjedna. Učinci su procijenjeni ehokardiografijom, western blotom, Massonovim bojanjem, biokemijskim ispitivanjima, imunohistokemijom i fluorescencijom. In vitro smo također uzgajali H9c2 kardiomiocite i srčane miofibroblaste kako bismo dodatno potvrdili mehanizme.

Rezultati:Otkrili smo da su pogoršanja srčanih funkcija izazvana PIHF-om značajno ublažena primjenom pinocembrina. Uz to, liječenje pinocembrinom također je oslabilo taloženje kolagena i povećalo receptor faktora rasta vaskularnog endotela 2 u graničnoj zoni infarkta zajedno s oslabljenom apoptozom, što je povezano s poboljšanjem oksidativnog stresa što je dokazano smanjenjem reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) u srčanom tkivu i malondialdehid (MDA) u serumu, te povećanje superoksid dismutaze (SOD). To je bilo popraćeno regulacijom putanje eritroidnog nuklearnog faktora 2-srodnog faktora 2 (Nrf2)/hem oksigenaze-1(HO-1). U eksperimentima in vitro otkrili smo da specifični inhibitor Nrf2 značajno poništava učinke proizašle iz pinocembrina, uključujući antioksidans, anti-apoptozu, anti-fibrozu i neovaskularizaciju, što dalje ukazuje na poboljšanje PIHF-a pinocembrinom u Nrf2/HO-1 način ovisan o putu.

Cistanche može poboljšati imunitet

Zaključak:Pinocembrin je poboljšao srčane funkcije i remodeliranje kao rezultat PIHF-a uklanjanjem ROS-a i aktivacijom puta Nrf2/HO-1 što je dodatno smanjilo taloženje kolagenih vlakana i apoptozu, te olakšalo angiogenezu.

Ključne riječi:Pinocembrin, zatajenje srca, oksidativni stres, Nrf2/HO-1

Uvod

Zatajenje srca (HF), karakterizirano nizom terminalnih kliničkih sindroma koji su posljedica strukturnih i/ili funkcionalnih oštećenja srca, ostaje globalno zdravstveno opterećenje, s infarktom miokarda (MI) kao vodećim uzrokom (Ziaeian i Fonarow 2016; Galli i Lombardi 2016; Rengo et al.2013). Unatoč velikom napretku koji je postignut u terapijama i kvaliteti skrbi za srčanu infarkt, procjenjuje se prevalencija od 37,7 milijuna osoba svake godine u cijelom svijetu, uz 50 posto smrtnosti 5 godina nakon dijagnoze srčane insuficijencije (Go et al. .2014). Trenutna dilema mogla bi se djelomično pripisati činjenici da se post-infarktna srčana insuficijencija (PIHF) sastoji od širokog spektra patofizioloških mehanizama na koje se sadašnje terapijske metode ne mogu u potpunosti pozvati.

Akumulirajuće studije pokazale su da je oksidativni stres (OS) pretežno uključen u patološko napredovanje PIHF-a (Dubois-Deruy i sur. 2020; Ma i sur. 2019; Bubb i sur. 2017; Habtemariam 2019). OS, uglavnom predstavljen prekomjerno nakupljanje slobodnih radikala/reaktivnih vrsta kisika (ROS) koje sadrže hidroksilni radikal, superoksid, dušikov oksid, itd. (Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019), dokazano je da može izazvati oksidativnu modifikaciju ili oštećenje lipida , proteina i DNK, s poremećajima organela, upalom, apoptozom u miocitima i intersticijalnom fibrozom koja nastaje (Dubois-Deruy i sur. 2020; Bubb i sur. 2017; Hermida i sur. 2018). Zbog višestrukih štetnih učinaka ROS-a, antioksidansi su uzeti u obzir u PIHF terapijama čiji se mehanizmi sastoje od izravnog uklanjanja ROS-a i/ili stimulacije antioksidativne obrane koja sadrži glutation, superoksid dismutazu (SOD), katalazu, itd.( Habtemar-iam 2019). Međutim, žalosno je što primjena nekih antioksidansa, niti vitamina E (Lee et al. 2005) niti resveratrola (Made et al. 2015; Olesen et al. 2014), nije zadovoljila zadovoljstvo u terapiji kardiovaskularnih bolesti, dokazuje neuspjeh u poboljšanju srčanih funkcija. Stoga su u terapiji PIHF potrebni učinkovitiji antioksidansi.

