Fotoosjetljivi nanosklopovi prolijekova koji nose funkciju kemoterapeutskog mirovanja pojačavaju imunoterapiju raka

Sažetak

Imunoterapija u kombinaciji s učinkovitim terapijskim lijekovima kao što su kemoterapija i fotodinamička terapija uspješna je strategija za aktiviranje protutumorskih imunoloških odgovora za poboljšano liječenje raka. Međutim, razvoj multifunkcionalnih biorazgradivih, biokompatibilnih, niskotoksičnih, ali visoko učinkovitih i klinički dostupnih transformiranih nano-imunostimulansa ostaje izazov i velika je potražnja. Ovdje izvješćujemo i dizajniramo novi foto-kemoterapijski nano-prolijek COS-BA/Ce6 NP bez nosača kombinirajući tri višenamjenske komponente, samo-sastavljenu prirodnu malu molekulu betulinske kiseline (BA), hitozan oligosaharid (COS) topiv u vodi, i nisko toksični fotosenzibilizator klor e6 (Ce6) za povećanje antitumorske učinkovitosti imunološke adjuvantne imunoterapije raka posredovane anti-PD-L1-. Pokazujemo da su dizajnirani nanolijekovi imali pametnu i prepoznatljivu karakteristiku "mirovanja" u kemoterapijskom učinku sa željenom nižom citotoksičnošću i višestrukim povoljnim terapeutskim svojstvima uključujući poboljšanu 1 O2 generaciju izazvanu smanjenim energetskim jazom Ce6, pH-odziv, dobru biorazgradivost i biokompatibilnost, osiguravajući visoko učinkovitu, sinergističku fotokemoterapiju. Štoviše, u kombinaciji s anti-PD-L1 terapijom, i kemoterapija temeljena na nano-sastavljanju i kemoterapija/fotodinamička terapija (PDT) mogu učinkovito aktivirati antitumorsku imunost pri liječenju primarnih ili udaljenih tumora, otvarajući potencijalno atraktivne mogućnosti za kliničku imunoterapiju.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

KLJUČNE RIJEČI

Imunoterapija raka; Nano-imunostimulansi; Kemoterapijsko mirovanje; Pro-lijek; Samomontaža; Prirodna mala molekula; Betulinska kiselina; Fotodinamička terapija

1. Uvod

Imunoterapija raka, kao što je strategija blokade imunološke kontrolne točke koja koristi PD-L1 ili CTLA-4 za borbu protiv raka aktiviranjem imunološkog sustava domaćina, nedvojbeno je revolucionarizirala liječenje raka1,2. Nažalost, slab imunološki odgovor i neučinkoviti terapeutski učinci uvelike su ograničili njegove kliničke izglede3,4. Nedavno su aktualne studije otkrile da kombinacija imunoterapije s drugim modalitetima kao što su kemoterapija5, fotodinamička terapija (PDT)6, fototermalna terapija (PTT)7 i radioterapija8, može učinkovito potaknuti antitumorsku imunogenost inducirajući stanice raka da budu podvrgnute imunogenoj staničnoj smrti ( ICD)9, što sugerira potencijal imunološke modulacije za aktiviranje protutumorskih imunoloških odgovora. Brojni inovativni dizajni nanomaterijala koji se temelje na ovim sinergističkim kombinacijama strategija imunoterapije postigli su značajno poboljšano djelovanje protiv raka uključujući anorganske10, polimerne11 i biomimetičke12 nanočestice (NP). Međutim, razvoj višenamjenskih biorazgradivih, biokompatibilnih, niskotoksičnih, ali visoko učinkovitih i klinički dostupnih transformiranih nano-imunostimulansa ostaje veliki izazov i velika potražnja. Prirodni biološki materijali poput nukleinskih kiselina13, proteina12, peptida14,15 i malih molekularnih prirodnih proizvoda16,17 zbog svojih inherentnih prednosti (npr. biokompatibilnost, netoksičnost) privukli su značajan istraživački interes za medicinske primjene. Pogotovo posljednjih godina, sukcesivno su otkrivane antikancerogene bioaktivne terpenoidne prirodne male molekule (NSM) koje posjeduju funkciju samosastavljanja18,19. Na primjer, betulinska kiselina (BA), ergosterol (ET) i abijetinska kiselina (AA) mogu se sami okupiti u mikronske ili nanostrukturirane čestice. Ovi NSM-ovi su atraktivni građevni blokovi za korištenje u razvoju antitumorskih sredstava za sinergističku kemoterapiju i PDT. Dokazano je da pokazuju značajne prednosti jednostavne nano-proizvodnje, bolje biokompatibilnosti i biorazgradljivosti, manje toksičnosti sa smanjenim oštećenjem jetre i visokog sinergizma u antitumorskoj terapiji20e23. Ovo pruža obećavajuće alternative za razvoj klinički dostupnih prevodivih nano-imunostimulansa za sinergističku imunoterapiju. Međutim, općenito jača lipofilnost ovih NSM-ova dovela je do neučinkovite stanične endocitoze, što je oslabilo njihovu antikancerogenu aktivnost i ograničilo njihovu kliničku vrijednost za liječenje raka24. Slično uobičajenim nanokompozitima, odgovarajuće nano-formulacije NSM-a pospješile su staničnu apsorpciju kako bi se poboljšali kemoterapijski učinci, ali su također nenamjerno povećale rizik od nespecifične citotoksičnosti za normalne stanice22. Stoga je vrijedno dubokog razmišljanja o tome kako maksimalizirati učinkovitost terpenoidnih NSM nano-agensa protiv raka dok se njihova toksičnost za normalno tkivo svede na najmanju moguću mjeru kao o ključnom pitanju u procesu sinergističke imunoterapije.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Strategije pro-lijekova opsežno su se primjenjivale kako bi se poboljšao stanički unos lipofilnih malih molekula povećanjem hidrofilnosti25. Općenito, amfifilni lijekovi imaju veću učinkovitost stanične apsorpcije od hidrofilnih ili lipofilnih lijekova26. Što je veća stanična fagocitoza, to je bolja terapijska učinkovitost24. Stoga bi razvoj amfifilnih terpenoidnih NSM molekula predlijekova mogao biti potencijalna metoda za maksimiziranje njihovih terapijskih učinaka. Osim toga, nanolijekovi koji reagiraju na podražaje na specifično tumorsko mikrookruženje (npr. reakcija na kiselinu, redoks) imaju veliko obećanje za kontrolu otpuštanja lijeka, što je korisno u suzbijanju citotoksičnosti kemoterapijskih lijekova27,28. U međuvremenu, supramolekularno spajanje (npr. pristup ponovnog taloženja) bila je učinkovita strategija za pripremu visoko topljivih u vodi nanolijekova bez nosača 22, 29, za koje se može očekivati ​​da donekle donekle smanje učinkovitost fagocitoze amfifilnih NSM-ova, čime se smanjuje njihov pre- dizajnirana citotoksičnost. Pretpostavljamo da su potpuno hidrofilni nanolijekovi koji reagiraju na podražaje dalje uspostavljeni na temelju amfifilnih NSM-ova kao predlijeka i da mogu učinkovito suzbiti njegovu nespecifičnu citotoksičnost za normalne stanice, istovremeno stimulirajući otpuštanje visoko toksičnih amfifilnih NSM-ova u tumorske stanice, olakšavajući njihovo mirovanje u normalnim tkivima i aktivacija na mjestu tumora. Važno je odabrati odgovarajući prekursor topiv u vodi i koji reagira na podražaje za modificiranje terpenoidnih NSM-ova za pripremu amfifilnih molekula prolijekova. Godinama, oligosaharidi kitozana (COS), kao razgrađeni produkti kitozana, ne samo da imaju dobru topljivost u vodi i obilne eOH oreNH2 skupine koje dovode do dobrog pH odgovora, već također imaju korisne antitumorske aktivnosti pojačavanjem imunološke funkcije domaćina kroz regulaciju aktivnosti imunoloških stanica kao što su monocitni makrofagi i limfociti30,31. Oni jamče veliku mogućnost konstruiranja ciljanih nano imunostimulansa koji reagiraju na podražaje za sinergističku imunoterapiju.

Ovdje, na temelju gornjih razmatranja, u našem eksperimentalnom dizajnu, pentaciklički triterpenski NSMs betulinske kiseline (BA) koristi se kao snažno sredstvo protiv raka32, COS je uveden za sintetiziranje amfifilne COS-BA molekule za poboljšanje kemoterapeutskog učinka. Klorin e6 (Ce6), naširoko korišteni fotosenzibilizator s vrlo niskom/bez toksičnosti po tami33, upotrijebljen je za konstruiranje potpuno topljivog u vodi fotoosjetljivog prolijeka COS-BA/Ce6 NP-a bez nosača korištenjem strategije izravnog zajedničkog sastavljanja. COS-BA/Ce6 NP kombiniraju dva terapijska modaliteta, kemoterapiju i fotodinamičku terapiju (PDT), koji mogu učinkovito povećati prezentaciju antigena izvedenih iz tumora T stanicama, generirajući snažne imunološke odgovore uz pomoć imunološkog adjuvansa anti-PD-L1 izazvati visoko učinkovitu i sinergističku antitumorsku kemoterapiju/PDT/imunoterapiju (Shema 1). Projektirani COS-BA/Ce6 NP-ovi pokazali su pametnu funkciju mirovanja s podmuklim učincima kemoterapije, tj. neozračeni ko-sastavljeni NP-ovi pokazali su značajno inhibiranu in vitro citotoksičnost u usporedbi s amfifilnim COS-BA, bilo protiv raka ili normalnih stanica. Pripisujući posebnom ponašanju koje reagira na pH, ima nisku toksičnost i biosigurnost za normalno tkivo in vivo, ali je visoko toksičan za tumorsko tkivo zbog stimulirajućeg otpuštanja hiperaktivnog COS-BA u slabo kiselom tumorskom mikrookruženju34. Prema našim najboljim saznanjima, trenutno se još uvijek rijetko izvještava o dizajniranim nano lijekovima koji nose ovu kemoterapeutsku funkciju mirovanja. U međuvremenu, nanolijek ima višestruke povoljne terapijske značajke kao što je poboljšana 1 O2 generacija smanjenjem energetskog jaza (DEST) Ce6, brzi biološki metabolizam i poboljšana akumulacija tumora, što je dovelo do učinkovite i sigurne antitumorske kombinacije kemoterapije i PDT liječenja. Što je još važnije, i kemoterapija temeljena na NP i sustavi kemoterapije/PDT mogli bi učinkovito aktivirati antitumorsku imunost olakšavanjem proliferacije CD8þ T stanica koje proizvode TNF-a i IFN-g u primarnim ili udaljenim tumorima. Naš predloženi biorazgradivi, biokompatibilni, jedinstveno neaktivan, biosiguran i visoko učinkovit foto-kemoterapijski nano-lijek postiže značajne sistemske imunološke terapijske odgovore, otvarajući atraktivne mogućnosti za kliničku primjenu u liječenju terapije udaljenog ili metastatskog raka.