Pinocembrin (Pino) ​​(kemijska struktura prikazana je na slici 1A) prirodni je flavonoidni spoj koji se može ekstrahirati iz meda, propolisa i nekoliko drugih biljaka (Lan et al. 2015; Rasul et al. 2013) uz umjetna sinteza (Costa i Leitao 2011), koja ima protuupalno, antibakterijsko, anti i antikancerogeno djelovanje (Rasul i sur. 2013; Ye i sur. 2019), uz naglašeno antioksidativno djelovanje (Kim i sur. 2020; Sangweni i sur. .2020). Kao što je prethodno pokazano, fenolna struktura Pina odgovorna za izravnu eliminaciju ROS-a, kao i fenolne i nefenolne strukture koje intenziviraju antioksidacijsku obranu (Habtemariam 2019.) odgovorne su za antioksidativni učinak Pina, po čemu je Pino proučavan i primijenjen u širokoj razne bolesti, kao što su neurodegenerativne bolesti, ateroskleroza, toksičnost kardiomiocita izazvana doksorubicinom (Sangweni et al. 2020; Sang et al. 2012; Liu et al. 2014). Međutim, s obzirom na to da je nekoliko antioksidansa za infarkt miokarda i srčano srce nevažeće ili nedostatno za pretvorbu u kliničku upotrebu, ostaje nedovoljno razjašnjeno može li se antioksidativni učinak Pinoa ostvariti u terapiji PIHF-a. Ovo je istraživanje stoga provedeno kako bi se istražilo može li primjena Pina imati blagotvorne učinke na PIHE, obećavajući da će biti novost, ili ako ne dominantan, ali barem pomoćni tretman.

Metode i materijali

Životinjski model i protokol pokusa

56 mužjaka Sprague-Dawley štakora, kupljenih u centru za pokuse na životinjama Kineskog sveučilišta Three Gorges,

uzgojene su u Wuhan No.3 bolnici za životinje. Svi pokusi bili su službeno dopušteni i izvedeni u Hubei Key Laboratory of Cardiology, u skladu s Vodičem za njegu i korištenje laboratorijskih životinja koji je objavio Nacionalni institut za zdravlje SAD-a (NIH Publikacija br. 82-23, revidirana 1996.).

Štakori su u početku primili ligaciju lijeve prednje silazne koronarne arterije (LAD) ili lažnu operaciju. Ukratko, štakori su anestezirani 3-postotnim pentobarbitalom (2 mL/kg; Sigma-Aldridge, St. Louis, SAD, intraperitonealno), nakon čega je uslijedila intubacija dušnika i respiratorna potpora (plimni volumen: 5-10 mL, brzina: 70 puta/minuti). Naknadno je izvršeno izlaganje srca i LAD je povezan 7-0 monofilamentnim najlonskim šavovima. Pojava bljedila apexcordisa ili elevacije ST spojnice na I odvodu elektrokardiograma upućivala je na indukciju MI. Lažna operacija podvrgnuta je identičnim postupcima osim LAD ligacije. Penicilin (200,000 IU) injiciran je intramuskularno jednom dnevno tjedan dana nakon operacije.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 posto ; Sigma-Aldridge) ili isti volumen fiziološke otopine ubrizgan je intravenski kroz repnu venu svaki drugi dan tijekom 2 tjedna. Doziranje se odnosilo na prethodnu studiju (Lan et al.2017). Protokol je ilustriran na slici 1B.

Kontrolni pozitivni kontrolni štakori sadržavali su 3 skupine: lažna plus fiziološka otopina (lažna skupina); LAD ligacija plus fiziološka otopina (HF skupina); LAD ligacija plus enalapril (HF plus ACEI grupa). Štakori su bili podvrgnuti odgovarajućim operacijama osim što su štakori HF plus ACEI skupine hranjeni oralno s 20 mg/kg enalaprila.

Ehokardiografska mjerenja

Srčane funkcije procijenjene su transtorakalnom ehokardiografijom korištenjem ultrazvučnog sustava za oslikavanje (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Toronto, Kanada), kao što je prethodno objavljeno u našoj skupini (Fo et al.2020). Unutarnja dimenzija lijeve klijetke na krajnjem dijastoličkom stadiju (LVIDd) i krajnjem sistoličkom stadiju (LVIDs), krajnji sistolički i krajnji dijastolički volumen lijeve klijetke (LVESV i LVEDV) zabilježeni su dvodimenzionalnim M-mod ehokardiogramima tijekom najmanje 3 uzastopnih ciklusa za svakog štakora. Nakon toga su izračunati ejekcijska frakcija lijeve klijetke (LVEF) i frakcijsko skraćenje (FS), koji odražavaju sistoličku funkciju.