Shema 1 PDT i kemoterapija skupljenih COS-BA/Ce6 NP potencirali su anti-PD-L1 za induciranje sistemske antitumorske imunoterapije. Uvođenje COS-a topljivog u vodi može učinkovito pojačati kemoterapijsku aktivnost BA (prikazanog kao polumač), što rezultira hiperaktivnim COS-BA amfifilnim predlijekom (dugi mač). Kada su zajedno sklopljeni s fotosenzibilizatorom Ce6 (korica), nano-sklopovi sa strukturom ljuske i pH-osjetljivi imali su pametnu i prepoznatljivu funkciju "mirovanja" sa inhibiranom kemoterapijskom toksičnošću za normalna tkiva. Ali, nakon što je stigao i bio stimuliran kiselim (Hþ) mikrookruženjem tumora, visoko aktivni amfifilni predlijek COS-BA bit će oslobođen što će rezultirati značajnom kemoterapijom. Osim toga, konstruirani kosklopovi pokazali su izvrsnu PDT aktivnost s pojačanim stvaranjem singletnog kisika ( 1 O2) izazvanog smanjenim energetskim jazom između singletnog i tripletnog pobuđenog stanja (DEST) Ce6. U kombinaciji s blokadom kontrolne točke protiv PD-L1, otpuštanje antigena povezanih s tumorom nakon kemoterapije/PDT liječenja može učinkovito aktivirati sistemski antitumorski imunološki odgovor za imunoterapiju udaljenog raka.

2. Materijali i metode

2.1. Sinteza COS-BA

Betulinska kiselina (40 mg, 0.1 mmol), EDC (38 mg, 0.2 mmol) i NHS (17 mg, 0.15 mmol ) otopljeni su u 3 mL N,N-dimetilformamida (DMF). Nakon miješanja na sobnoj temperaturi 30 min, 96 mg COS vodene otopine (1 mL) lagano je dodano kap po kap u smjesu i miješano 24 h. Zatim je reakcijska smjesa razrijeđena s CH2C12 i više puta ekstrahirana. CH2Cl2 sloj je uparen i pročišćen na stupcu silikagela. Nereagirani BA je prvo uklonjen korištenjem petrolej etera: acetona (5:1, v/v) kao eluensa, a zatim promijenjen na 3:1 da se dobije bijeli COS-BA (prinos: 42%), gdje je COS identificiran kao dimer ( n Z 2). 'H NMR (40{{70}} MHz, CDC13) d: 8,98 (1H, s, BA-28 O] CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H-30). 13C NMR (100 MHz, CDC13) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 , 69.32, 69.22, 65.25, 58.14, 55.62, 55.21, 53.65, 53.22, 50.52, 45.96, 44.32,44.11, 41.85, 40.59, 38.68, 38.55, 37.32, 37. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M-6H] (C44H72N2O12).

2.2. Priprema COS-BA/Ce6 NP

Zajednički sastavljeni COS-BA/Ce6 NP-ovi pripremljeni su metodom ponovnog taloženja u jednom koraku. Obično se prvo pomiješa 5 mL Ce6 (33 mmol/L) i 40 mL COS-BA (33 mmol/L) DMSO otopina. Nakon toga, smjesa je brzo ubrizgana u 1 mL vode koja je sadržavala 10 mL NaOH (50 mmol/L) pod ultrazvučnom obradom (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, Kina). Nakon sonikacije tijekom 10 minuta, COS-BA/Ce6 NP su dobiveni centrifugiranjem na 13,000 okretaja u minuti (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, Kina) tijekom 25 minuta. Ostale formulacije s različitim omjerima COS-BA prema Ce6 pripremljene su istim postupkom s konstantnim molarnim omjerom NaOH prema Ce6 od 3:1.

2.3. Stanične linije

Ljudske MCF-7, HepG2, LO2 i mišje 4T1, L929 stanične linije osigurava Institut za biokemiju i staničnu biologiju, SIBS, CAS (Kina). MCF-7, HepG2 i LO2 uzgajani su u DMEM mediju s 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Gibco) i 1% penicilin-streptomicin antibiotika (Life Technology, SAD) na 37 C. 4T1 i L929 uzgajani su u RMPI-1640 medij s istim omjerom kao gore.

2.4. Studije staničnog unosa i endocitnih puteva

Za istraživanje staničnog unosa, 4T1 ili LO2 stanice su inkubirane sa slobodnim Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP (ekvivalentna koncentracija Ce6: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL, BA: 10 .8 mg/mL) za različita vremena. Nakon ispiranja, fiksiranja i DIPA (#D9542, Sigma) bojenja, stanice su snimljene pod fluorescentnim invertnim mikroskopom (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, Kina). Intenzitet fluorescencije određen je protočnom citometrijom pomoću Guava EasyCyte mini sustava (Merck Millipore, Njemačka). Za kvantifikaciju učinkovitosti unosa, stanično nakupljanje BA i COS-BA mjereno je pomoću HPLC (Agilent 1200, SAD). Obično su 4T1 stanice tretirane slobodnim COS-BA ili BA (ekvivalent BA: 25 mg/mL) 0,5 i 3 sata. Nakon ispiranja s PBS-om, stanične pelete su sakupljene i podvrgnute ultrazvučnoj homogenizaciji (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, Kina) za lizu stanica. Zatim je COS-BA ili BA ekstrahiran kloroformom za HPLC analizu nakon liofilizacije uzoraka. Mobilna faza bila je voda (0,2% fosforna kiselina) i acetonitril pri brzini protoka od 1,0 mL/min, a odgovarajući omjeri volumena bili su 60:40 i 15:85 (v/v) za analizu COS-BA i BA, redom . Valna duljina detekcije bila je 213 nm. Za ispitivanje endocitnih puteva COS-BA/Ce6 NP, 4T1 stanice su posađene u 6-pločice s jažicama i inkubirane 24 sata prije prethodnog tretmana s različitim inhibitorima endocitoze tijekom 30 minuta, uključujući inhibitor mikropinocitoze [50 mmol/L , etil izopropil amilorid (EIPA) (#N132356, Aladdin)], inhibitor endocitoze posredovan klatrinom [20 mmol/L, klorpromazin (#C7010, Solarbio)], inhibitor endocitoze posredovan kaveolama [25 mmol/L, nistatin ( #IN0260, Solarbio)], i inhibitor acidifikacije lizosoma [50 mmol/L, klorokin fosfat (#C9720, Solarbio)]35. Zatim su stanice dalje uzgajane s 2 mL COS-BA/Ce6 NP (Ce6: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL) 2 sata i snimljene pod FIM (UP Optotech). Stanice inkubirane bez endocitnog inhibitora na 37 C postavljene su kao kontrola i na inkubaciju na niskoj temperaturi (4 C) za procjenu endocitoze ovisne o energiji. U međuvremenu, srednji intenzitet fluorescencije stanica također je određen protočnom citometrijom.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Ispitivanje citotoksičnosti

4T1 stanice su nasađene u 96-pločicu s jažicama. Zatim su stanice tretirane različitim koncentracijama COS-BA NP tijekom 24 sata. Nakon toga, 10 mL MTT (#M158055, Aladdin) boje (5 mg/mL) dodano je u jažicu i inkubirano dodatnih 4 h, a zatim je dodano 150 mL DMSO da se otope kristali formazana . Apsorpcija svake jažice na 492 nm zabilježena je čitačem mikropločica. Za skupinu ozračenu, stanice su tretirane lijekovima 4 h, zatim 10 min ozračene 675  10 nm svjetlom i inkubirane dodatnih 20 h. Citotoksičnost COS-BA/Ce6 NP (1 mg/mL Ce6 odgovara 11,5 mg/mL COS-BA i 6,4 mg/mL BA) protiv drugih stanica (MCF-7, HepG2, LO2 i L929) također su određeni istim MTT testom samo s drugim medijem. U međuvremenu je indeks kombinacije izračunat pomoću softvera CompuSyn 2.0 koristeći izračun teorema Chou Talalay36.

2.6. Modeli životinja

Svi eksperimentalni postupci provedeni su u skladu s protokolima koje je odobrio Odbor za brigu i korištenje životinja Harbin Medical University. 4T1 stanice su suspendirane u RMPI-1640 mediju i supkutano ubrizgane u desna leđa svake ženke BALB/c miša (18-22 g, 6-7 tjedana starosti).

2.7. In/ex vivo fluorescentna slika

200 mL COS-BA/Ce6 NPs 5% otopine glukoze (ekvivalent Ce6: 0,35 mg/mL, COS-BA: 4,02 mg/mL) ubrizgano je kroz repnu venu u miševe s tumorom. Nakon toga, fluorescentno oslikavanje mjesta tumora u unaprijed određenom vremenu provedeno je korištenjem AniView 100/600 višemodelnog in vivo sustava za oslikavanje životinja (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Kina) uz ekscitaciju na 630 nm. Nakon 24 sata nakon injekcije, glavni organi (srce, jetra, slezena, pluća i bubreg) i tumor prikupljeni su za ex vivo fluorescentno snimanje. Osim toga, procijenjene su i ex vivo fluorescentne slike tumora i glavnih organa u različitim vremenima nakon iv injekcija Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP.

2.8. In vivo kemoterapija/PDT

Miševi koji nose 4T1- (75e100 mm3 ) nasumično su podijeljeni u šest skupina (n Z 5): 1) 5% otopina glukoze; 2) Ce6; 3) Ce6 sa zračenjem; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, gdje BA: 22,3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6 NP; 6) COS-BA/Ce6 NP sa zračenjem. Za svaku skupinu, miševima je ubrizgano 200 mL COS-BA/Ce6 NP (ekvivalent Ce6: 3,5 mg/kg tijela) kroz repnu venu 0., 2. i 4. dana. Za skupine ozračene, nakon 4 sata nakon injekcije nakon svake primjene, svi miševi su anestezirani izofluranom, a mjesta tumora su ozračena 675  10 nm (150 mW/cm2) svjetlom tijekom 15 minuta. Volumeni tumora i tjelesne težine miševa također se bilježe svaki drugi dan. Volumeni tumora izračunavaju se po formuli: VZ širina2 dužina/2. Nakon 14 dana tretmana, tumori su izrezani i izmjereni kako bi se izračunao omjer inhibicije tumora (TIR) ​​prema uobičajeno korištenoj jednadžbi: TIRZ (1 uzorak/kontrola) 100%. Gdje su uzorak i kontrola bili prosječna težina tumora svake tretirane skupine odnosno skupine s 5% vodenom otopinom glukoze.

2.9. In vivo kemoterapija/PDT/imunoterapija

Kako bi se pokazao potencijal COS-BA/Ce6 NP u kombinaciji s imunoterapijom, bilateralni model tumora dizajniran je supkutanom injekcijom 4T1 stanica u lijevi i desni bok. Kad su se tumori približili 75e100 mm3, miševi su podijeljeni u pet skupina. (1) Kontrola; (2) COS-BA/ Ce6 NP (COS-BA Z 40,2 mg/kg, gdje BA Z 22,3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ svjetlost; (4) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PD-L1 þ svjetlost. Na dan 0, 200 mL 5% otopine glukoze (skupina 1) ili COS-BA/Ce6 NPs (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (skupina 2, 3, 4, 5) je intravenski ubrizgano u miševe. Nakon 4 sata nakon injekcije, desni tumori Grupe 3 i 4 ozračeni su 15 minuta. Miševi su anestezirani izofluranom i okrenuti na jednu stranu kako bi se izbjeglo izlaganje lijevih tumora. Zatim je anti-PD-L1 antitijelo (BioXcell, broj proizvoda: BE0101, broj klona: 10F.9G2) injicirano miševima za skupine 4 i 5 dana 2, 4 i 6 (15 mg po mišu po injekciji). Duljina i širina svakog tumora praćeni su svaki drugi dan. Nakon 14 dana liječenja, skupljen je krvni serum miševa za procjenu interferona-gama (IFN-g) (#KMC4021) i faktora nekroze tumora (TNF-a) (#BMS607-3) pomoću ELISA testa (eBioscience ). Tumori su sakupljeni, disocirani, tretirani puferom za lizu crvenih krvnih stanica i isprani s PBS centrifugiranjem. Zatim je stanična suspenzija obojena s anti-CD3-FITC (#MA1-10187, klon 145-2C11, eBioscience) i anti-CD8a-PE (#12-0081-85, klon 53-6.7, eBioscience). Nakon toga, infiltracija citotoksičnih T limfocita (CTL) u desni i lijevi tumor nakon različitih tretmana procijenjena je protočnom citometrijom.

3. Rezultati i rasprava

3.1. Sinteza, proizvodnja i karakterizacija COS-BA/ Ce6 NP

U ovoj studiji dizajnirali smo novu malu molekulu prolijeka COS-BA koja se temelji na oligosaharidu kitozana (COS) topljivom u vodi, koji može povećati kemoterapeutsku aktivnost pentacikličke triterpenske betulinske kiseline (BA) poboljšanjem unosa u stanicu povećanjem hidrofilnosti. COS (stupanj polimerizacije, DP: 2e6) koji se ovdje koristi pripremljen je našom prethodno opisanom metodom30. Zatim je COS-BA sintetiziran reakcijom kondenzacije dehidratacije. U kombinaciji s analizom glavne komponente COS-a, smatralo se da je kemijska struktura COS-BA disaharid (DP:2) modificirana BA (popratne informacije, slika S1), što je potvrđeno 1H NMR, 13C NMR i ESIeMS (Popratne informacije, slike S2eS4). Analiza reprezentativnog 1H NMR pokazala je jasan protonski signal COS oko 2,64-3,93 ppm i C]CH2 vršne vrijednosti (4,60, 4,73 ppm) BA, pokazujući uspješnu sintezu COS-BA (Slika 1A). Za pripremu spojenog sinergističkog antitumorskog reagensa COS-BA/Ce6 NPs, korišten je svestrani pristup ponovnog taloženja u suradnji s visoko učinkovitim fotosenzibilizatorom Ce6. Promjenom početnih molarnih omjera, obje formulacije COS-BA/Ce6 su-sklopa mogle bi oblikovati sferne nanostrukture moduliranih veličina (Slika 1B i popratne informacije Slika S5). Preko različitih ulaznih omjera COS-BA/Ce6, hidrofilni promjeri COS-BA/Ce6 NP bili su blizu 200e300 nm s negativnim z-potencijalom. S obzirom da su NP pripremljeni u formulaciji 8:1 pokazivali niži indeks polidisperznosti (PDI, 0,143) uz relativno manju veličinu (249 nm), za kombinatorno liječenje također je bila potrebna dovoljna količina kemoterapeutika COS-BA. Stoga smo za sljedeću studiju odabrali formulacije COS-BA/Ce6 (8:1). Pod ovom optimizacijom, COS-BA/Ce6 NP-ovi su pokazali usku distribuciju veličine (Slika 1C) i dobru topljivost u vodi, što ukazuje na njihovu koloidnu prirodu (Slika 1D). Kako bi se istražili razlozi koji stoje iza ovog uspješnog skupljanja, primarno ponašanje slobodnog COS-BA pri samosklapanju istraženo je pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM) (Sl. 1E), što je sugeriralo da bi COS-BA mogao formirati vrlo uniforman nano- sfera od w168 nm, što implicira da kemijska modifikacija COS-a ne mijenja sposobnost samosastavljanja samog BA (popratne informacije, slika S6). To je svojstvo koje na kraju potiče uspješnu konstrukciju susklopova. Značajno, osim čvrste nanostrukture potvrđene transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM), COS-BA/Ce6 NP-ovi su pokazali jasnu strukturu ljuske bez COS-BA NP-ova, a prosječna debljina ljuske bila je približno 2,35 nm. Druga fizikalno-kemijska karakterizacija sažeta je na slici 1F. Osim toga, COS-BA/Ce6 NPs su pokazali negativan z-potencijal od 5,38 mV i hidrodinamičku veličinu od w249 nm, veću od one dobivene SEM-om (w182 nm). Istovremeno, učinkovitost punjenja Ce6 i inkapsulacije bila je 8,1 odnosno 96%, kako je određeno tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC). Također, FT-IR podaci (Sl. 1G) dodatno su potvrdili ovo zajedničko okupljanje jer su COS-BA/Ce6 NP pokazivali karakteristične C]N, CeN i C]CH vrhove Ce6 koji se pojavljuju na 1633, 1078 i 633 cm 1 , odnosno.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