Priprema uzorka

Nakon primjene Pino i ehokardiografskih testova, štakori su ponovno anestezirani. Više od 2 mL venske krvi uzeto je iz repne vene u vakuumske epruvete za prikupljanje krvi koje sadrže etilendiamintetraoctenu kiselinu (EDTA) uzastopnim centrifugiranjem pri brzini od 3000 o/min tijekom 15 minuta i na temperaturi od 4 stupnja C, nakon čega je uslijedila izolacija supernatant seruma i čuvanje na -80 "C. Zatim su srca brzo sakupljena. Dio granične zone infarkta svakog srca je odsječen i zamrznut u tekućem dušiku za Western blot analizu, s drugim tkivom srca fiksiranim u 4 postotka paraformaldehida dulje od 24 h.

Massonovo bojenje

Proveli smo Massonovo bojanje kako bismo otkrili taloženje kolagena u graničnoj zoni infarkta. Ventrikule fiksirane paraformaldehidom ugrađene su u parafin i zatim izrezane na 5- μm dijelove. Sekcije su naknadno obojene Massonovim trikromom gdje je kolagen obojen u plavo, miokard u ružičasto, a jezgra u crno. Udio taloženja kolagena izračunat je softverom Image J (NIH, Bethesda, MD) pri povećanju × 200.

Imunohistokemijska analiza

Imunohistokemijska analiza provedena je kako bi se procijenila gustoća receptora faktora rasta vaskularnog endotela 2 (VEGFR2) čija je regulacija pospješila angiogenezu koja je bila korisna i važna u slabljenju remodeliranja (Rengo et al. 2013). Ventrikularne sekcije su proizvedene kao one koje su provedene u Massonovom bojenju, nakon čega su deparafinizirane i rehidrirane. Zatim su rezovi primili povrat antigena posredovan toplinom i tretirani su s 3 posto H, O, da blokiraju endogenu peroksidazu, uz inkubaciju 1 ug/mL VEGFR2 antitijela (Abcam, ab9530) tijekom 12 sati na 4 stupnja. Nakon toga, rezovi su inkubirani sa sekundarnim antitijelima obilježenim peroksidazom hrena (HRP) (1:200, usluga, G1213) 50 minuta na 37 stupnjeva. Dodatno, 3,3'-diaminobenzidin je korišten za razvoj pozitivnog bojenja koje je prikazan u tawny. Na kraju, analizirana je i izračunata prosječna optička gustoća VEGFR2 softverom Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, SAD).

Ispitivanje nick-end označavanja posredovano terminalnom deoksinukleotidil transferazom (TUNEL)

Apoptoza je naknadno otkrivena TUNEL testom. Prethodno proizvedene parafinske mase koje ugrađuju ventrikularno tkivo izrezane su na druge rezove za TUNEL test, nakon čega je uslijedilo TUNEL bojanje prema uputama proizvođača komercijalnog kompleta za test (Roche, Švicarska; 11684817910). Ukratko, ventrikularne sekcije bile su izložene TUNEL reagensu, gdje su TdT i dUTP pomiješani u omjeru 1:9, tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, nakon inkubacije proteinaze K i rupture stanične membrane. Konačno, fluorescentne slike promatrane su na valnoj duljini od 530 nm koja je bila potaknuta valnom duljinom emisije od 450 nm (×400 povećanje). Brzina apoptoze ventrikularnih tkiva u svakoj skupini je analizirana i izračunata Image Software-om.

Western blot

Implementiramo Western blot kako bismo razjasnili temeljne mehanizme kojima je Pino poboljšao PIHF. Postupci ekstrakcije i pripreme proteinskog uzorka nalikuju onima prethodno navedenim u našoj studiji (Chen et al.2020a). Membrane su testirane antitijelima protiv eritroidnog 2-srodnog faktora 2 (Nrf2), hem oksigenaze{{ 4}}(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000,tehnologija stanične signalizacije,2524S), BCL-2 (1:1000,tehnologija stanične signalizacije,2870P) ,bax (1:1000, Abcam, ab32503), cijepana kaspaza-3(1:1000, tehnologija stanične signalizacije, 9664 T), kolagen I (1:1000, afinitet, AF7001), gliceraldehid-3- fosfat dehidrogenaze (GAPDH, usluga, GB12002), s naknadnom vizualizacijom pomoću HRP-obilježenih sekundarnih protutijela (usluga, G1213 i G1214) i reagensima za detekciju kemiluminiscencije. Slike mrlja su konačno analizirane i kvantificirane softverom Image J.