3.2. Sastavljeni mehanizam i formiranje strukture ljuske

Naknadno, kako bismo bolje razumjeli mehanizam zajedničkog sastavljanja, prvo smo istražili primarni proces formiranja NP-ova. Utvrdili smo da zajedničko spajanje COS-BA s Ce6 može biti spontano jer ove dvije vrste također mogu formirati sferičnu nanostrukturu čak i bez sonikacije (popratne informacije, slika S7), što može biti posljedica negativne Gibbsove promjene slobodne energije (DG ) u susklopovima37. Ovo spontano sklapanje također je sugeriralo jaču međumolekularnu interakciju između COS-BA i Ce6. Općenito, međumolekularne interakcije u supramolekularnim vlastitim (ili ko-) sklopovima su nekovalentno p‒p-slaganje, vodikove veze i van der Waalsove sile 38,39. Za ovu analizu, zatim smo istražili UV apsorpciju COS-BA/Ce6 NP (sl. 1H i F), što je sugeriralo crveni pomak Soret (410 nm) i Qy (667 nm) vrpci u usporedbi s slobodni Ce6 (405 odnosno 665 nm). U međuvremenu, također se može pronaći značajan crveni pomak karakteristične apsorpcije COS-BA, što ukazuje na moguće intermolekularno slaganje pp između COS-BA i Ce640. Štoviše, nakon inkubacije s površinski aktivnim sredstvom natrij dodecil sulfatom (SDS, 0,2% w/v) (popratne informacije, slika S8), COS-BA/Ce6 NP-ovi su pokazali Qy vrpcu pomaknutu u plavo na 641 nm i dramatično obnovili fluorescenciju, pokazujući da su hidrofobne interakcije također pridonijele zajedničkom sklapanju28. Budući da su te asocijativne nekovalentne interakcije, susklopovi pokazali izvanredno gašenje fluorescencije (98,2%) u vodi (slika 1I). Zajedno, razumno je vjerovati da p‒p slaganje i hidrofobne interakcije mogu biti glavne pokretačke snage za konstrukciju zajedničkih sklopova. Nakon toga, kako bismo intuitivnije vizualizirali proces sastavljanja i otkrili temeljne razloge zašto se mogu formirati NP-ovi sa strukturom ljuske, izveli smo simulacijski model pojednostavljene molekularne dinamike (MD) koji sadrži 16 optimiziranih COS-BA molekula i dodatne dvije Ce6 u vodenoj kutiji . U početku smo procijenili moguću interakciju/vezivanje samosklopova COS-BA unutar 5 ns vremena simulacije (Slika 2A i popratne informacije Slika S9). Otkrili smo da se, osim brojnih intramolekularnih vodikovih veza u COS frakciji, može uočiti i nekoliko parova intermolekularnih H-veza između COS-BA (Slika 2B i popratne informacije, Slika S10), što pokazuje da vodikova veza može biti jedna od glavnih pokretačkih snaga za formiranje COS-BA NP. Osobito je zanimljivo da u COS-BA samosklapanjima sve molekule COS-BA tvore naizgled simetričnu strukturu (slika 2C). Ovaj fascinantni fenomen motivirao nas je da istražimo mogući odnos između ovog svojstva i formiranja COSBA NP-ova sa strukturom ljuske. Zatim smo pokušali proširiti jedinice kutije. Iznenađujuće, povezane kutije koje se sastoje od molekula COS-BA raspoređene su na pravilan način što je rezultiralo "ortogonalnim" šupljim mrežnim strukturama (popratne informacije, slika S11). Što je još važnije, nasumično smo izračunali debljinu molekula ljuske i otkrili da su u skladu s TEM (w2,35 nm) (Sl. 2D). Ova tendencija formiranja šupljih mrežastih struktura može biti odgovorna za formiranje školjkasto strukturiranih NP-ova. Kako bi se testirala ova ideja, simulirana je MD struktura kosklopova COS-BA/Ce6 (Slika 2E i popratne informacije, Slika S12). Slično samosklopovima COS-BA, veliki broj intramolekulskih i međumolekularnih H-veza također je pronađen u kosklopovima (Slika 2F i popratne informacije Slika S13). Dodatno, moguće slaganje pp između C]C COS-BA i aromatskog prstena Ce6 primijećeno je u zajedničkim sklopovima (Sl. 2G), što je u skladu s podacima iz prethodnih UV istraživanja. Nakon povećanja broja kutija, još uvijek se mogu pronaći slične šuplje mrežne strukture, samo sa smanjenom pravilnošću i ortogonalnošću (popratne informacije, slika S14). Ovo bi mogao biti mogući razlog za neujednačenu morfologiju COS-BA/Ce6 NP u usporedbi s COSBA NP. Štoviše, udaljenost sloja molekularne ljuske također je blizu debljine ljuske (w2,35 nm) NP-a kao što se vidi pomoću TEM-a (slika 2H). Zajedno smo nagađali da se formiranje ljuskasto strukturiranih COS-BA/Ce6 NP-ova ili COS-BA NP-ova može u velikoj mjeri pripisati ovoj tendenciji molekula da se okupe u šuplje ljuskaste mrežne strukture.

Slika 1. Izrada i karakterizacija nano-sklopova COS-BA/Ce6 NP-ova posredovanih prolijekom modificiranim betulinskom kiselinom (COS-BA) kitozanom oligosaharidima. (A) Pojačani ključni položaji 1H NMR COS-BA. (B) Priprema ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP s različitim COS-BA/Ce6 omjerima. (C) Distribucija veličine COS-BA/Ce6 NP-a koristeći COS-BA i Ce6 (molarni omjer, 8:1) kao građevne blokove. (D) Topivost u vodi i Tyndallov učinak susklopova ukazuju na koloidnu prirodu. (E) SEM i TEM slike slobodnih COS-BA samosklopova i ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP. (F) Sažetak fizikalno-kemijskih svojstava COS-BA/Ce6 NP. (G) FT-IR spektri, (H) UV Vis spektri i (I) spektri emisije fluorescencije slobodnog Ce6, COS-BA i skupljenih COS-BA/Ce6 NP u vodi.

Slika 2. Strukture (A) COS-BA samoskupljenih i (E) ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP nakon simulacije molekularne dinamike (MD) tijekom 5 ns s molarnim omjerom strukturne jedinice od 8:1 (COS-BA /Ce6, izračunato na temelju učinkovitosti opterećenja Ce6). Linijski model korišten je za H2O, a štapni modeli predstavljaju COS-BA ili Ce6 molekule, gdje su C atomi Ce6 označeni ljubičastom bojom. Informacije o vodikovoj vezi između molekula COS-BA u (B) njihovim samosklopovima i (F) susklopovima COS-BA/Ce6 NP. (C) Očigledno simetrična struktura COS-BA molekularnog rasporeda nakon MD simulacije. (G) Moguće molekularne interakcije između COS-BA i Ce6 pokazuju potencijalno slaganje pp. Naznačena debljina molekula ljuske u "ortogonalnoj" šupljoj mrežnoj strukturi nakon proširenja odgovarajućih MD kutija (D) slobodnih samosklopova COSBA i (H) kosklopova COS-BA/Ce6 NP.

3.3. Energetski mehanizam pojačanog stvaranja 1 O2

Zatim smo dodatno ispitali stvaranje singletnog kisika (1 O2), jedne od kritičnih reaktivnih vrsta kisika (ROS) za izvedbu PDT-a koristeći DPBF (1,3-difenilizobenzofuran) kao probu. Nakon dugotrajnog zračenja mješavine otopina COS-BA/Ce6 NP s DPBF-om, UV apsorpcija DPBF-a smanjila se u intenzitetu, što ukazuje na stvaranje 1 O2 (Slika 3A). Nakon usporedbe s referencom metilen plavog (MB), F ( 1 O2) COS-BA/ Ce6 NP izračunat je kao 0.26, nešto više od slobodnog Ce6 (FZ0.19) (Slika 3B). Općenito, energija koju apsorbiraju fotosenzibilizatori proći će tri puta opuštanja koja uključuju fluorescenciju, učinak zagrijavanja putem vibracijskog opuštanja i stvaranje ROS-a kroz međusistemsko križanje (ISC)41. U skladu sa značajno prigušenom emisijom fluorescencije, COS-BA/Ce6 NP također nisu potaknuli nikakav učinak zagrijavanja u vodi (popratne informacije, slika S15), što je impliciralo poboljšani ISC proces nakon zajedničkog sastavljanja Ce6 s COS-BA, čime je vodeći do poboljšane 1 generacije O2. Kako bismo dodatno razjasnili molekularni mehanizam takvog učinka, pokušali smo optimizirati i izračunati mogući jednomolekulski model COS-BA/Ce6 koji se sastoji od potencijalnog slaganja pp dobivenog iz MD simulacije pomoću teorije funkcionala gustoće (DFT) (Slika 3C) . Nevjerojatno, COS-BA/Ce6 pokazao je uočljiv crveni pomak UV apsorpcije od 581,24 nm od apsorpcije slobodnog Ce6 (579,30 nm), što ukazuje na pojavu slaganja pp (slika 3D). Iako je energetski minimizirana geometrija COS-BA/Ce6 pokazala male strukturne razlike s unesenom MD konfiguracijom, i dalje je bilo vidljivo prepoznatljivo slaganje između C]C ili C]O veza COS-BA s porfinskim prstenom Ce6, dodatno potvrđujući da iznad p‒p moguće je slaganje. U međuvremenu, nedavno je pokazano da bi povećana učinkovitost doniranja elektrona p‒p slaganjem mogla olakšati ISC proces42, dok je ISC stopa (KISC) proporcionalna (1/DEST) 2,43. To jest, niži energetski jaz (DEST) fotosenzibilizatora poboljšat će ISC proces promičući učinkovito stvaranje ROS-a. Zatim izračunavamo najniže pobuđeno singletno stanje (S1) i tripletno stanje (T1) Ce6 i COS-BA/Ce6 (slika 3E). Rezultati su pokazali da je COS-BA/Ce6 pokazao smanjeni DEST od 1,1892 eV u usporedbi sa slobodnim Ce6 (1,2001 eV), potvrđujući poboljšani ISC proces. Smanjenje DEST-a korisno je za proizvodnju 1 O2, što je također potvrđeno u drugim nanofotosenzibilizatorima44. Uzevši zajedno, čini se da p-slaganje smanjuje DEST Ce6 nakon ko-montaže s COS-BA, što dovodi do poboljšane 1 generacije O2.

Slika 3 Energetski mehanizam poboljšane 1 generacije O2 induciran NP-ima COS-BA/Ce6. (A) UV Vis spektri fotorazgradnje 1,3-difenilizobenzofurana (DPBF) nakon produljenog zračenja COS-BA/Ce6 NP. (B) U dijagramima prvog reda promjena UV apsorpcije DPBF-a (DOD), prinos 1 O2 procijenjen je korištenjem metilen plavog (MB) (FZ 0.52) u DMSO kao referentnog spoja. (C) Strukture smanjene energije mogućeg jednomolekulskog COS-BA/Ce6 modela gledanog sa strane i sprijeda, koji je dobiven prema početnoj molekularnoj konfiguraciji između Ce6 i COS-BA nakon MD simulacije i slijedećih DFT izračuna. (D) Predviđeni UV Vis apsorpcijski spektri prijelaza (okomite trake) slobodnog Ce6 i optimizirani COS-BA/Ce6 model. (E) Izračunate razine energije njihovog najnižeg pobuđenog singletnog stanja (S1) odnosno najnižeg tripletnog stanja (T1), [Gaussov 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Gdje je DEST izračunat kao ES1 ET1.