Kultura H9c2 kardiomiocita i zbrinjavanje in vitro Kardiomiociti H9c2 dobiveni iz ventrikularnog srca štakora, koji su kupljeni od American Type Culture Collection (CRL-1446), uzgojeni su kako bi se dodatno potvrdili učinci Pinoa in vitro. Kardiomiociti H9c2 uzgajani su u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM)/F12 mediju koji je sadržavao 10 posto fetalnog goveđeg seruma (Sijiqing, Hangzhou, Kina) na temperaturi od 37 stupnjeva i atmosferi od 95 posto zraka i 5 posto CO. Stanice nasađene su u 6-pločice s jažicama nakon što su narasle do 90 posto, osim toga, serumski medij koji sadrži 25 uM izoprenalina (ISO) naknadno je zamijenjen normalnim medijem u 3 jažice kako bi se stanice inkubirale 48 h da oponašaju HF stanje od HF također karakterizira prekomjerna aktivacija simpatičkog tonusa i stimulacija -adrenergičkih receptora stvara ROS (Velusamy et al. 2020). Zatim su stanice podijeljene u 6 skupina: (i) kontrolna skupina; (ii) kontrolni medij kojem je dodano 25 µM Pino tijekom 4 sata （kontrolna plus Pino skupina）; （i） kontrolni medij koinkubiran s 25 μM Pino i 5 μM ML385 tijekom 4 h (inhibitor Nrf2; MCE, New Jersey, SAD) (kontrola plus Pino plus ML385 grupa); (iv)ISO ​​grupa; v. ISO medij s 4-h inkubacije s 25 μM Pino （ISO plus Pino grupa）; vi. ISO plus 25 μM Pino plus 5 μM ML385 grupa. Koncentracija i vrijeme inkubacije lijekova odnosi se na prethodne studije ili upute (Jin et al. 2015; Oliveira et al. 2017).

Kultura srčanih miofibroblasta neonatalnog štakora i analiza proliferacije

Neonatalni srčani miofibroblasti štakora (CMF) uzgajani su kako bi se istražili učinci Pinoa na izlučivanje kolagena. CMF su razdvojeni korištenjem neonatalnih štakora starih 3 dana, pozivajući se na prethodno pokazane metode (Cui et al. 2021). Izolirana i samljevena srca probavljena su s 0.125 posto tripsina nakon čega je slijedio koktel koji je sadržavao 0.25 posto tripsina i 0,08 posto kolagenaze nekoliko puta, uz centrifugiranje i transplantaciju u petrijevu zdjelicu koja je naknadno izvedena da se prikupe stanica iz supernatanta. Zatim je medij zamijenjen serumskim medijem sličnim onom korištenom za kulturu H9c2 kardiomiocita nakon adhezije od 90 minuta. CMF-ovi su bili identično uklonjeni kao oni na H9c2 kardiomiocitima. Također smo implementirali test kompleta za brojanje stanica-8(CCK-8) (Dojindo, Japan) za otkrivanje proliferacije CMF-a kada se postigne gustoća od 1,5 × 10 stupnjeva u svakoj jažici, korištenjem čitača mikropločica na valne duljine od 450 nm, gdje je viša vrijednost označavala povećanu aktivnost proliferacije.

otkrivanje ROS-a

Sposobnost Pinoa da čisti ROS izmjerena je fluorescentnom sondom dihidroetidijem (DHE; Beyotime, Šangaj, Kina). DHL, koji je otopljen u DMSO, razrijeđen je do 5 µM za zamrznute dijelove ili je dodan u serumski medij da se razrijedi do iste koncentracije u skladu s uputama. Srca fiksirana paraformaldehidom zamrznuta su nakon čega su izrezana na dijelove do 4- μm. Odsječci ili H9c2 kardiomiociti su inkubirani s otopinom DHE 30 minuta na temperaturi od 37 stupnjeva, snimljeni nakon toga invertnim fluorescentnim mikroskopom (IX70; Olympus, Tokyo, Japan). Ukratko, jezgra koja je bila ispunjena DNA i RNA bila je obojena izrazito crvenom bojom zbog afiniteta između nukleinske kiseline i DHE. Osim toga, jači intenzitet fluorescencije ukazuje na veće nakupljanje ROS-a.

Biokemijske pretrage

Provedena su biokemijska ispitivanja kako bi se ispitale promjene serumskog BNP-a, SOD-a i malondialdehida (MDA) u serumu i staničnom supernatantu koji su ukazivali na fenotip HF-a i obranu od oksidansa. Koncentracija je mjerena korištenjem odgovarajućih kompleta za biokemijske testove prema uputama proizvođača (Jiancheng, Nanjing, Kina).

Ovaj je članak izvađen iz Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7