3.4. Karakteristike mirovanja kemoterapije

Nakon toga, kako bismo potvrdili koncept dizajna u ovoj studiji da bi razvoj amfifilne molekule COS-BA mogao učinkovito povećati terapeutski učinak BA poboljšanjem unosa stanice kroz povećanje hidrofilnosti, au međuvremenu daljnjom konstruiranjem potpuno hidrofilnog COS-BA/Ce6 koji reagira na podražaje NP su olakšali njegovo mirovanje u normalnim tkivima i aktivaciju na mjestima tumora. Kako bismo testirali ovu hipotezu, prvo smo istražili ponašanje otpuštanja lijeka COS-BA/Ce6 NP u različitim puferskim otopinama (slika 4A). Rezultati su pokazali da COS-BA/Ce6 NP pokazuju pH-odgovorno ponašanje s kumulativnim otpuštanjem Ce6 od 88% pri pH 5,6 odnosno 57% pri pH 7,4 nakon 24 sata. Ovo je svojstvo vjerojatno proizašlo iz razaranja brojnih vodikovih veza koje su postojale u COS-BA/Ce6 NP nakon uvođenja kiselog Hþ45, što je dovelo do povećanog oslobađanja Ce6 (slika 4B). To je dodatno potvrđeno rastavljanjem COS-BA/Ce6 NP-a nakon izravne inkubacije u kiselim sredinama (slika 4C). Ova osobina koja reagira na pH može biti korisna za učinkovitu antitumorsku terapiju zbog slabo kiselog mikrookruženja tumora34. U međuvremenu, COS-BA/Ce6 NP imali su bolju stabilnost jer se nisu mogle uočiti značajne promjene veličine ili PDI nakon inkubacije u PBS i 1640-RMPI mediju stanične kulture tijekom 10 dana (popratne informacije, slika S16), što bi bilo važno za njihovu potencijalnu upotrebu za daljnje biomedicinske primjene. Nakon toga su provedena daljnja ispitivanja procjenom citotoksičnosti slobodnog lipofilnog BA (kontaktni kut q: 133,3 ) i amfifilnog COS-BA (q: 52 ) (Slika 4D) standardnim testovima metil tiazolil-difenil tetrazolij bromida (MTT). Kao što je predviđeno, bilo za 4T1 stanice raka ili normalne LO2 hepatocite, pojedinačni COS u biti nema antikancerogeno djelovanje pri relativno niskim dozama. To bi moglo biti zbog antiproliferacijskih učinaka COS-a koji se aktivira putem induciranja NF-kB signalnog puta samo pri visokim koncentracijama (približno na razini miligrama)30. Dok COS-BA ima izrazito povećanu citotoksičnost s iznimno niskim vrijednostima IC50 (6,03 mg/mL za 4T1 i 9,92 mg/mL za LO2) u usporedbi s onima BA (17,63 mg/mL za 4T1 i 20,53 mg/mL za LO2) čak i pri istim masenim koncentracijama (sl. 4E i J). Dobiveni rezultati impliciraju da modifikacija COS-a topljivog u vodi uvelike povećava učinkovitost staničnog unosa lipofilnog BA, što dovodi do snažnog antikancerogenog djelovanja COS-BA. Kako bi se kvantificirala učinkovitost unosa, nakupljanje BA ili COS-BA unutar 4T1 stanica izravno je određeno HPLC-om (popratne informacije, slika S17). Rezultati su jasno potvrdili da amfifilni COS-BA pokazuje značajno veći unos od slobodnog BA (približno 3.6-puta nakon 3 h inkubacije), pokazujući pojačanu kemoterapeutsku aktivnost COS-BA. Gore navedeni zaključak dodatno je poduprla značajno poboljšana citotoksičnost amfifilne COSBA protiv stanica raka HepG2 i MCF-7 (popratne informacije, slika S18), koje su u skladu s konceptom dizajna. Nakon ko-montaže s Ce6, otkrili smo da COS-BA/Ce6 NP bez zračenja pokazuju značajno inhibiranu citotoksičnost protiv 4T1 stanica raka u usporedbi s ekvivalentom COS-BA, posebno pri 11,5 mg/mL, ali osnovna aktivnost PDT nije bila pogođena ( Slika 4F). Kako bismo potpunije potvrdili ovaj fenomen, dodatno smo istražili in vitro citotoksičnost COS-BA/Ce6 NP-a protiv drugih stanica raka, uključujući MCF-7 i HepG2. Zanimljivo je da je amfifilni COS-BA pokazao vrlo jaču citotoksičnost protiv MCF-7 stanica (Slika 4G), ali se kemoterapijska aktivnost značajno smanjila nakon zajedničkog spajanja s Ce6, tj. neozračenim COS-BA/Ce6 NP. Slični rezultati također su primijećeni u HepG2 stanicama samo s blagim smanjenjem (slika 4H). Kako bismo dodatno podržali gornje zaključke, također smo procijenili kemoterapijske učinke nano-sklopova i COS-BA protiv normalnih mišjih fibroblastnih L929 stanica i ljudskih LO2 hepatocita (Slika 4I). Rezultati su pokazali da su sastavljeni COS-BA/Ce6 NP značajno smanjili izvorni visoko toksični amfifilni lijek COS-BA, pokazujući izvrsnu biokompatibilnost. Analizirajući citotoksičnost, vrijednosti IC50 amfifilnog COS-BA bile su značajno niže od vrijednosti ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP bez obzira na rak ili normalne stanice (slika 4J). Drugim riječima, konstruiranje potpuno hidrofilnih nano sklopova koji reagiraju na podražaje može unaprijed učinkovito suzbiti visoku citotoksičnost amfifilnog lijeka COS-BA. Uzimajući u obzir karakterističnu osobinu koja reagira na pH, čini se da će COS-BA/Ce6 NP biti uspavane u normalnim tkivima sa željenom niskom toksičnošću kemoterapije, ali aktivne u tkivima tumora zahvaljujući njihovom stimulirajućem oslobađanju visoko toksičnog COS-BA u slabo kiselom tumoru. mikrookruženje. Uzeti zajedno, za razliku od naširoko prijavljene neofunkcionalizacije kemoterapijskih reagensa koji imaju pojačanu antikancerogenu aktivnost22,23, amfifilni nano-sklopovi posredovani COS-BA ne samo da pokazuju pametnu karakteristiku "mirovanja" s podmuklim učincima kemoterapije, već također zadržavaju specijaliziranu PDT aktivnost, pokazujući ogroman potencijal za pametnu antitumorsku terapiju.

Slika 4 (A) Profili otpuštanja Ce6 in vitro iz COS-BA/Ce6 NP u PBS (pH 7,4, 6,5 ili 5,6) koji sadrži Tween 80 (0,5%, v/v) na 37 C. (B) Mogući mehanizam koji reagira na pH koji Hþ pokreće rastavljanje NP-ova. (C) Rastavljanje COS-BA/Ce6 NP nakon izravne inkubacije u vodi s približno pH 4.0. (D) Kontaktni kut slobodnih BA, Ce6, COS-BA, odnosno COS-BA/Ce6 NP. (E) Stanična citotoksičnost slobodnog BA, COS i amfifilnog COS-BA protiv reprezentativnih stanica raka 4T1 i normalnih LO2 stanica. Preživljavanje stanica (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 stanica raka nakon inkubacije sa slobodnim COS-BA, COS-BA/Ce6 NP sa/bez zračenja pri naznačenoj ekvivalentnoj koncentraciji COS-BA tijekom 24 h. (I) Stanična citotoksičnost slobodnih COS-BA, neozračenih COS-BA/Ce6 NP protiv normalnih LO2 i L929 stanica. (J) IC50 analiza COS-BA protiv raka i normalnih stanica. Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti SD (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0,01 i ***P ˂ 0,001 pokazuju značajne razlike.

Kako bi se istražili mogući razlozi koji stoje iza ove karakteristike mirovanja kemoterapije, ponašanje stanica COS-BA/Ce6 NP ovisno o vremenu procijenjeno je sukcesivno inkubiranjem sa stanicama raka 4T1. Rezultati su pokazali da, iako su COS-BA/Ce6 NP-ovi pokazali značajno gašenje fluorescencije, još uvijek su pokazali poboljšanu fagocitnu učinkovitost u usporedbi sa slobodnim Ce6 zahvaljujući jačoj citoplazmatskoj crvenoj fluorescenciji, kako je utvrđeno kvantitativnom analizom protočne citometrije (Slika 5A). Ova poboljšana stanična internalizacija NP može se pripisati endocitozi21. Uzevši zajedno, nagađali smo da, iako visoko topljivi u vodi skupovi COS-BA/Ce6 NP (kontaktni kut q: 36,7 ) pokazuju poboljšanu staničnu endocitozu od lipofilnog Ce6 (q: 132,6, blizu BA), smanjena učinkovitost fagocitoze NP-ovi se mogu pojaviti u usporedbi s amfifilnom COS-BA molekulom, čime se čini da potiskuju kemoterapijsku citotoksičnost COS-BA/Ce6 NP-ova. To jest, učinkovitost staničnog unosa od visoke do niske kao takav niz: amfifilni COS-BA, hidrofilni COS-BA/Ce6 NP, lipofilni BA ili Ce6. Što je još važnije, neadekvatno rastavljanje staničnih NP može biti još jedan važan razlog za oslabljeni kemoterapijski učinak, a sve to može biti povezano s pametnim kemoterapijskim mirovanjem COS-BA/Ce6 NP. Osim toga, budući da je rastavljanje NP posebno provedeno u kiselom okruženju tumorskih stanica, kako bismo pokazali značajku koja reagira na pH, dodatno smo pokušali usporediti učinke unosa COS-BA/Ce6 NP u normalne LO2 stanice (Slika 5B) . Međutim, COS-BA/Ce6 NP nisu pokazali značajno inhibiranu Ce6 crvenu fluorescenciju u LO2 stanicama. Nasuprot tome, ponašanje unosa od strane LO2 bilo je slično onom kod 4T1 stanica raka, što sugerira da se COS-BA/Ce6 NP mogu rastaviti čak i u normalnim stanicama, što može biti rezultat slabo kiselog pH unutarstaničnih odjeljaka (endosomi/lizosomi) koji postoje unutra i raka i normalnih stanica46. Budući da stanični unos NP-a ovisi o procesu endocitoze, izravna inkubacija lijeka možda neće istaknuti pH-odziv COS-BA/Ce6 NP-a na staničnoj razini. Ipak, tumorsko mikrookruženje (TME) vrlo je kiselo u usporedbi s normalnim tkivima47. Bez obzira na intracelularni rak ili TME, COS-BA/Ce6 NP mogu reagirati na pH i rastaviti ih kako bi potaknuli oslobađanje vrlo toksičnog COS-BA. Dok se u normalnim tkivima COS-BA/Ce6 NP mogu rastaviti tek nakon ulaska u normalno stanično okruženje, smanjujući vjerojatnost oslobađanja COSBA. Stoga zaključujemo da je karakteristika mirovanja kemoterapije COS-BA/Ce6 NP u tumorskom mikrookruženju valjana i pouzdana, a ideja dizajna u ovoj studiji je izvediva.

3.5. In vitro kemoterapija/PDT antikancerogena učinkovitost COS-BA/Ce6 NP

Dodatno, prije detaljne in vitro kemoterapije/PDT antitumorske učinkovitosti COS-BA/Ce6 NP i daljnjeg otkrivanja mehanizma endocitoze, proučavamo četiri glavna puta endocitoze dodavanjem odgovarajućih endocitnih inhibitora uključujući klorpromazin (posredovan klatrinom), klorokin fosfat ( inhibitor acidifikacije lizosoma), nistatin (posredovan kaveolama) i inhibitor makropinocitoze EIPA (etilizopropil amilorid) (sl. 5C i D). Primjećujemo da bi uvođenje nistatina i klorpromazina moglo učinkovitije inhibirati fagocitnu učinkovitost nego EIPA i klorokin fosfat, pokazujući značajno smanjenu staničnu fluorescenciju u usporedbi s normalnim 37 C. Ovi rezultati pokazuju da su COS-BA/Ce6 NPs internalizirani višestrukim mehanizmima, uglavnom kroz putevi endocitoze posredovani klatrinom i kaveolama. Budući da je povećano stvaranje 1 O2 putem međumolekularnih interakcija, COS-BA/Ce6 NP pokazuju značajno povećan međustanični prinos ROS od Ce6 kao što je naznačeno jačom zelenom fluorescencijom DCFH sonde (Sl. 5E), što implicira veću fotodinamičku učinkovitost. MTT testovi pokazuju da COS-BA/Ce6 NP pod zračenjem imaju značajno pojačan inhibicijski učinak na 4T1 stanice od onog ekvivalentnog Ce6, uz relativno umjerenu citotoksičnost bez zračenja (slika 5F). Značajno je da je IC50 Ce6 ​​(0,53 mg/mL) u COS-BA/Ce6 NPs bio mnogo niži od slobodnog Ce6 (1,39 mg/mL) (Slika 5G), što ukazuje na značajno poboljšanu učinkovitost PDT-a, koja je bila nadalje savršeno demonstrirano citotoksičnošću COSBA/Ce6 NP protiv ljudskih MCF-7 i HepG2 stanica raka (popratne informacije, slika S19). Isto tako, u usporedbi sa slobodnim Ce6, relativno niže vrijednosti IC25, IC50 i IC75 također su primijećene u zajedničkim sklopovima (slika 5G). U međuvremenu, u usporedbi sa samom Ce6 PDT i jednom kemoterapijom NP-ova u mraku, COS-BA/Ce6 NP-ovi pod zračenjem postigli su učinkovitiju kombiniranu kemoterapiju/PDT protiv gore navedene tri stanice raka, pokazujući sinergizam (indeks kombinacije: CI ˂ 1) ( Slika 5I). Osim toga, dvostruko bojenje fluorescencije živih/mrtvih stanica korištenjem kalcein-acetoksimetil estera (kalcein-AM) i propidijevog jodida (PI) dodatno je potvrdilo da COS-BA/Ce6 NP mogu učinkovito inducirati apoptozu i nekrozu stanica, jer su tretirane stanice bile gotovo obojene s crvenim PI fluorescentnim signalom kada se uzgaja dodatnih 10 sati nakon ozračivanja (slika 5H). U međuvremenu, neozračeni COS-BA/Ce6 NP (veća doza Ce6: 3,2 mg/mL) također su imali određenu kemoterapeutsku aktivnost kao što se vidi po AM i PI signalima istovremeno. Ova značajno poboljšana PDT aktivnost COS-BA/Ce6 NP dodatno je potvrđena AM/PI bojanjem nakon tretmana od dodatnih 20 sati (popratne informacije, slika S20). Štoviše, pri dodavanju natrijevog azida (SA) i D-manitola (DM), posebnog posebnog sredstva za gašenje 1 O2 i $OH48, stanicama 4T1 tretiranim s COS-BA/Ce6 NPs-PDT, očito povećana vitalnost stanica implicira da Fotoreakcije tipa I ($OH) i tipa II (1 O2) dogodile su se istovremeno u PDT procesu posredovanom COSBA/Ce6 NP (slika 5J). Nadalje, COS-BA/Ce6 NP posebno imaju bolju kompatibilnost s krvlju kao što je naznačeno zanemarivom hemolizom crvenih krvnih stanica (Slika 5K), što ukazuje na potencijal za biomedicinske primjene putem intravenske primjene.

3.6. In vivo biodistribucija COS-BA/Ce6 NP

Nakon toga, prije in vivo istraživanja distribucije, sljedeći smo procijenili farmakokinetiku COS-BA/Ce6 NPs praćenjem koncentracije Ce6 u krvi nakon intravenozne injekcije s ekvivalentnim Ce6 ili COS-BA/Ce6 NPs. Profili Ce6 koncentracija-vrijeme u krvi (slika 6A) i usporedni farmakokinetički parametri (Tablica popratnih informacija S1) jasno podupiru da COS-BA/Ce6 NP imaju produljenu cirkulaciju u krvotoku, što može omogućiti veće nakupljanje na tumoru stranice. Konkretno, COS-BA/Ce6 NP-ovi su pokazali brzu eliminaciju iz krvi unutar 2 sata, što ukazuje na povoljnu biorazgradljivost. U skladu s tim, zatim smo istražili in vivo biodistribuciju i sposobnost akumulacije tumora COS-BA/Ce6 NP (sl. 6B i C). Slično univerzalno prijavljenim Ce6 nanokompozitima33, COS-BA/Ce6 NP mogu se brzo rasporediti po cijelom tijelu. Osobito tijekom prva 4 sata, sklopovi su pokazali očito jaču emisiju fluorescencije na mjestima tumora od slobodnog Ce6, što ukazuje na poboljšanu sposobnost zadržavanja i ciljane akumulacije COS-BA/Ce6 NP-ova, što se vjerojatno pripisuje učinku zadržavanja pasivne povećane propusnosti (EPR). koju daju nanočestice14. Nakon 6 sati nakon injekcije, intenzitet fluorescencije na mjestima tumora postupno se brzo smanjivao. Značajno, za razliku od uobičajeno prijavljenih nanokompozita sa značajno pojačanom akumulacijom tumora u usporedbi sa slobodnim pozitivnim lijekom29, COS-BA/Ce6 NP nisu pokazali vrlo istaknutu akumulaciju na mjestima tumora 24 sata nakon injekcije od slobodnog Ce6 (Sl. 6C), koji je bio dodatno potkrijepljeno prikazom izrezanog tumora (sl. 6D i E). Izvrsna biorazgradivost NP može biti odgovorna za uvođenje prirodnih malih organskih molekula. To je također primijećeno kod drugih terpenoidnih nano-sklopova posredovanih malim molekulama49. Osim toga, COS-BA/Ce6 NP također su pokazali sličnu distribuciju u tkivu kao slobodni Ce6 (Sl. 6E), a ex vivo prosječni intenzitet fluorescencije općenito je bio niži od onog predstavljenog in vivo, što dalje ukazuje na dobru biorazgradljivost. Uz to, uzimajući u obzir veliku razliku u razini fluorescencije između 2 i 4 sata nakon injekcije NP-a i Ce6, kao i eksperimentalnu operativnost koja dopušta dovoljne intervale za zračenje, 4 sata nakon primjene odabrano je kao svjetlosna vremenska točka za naknadnu PDT terapiju.

Uzimajući u obzir ne baš izraženu akumulaciju tumora nakon 24 sata od slobodnog Ce6, kako bismo dodatno potvrdili povećani EPR učinak koji imaju COS-BA/Ce6 NP, odmah smo pratili ex vivo fluorescentne slike tumora u različitim vremenima nakon intravenozne injekcije nanolijekova ( sl. 6F i G). Zanimljivo, bilo 20 minuta ili 12 sati nakon injekcije, COS-BA/Ce6 NP doista su pokazali jaču emisiju fluorescencije na mjestima tumora od slobodnog Ce6, pokazujući izvrsnu i poboljšanu sposobnost akumulacije tumora. U međuvremenu, kako je vrijeme prolazilo, intenziteti fluorescencije zadržani u tumorskom tkivu postupno su slabili (slika 6G), što je u potpunosti u skladu s rezultatima in vivo životinjskog fluorescentnog snimanja. Jasno je da je ovaj brzi biološki metabolizam i pojačana akumulacija tumora izbjegla potencijalnu dugotrajnu toksičnost akumulacije, jamčeći visoko učinkovitu antitumorsku terapiju s boljom biološkom sigurnošću.

Slika 5 In vitro antikancerogena učinkovitost COS-BA/Ce6 NP. Stanična internalizacija (A) 4T1 stanica raka i (B) LO2 normalnih stanica inkubiranih u slobodnim Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP 0.5 i 3 h, i odgovarajuća protočna citometrijska analiza intenziteta fluorescencije. (C) Studije inhibicije unosa specifičnih endocitnih puteva i (D) odgovarajući intenzitet fluorescencije stanica izmjeren protočnom citometrijom nakon inkubacije s COSBA/Ce6 NP sa/bez endocitnih inhibitora uključujući klorpromazin, klorokin, nistatin i etilizopropil amilorid (EIPA). Mjerne trake Z 20 mm. (E) Stanično stvaranje ROS-a izazvano slobodnim Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP (ekvivalent Ce6: 1,6 mg/mL). Mjerne trake Z 20 mm. (F) Preživljavanje stanica 4T1 stanica nakon različitih tretmana tijekom 24 sata. (G) Analiza IC25, IC50, IC75 slobodnih Ce6 i COS-BA/Ce6 NP-ova protiv 4T1, MCF-7, odnosno HepG2 stanica. (H) Calcein-AM/propidium jodid (PI) živo/mrtvo bojenje COS-BA/Ce6 NPs (Ce6: 1,6 mg/mL) tretiranih 4T1 stanica nakon inkubacije dodatnih 10 h, kao i neozračene COS- BA/Ce6 NP (Ce6: 3,2 mg/mL). Mjera Z 50 mm. (I) Indeks kombinacije (CI) COS-BA/Ce6 NP na stanicama 4T1, MCF-7 i HepG2, kako je određeno izračunom teorema Chou Talalay. (J) PDT mehanizmi (Tip I i ​​Tip II) inducirani zračenjem COS-BA/Ce6 NP i procijenjeni specifičnim 1 O2 i $OH gasiteljem natrijevim azidom (SA) odnosno D-manitolom (DM). (K) Postotak hemolize crvenih krvnih stanica nakon inkubacije s COS-BA/Ce6 NP tijekom 4 sata. Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti SD (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 i ***P ˂ 0,001 pokazuju značajne razlike.

Slika 6 In vivo krvotok i biodistribucija COS-BA/Ce6 NP. (A) Profili Ce6 koncentracija-vrijeme u krvi nakon iv injekcija ekvivalenta Ce6 ili ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP (n Z 3). (B) Fluorescentne slike cijelog tijela miševa s tumorom 4T1 nakon iv injekcija naznačenih lijekova u različitim vremenskim točkama. (C) Prosječni intenzitet fluorescencije dobiven na mjestima tumora u (B). (D) Ex vivo fluorescentne slike tumora i glavnih organa izrezanih iz gore navedenih miševa nakon 24 sata, i odgovarajući (E) kvantitativni rezultat intenziteta fluorescencije (n Z 3). (F) Ex vivo fluorescentne slike tumora i glavnih organa u različitim vremenima nakon iv injekcija Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP, i (G) odgovarajuća analiza intenziteta fluorescencije tumora. Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti SD (n Z 3).

3.7. In vivo kemoterapija/PDT kombinirano antitumorsko liječenje 

Motivirana jedinstvenom karakteristikom mirovanja, dobrom biorazgradivošću i PDT aktivnošću, ispitivana je in vivo kombinacija kemoterapije/PDT antitumorske terapije. Miševi s tumorom 4T1 nasumično su podijeljeni u 6 skupina i intravenozno im je ubrizgan ekvivalent Ce6 (3,5 mg/kg tijela) svaka 2 dana za ukupno tri doze. 4 h nakon injekcije, mjesta tumora miševa u svjetlosnim skupinama ozračena su 15 minuta (slika 7A). U međuvremenu, odgovarajući volumeni tumora ili tjelesne težine bilježeni su svaki drugi dan. Nakon 14 dana liječenja (slika 7B), slobodni Ce6 sa zračenjem i slobodni COS-BA bili su neučinkoviti u supresiji tumora, vjerojatno zbog ograničene akumulacije lijeka u tumorskom tkivu. Nasuprot tome, nakon zračenja COS-BA/Ce6 NPs, primijećena je najznačajnija inhibicija tumora, potvrđujući izvrsnu učinkovitost kombinacije kemoterapije/PDT. Prosječna težina tumora (Slika 7D) i odgovarajuće fotografije seciranih tumora (Slika 7E) pokazale su najbolju antitumorsku učinkovitost COS-BA/Ce6 NP pod zračenjem, budući da su tretirani miševi pokazali najmanju veličinu tumora od onih iz drugih skupina. Srednji omjer inhibicije tumora COS-BA/Ce6 NP-ova tretiranih PDT-om dosegao je 80,3%, više od onih za slobodni Ce6 PDT (42,4%) i slobodni COS-BA (38,5%). Značajno, iako su prethodne in vitro studije pokazale da COS-BA/Ce6 NP bez svjetla pokazuju uspavanu funkciju kemoterapeutske aktivnosti, oni još uvijek imaju poboljšanu antitumorsku učinkovitost (49,5%) u usporedbi sa slobodnim COS-BA (Slika 7D). Nagađali smo da dva moguća razloga pridonose ovom rezultatu, jedan je veća akumulacija tumora COS-BA/Ce6 NP-a zbog naširoko prijavljivanog EPR učinka. Drugi čimbenik je slabo kiselo mikrookruženje tumora koje je stimuliralo oslobađanje vrlo toksičnog COS-BA. Zbog veće kritične koncentracije micela (CMC, 187 mg/mL) COS-BA (popratne informacije, slika S21), mogao bi postojati u monomernom stanju u okruženju tumora, što daje prednost poboljšanoj kemoterapiji neozračenih COS- BA/Ce6 NP. Osim toga, kako bi se dodatno potvrdila superiorna antikancerogena učinkovitost COS-BA/Ce6 NP, izvršeno je bojenje tumora hematoksilinom i eozinom (H&E) (slika 7G).

Slika 7 Studija učinkovitosti s potkožnim modelom ksenotransplantata 4T1. (A) Shematski prikaz in vivo PDT tretmana. (B) Profili rasta tumora, (C) promjene tjelesne težine i (D) težine izrezanog tumora koji sadrže omjere inhibicije tumora miševa koji nose 4T1- nakon različitih tretmana u navedenim skupinama (n Z 5 za svaku skupinu). (E) Slike izrezanih tumora reprezentativnih miševa nakon tretmana. (F) Biokemijska analiza seruma nakon tretmana s COS-BA/Ce6 NP tijekom 14 dana. (G) Reprezentativno H&E bojenje izrezanih dijelova tumora nakon različitih tretmana. Mjerne trake Z 50 mm. (H) TUNEL bojanje slobodnih Ce6 i COS-BA/Ce6 NPs PDT-tretiranih tumorskih sekcija. Ljestvice Z 20 mm **P < 0,01 označava značajne razlike.

Rezultati su pokazali da dijelovi tumora tretirani COS-BA/Ce6 NPs-PDT pokazuju ozbiljno propadanje tkiva i nedostatak jezgri, dok je u drugim skupinama primijećena umjerena nekroza tkiva. Istovremeno, u usporedbi sa slobodnim Ce6 svjetlom, COS-BA/Ce6 NP pod zračenjem značajno su povećali broj TUNEL-pozitivnih stanica koje pokazuju jače smeđe obojenje jezgre (Sl. 7H), dodatno potvrđujući izvrsnu kombinaciju kemoterapije/PDT terapije. Štoviše, nisu primijećene očite varijacije tjelesne težine u svim skupinama (slika 7C). Čak i ako su skupine COSBA/Ce6 NP ili Ce6 light imale skroman gubitak tjelesne težine tijekom primjene, tjelesne težine vratile su se na normalu nakon nekoliko dana. Nije bilo vidljivog oštećenja ili upalne lezije u glavnim organima prikupljenim na kraju tretmana (popratne informacije, slika S22), što ukazuje na nisku/nikakvu sistemsku toksičnost i dobru biosigurnost COS-BA/Ce6 NP. Nadalje, iako se COS-BA/Ce6 NP uglavnom nakupljaju u tkivu jetre, odgovarajući markeri funkcije jetre (ALT, AST i ALP) nisu pokazali značajne promjene u usporedbi s normalnim zdravim miševima (Slika 7F), što ukazuje na bolju biokompatibilnost. Osim toga, čini se da su markeri bubrežne funkcije (BUN, CRE i UA) i biokemijski parametri (ALB i TBIL) slični onima kod normalnih miševa, što dalje ukazuje na bolju biološku sigurnost. Jasno je da ovaj predlijek organskih malih molekula COS-BA-posredovanih ko-sklopova COS-BA/Ce6 NP posjeduje višestruke povoljne terapijske karakteristike koje otvaraju atraktivne mogućnosti za primjenu u kliničkoj medicini.

3.8. Antitumorska imunost kombinirane kemoterapije/PDT i anti-PD-L1 blokade

Nedavno su brojne inovativne studije pokazale da bi kombinacija imunoterapije raka s drugim modalitetima liječenja mogla učinkovito potaknuti tumor-specifične imunološke odgovore na eliminaciju primarnih ili udaljenih tumora1. Potaknuti jedinstvenom funkcijom mirovanja kemoterapije i izvrsnom antitumorskom učinkovitošću kemoterapije/PDT-a COS-BA/Ce6 NP-ova, stoga se pitamo bi li on također mogao pokrenuti imunološke odgovore uz pomoć imunološkog adjuvanta anti-PD-L1 kako bi uzrokovao visoko učinkovitu antitumorsku terapiju . Može li liječiti udaljene tumore koji se ne mogu izravno liječiti korištenjem PDT terapije, čime bi se osigurala alternativna strategija za kliničke primjene protiv raka? Kako bi se testirala ova hipoteza, u ovoj je studiji uspostavljen model "dva tumora", a detaljni eksperimentalni postupci prikazani su na slici 8A. Tipično, dva 4T1 tumora su inokulirana u lijevi i desni bok svakog miša. S obzirom da sam anti-PD-L1 nema uočljiv imunoterapijski učinak50, eksperimenti su podijeljeni u 5 skupina uključujući netretiranu skupinu, COS-BA/Ce6 NP, COS-BA/Ce6 NP s anti-PD-L1, COS- BA/Ce6 NP sa svjetlom, COS-BA/Ce6 NP sa svjetlom i anti-PD-L1. Nakon jedne iv injekcije NP (Ce6: 3,5 mg/kg), desni tumori (primarni tumor) u svijetlim skupinama ozračeni su 15 minuta kako bi se procijenili imunološki učinci PDT/kemoterapije, dok su lijevi tumori (udaljeni tumori) u svim skupinama bez ikakvog liječenja odabrani su za individualnu kemoterapiju. Nakon toga, 2., 4. i 6. dana, miševima u imunim skupinama intravenski je ubrizgano anti-PD-L1 protutijelo (15 mg po mišu po injekciji) za ukupno tri doze. Značajno, bez obzira na liječenje PDT ili ne, COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 mogu učinkovito inhibirati napredovanje primarnog tumora (Slika 8B). A odgovarajući prosječni omjeri inhibicije tumora zasebno su dosegli 86.7% (zračenje) i 76,5% (bez zračenja), daleko više od pojedinačne kemoterapije (5,7%) ili kemoterapije/PDT (27,4%) liječenja (Slika 8C) . Fotografije diseciranih tumora (Sl. 8D) i miševa koji nose 4T1- (Dopunske informacije, Sl. S23) nakon 14 dana liječenja također su vizualno poduprle gornji zaključak. Ovi rezultati sugeriraju da bi i kemoterapija temeljena na NP-ima i kemoterapija/PDT mogle učinkovito aktivirati antitumorsku imunost. U međuvremenu, što je najupečatljivije, anti-PD-L1 blokada plus NP-ovi također su ponudili izvanredan učinak inhibicije tumora na neozračene udaljene (lijevo) tumore (Slika 8E i F), općenito jači od samih COS-BA/Ce6 NP-ova, što je bilo također potvrđeno odgovarajućim seciranim tumorima i slikama miševa nakon tretmana (Slika 8D i Slika S23), dodatno pokazujući učinkovit antitumorski imunološki odgovor izazvan NP-ovima COS-BA/Ce6.

Kako bi se u potpunosti istražio ovaj učinkoviti antitumorski imunološki odgovor, CD8þ citotoksični T limfociti (CTL), kritični imunociti za imunoterapiju raka4, dodatno su procijenjeni analizom imunoloških stanica u desnom ili lijevom tumoru nakon 14 dana liječenja. Utvrđeno je da COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 sa ili bez PDT tretmana induciraju snažnu CD8þ CTL infiltraciju u primarnim tumorima (Slika 8H i J). Infiltracija CD8þ CTL bila je do 11,3% nakon kemoterapije bazirane na COS-BA/Ce6 NPs/PDT plus anti-PD-L1 liječenja, nešto više od COS-BA/Ce6 NPs plus anti-PD-L1 (9,63%), i mnogo veći od onog u drugim skupinama bez anti-PD-L1, uključujući liječenje kemoterapijom temeljenom na COS-BA/Ce6 NP (5,12%) ili samo kemoterapijom/PDT (4,07%). Slično tome, u usporedbi s neimunim skupinama, značajno povećana CTL infiltracija također je primijećena u lijevim (udaljenim) tumorima za miševe nakon COS-BA/Ce6 NP plus antiPD-L1 sa ili bez PDT tretmana (Slika 8I i K), dalje što podrazumijeva visoko učinkovite imunološke odgovore izazvane kemoterapijom ili kombiniranom terapijom kemoterapije/PDT. U međuvremenu, nakon uvođenja anti-PD-L1, i kemoterapija temeljena na COS-BA/Ce6-i kemoterapija/PDT doveli su do snažne proizvodnje višestrukih citokina koji igraju ključnu ulogu u regulaciji citotoksičnih funkcija CTL-a8, uključujući tumor faktor nekroze-alfa (TNF-a) (Slika 8L) i interferon-gama (IFN-g) (Slika 8M) u uzorcima seruma miševa nakon 14 dana tretmana, dodatno potvrđujući da su postojali učinkoviti antitumorski imunološki odgovori. Osim toga, nisu primijećene očite promjene u tjelesnoj težini u različitim skupinama liječenja (Slika 8N), što ukazuje na povoljnu biosigurnost ove kombinirane kemoterapije/PDT/imunoterapije. Uzevši sve zajedno, otkrili smo da, iako su anti-PD-L1 plus COSBA/Ce6 NP sa svjetlom pokazali malo veći omjer inhibicije tumora (86.7%) od neozračene skupine (76.5%) protiv desnih tumora zahvaljujući utjecaju PDT-a (Slika 8B-D), nisu primijećene značajne razlike u terapijskim učincima na lijeve tumore u prisutnosti (77,8%) ili odsutnosti (78,4%) PDT-a (Slika 8E-G). Nagađamo da sljedeći mogući razlozi dovode do ovog fenomena. Prvo, za mehanizam kemoterapije ili PDT-a koji pojačava imunološke učinke blokade kontrolne točke anti-PD-L1, gomilanje studija je pokazalo da ti modaliteti liječenja mogu izazvati akutnu upalu u području tumora, povećavajući tako prezentaciju antigena povezanih s tumorom T stanice, potičući tako stanice raka da se podvrgnu ICD8,9. Tumorske stanice podvrgnute ICD-u pojačale bi signale "pojedi me" izlaganjem kalretikulina (CRT) na površinama imunogeno umirućih tumorskih stanica i signale "opasnosti" otpuštanjem okvira 1 grupe visoke pokretljivosti (HMGB1), potičući aktivaciju dendritičnih stanica za aktiviranje CTL-a, čiju bi aktivnost mogao pojačati anti-PD-L1, što bi rezultiralo značajno poboljšanom imunoterapijom protiv raka51.

Slika 8 Antitumorski učinak kemoterapije/PDT-a bazirane na COS-BA/Ce6 NP plus blokada kontrolnih točaka anti-PD-L1 imunoterapija. (A) Shematski prikaz kemoterapije/PDT-a temeljene na CNP-u s anti-PD-L1 terapijom. (BeD) (B) Profili rasta tumora, (C) prosječne težine tumora i (D) slike izrezanih tumora reprezentativnih miševa za primarne (desno) tumore nakon različitih tretmana tijekom 14 dana kako je naznačeno. (EeG) (E) Krivulje rasta tumora, (F) prosječne težine tumora i (G) slike izrezanih tumora za neozračene udaljene (lijevo) tumore nakon različitih tretmana kako je naznačeno. (H) Populacije CD8þ T stanica u desnim tumorima i (J) postoci CTL infiltracije kvantitativno su otkriveni protočnom citometrijom nakon 14 dana liječenja. (I, K) Populacije CD8þ T stanica u lijevim tumorima 14. dana kvantitativno su otkrivene protočnom citometrijom (n Z 3). Izlučivanje citokina u serumu nakon 14 dana liječenja uključujući (L) IFN-g i (M) TNF-a mjereno ELISA testom (n Z 3). (N) Promjene u tjelesnoj težini miševa tijekom različitih tretmana. *P < 0.05, **P < 0.01 i ***P < 0.001 pokazuju značajne razlike.

Drugo, u ovom radu, COS-BA/Ce6 NP mogu se distribuirati na lijevi i desni tumor istovremeno, i lijeva kemoterapija i desna kemoterapija/PDT imaju ogroman potencijal za induciranje tumorskih stanica koje prolaze kroz ICD. U međuvremenu, COS-BA/Ce6 NPs se primjenjuju u samo jednoj dozi, imunoterapija uglavnom ovisi o tri doze anti-PD-L1, bilo kemoterapija ili kemoterapija/PDT, one su samo početnice. Terapeutske razlike u induciranju ICD-a tumorskih stanica između pojedinačne kemoterapije i kombinirane kemoterapije/PDT tretmana možda nisu jako izražene. Postotak CD8þ CTL-ova na lijevom (Slika 8I i K) i desnom tumoru (Slika 8H i J) također je podržao gornju spekulaciju, nije primijećena značajna razlika u CD8þ CTL-ovima u prisutnosti ili odsutnosti PDT-a. Stoga su COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 sa ili bez zračenja postigli sličnu antikancerogenu učinkovitost protiv lijevih tumora. Nadalje, budući da 4T1 stanice izražavaju niske razine PD-L152, široko je dokazano da sam anti-PD-L1 ima bilo kakav uočljiv imunoterapijski učinak na 4T1 rak dojke53,54. Unatoč tome što ICD učinci posredovani COS-BA/Ce6 NP zahtijevaju daljnje istraživanje, prikazani rezultati su pokazali da COS-BA/Ce6 NPs postižu nevjerojatno poboljšane imunološke odgovore uz pomoć anti-PD-L1. Zajedno, čini se da su COS-BA/Ce6 NP doista potencirali imunoterapiju raka anti-PD-L1, a ne samo kombiniranu terapiju. Iako anti-PD-L1 plus COS-BA/Ce6 NP sa ili bez PDT tretmana nisu pokazali značajne razlike u terapijskim učincima, oba su pokazala očito povećanu antitumorsku učinkovitost u usporedbi s jednom dozom COS-BA/Ce6 NP. Odnosno, čak i ako nema laganog tretmana, nakon što je uveden imunološki adjuvans antiPD-L1, imunogenost tumorskih ostataka nakon kemoterapije COS-BA/Ce6 NPs može se pojačati što rezultira izvanrednim sustavnim antitumorskim imunološkim odgovorima, što dovodi do učinkovite supresije primarnih ili udaljenih tumora. Stoga bi trebalo biti moguće eliminirati primarne i metastatske tumore tijekom kliničke imunoterapije protiv raka s ponavljanim tretmanima s NP. Jasno je da ovi rezultati zajedno pružaju dokaze o visoko učinkovitim i sinergističkim antitumorskim imunološkim odgovorima izazvanim COS-BA/Ce6 NP u kombinaciji s blokadom anti-PD-L1, bilo sa samom kemoterapijom ili u kombinaciji s kemoterapijom/PDT.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

4. Zaključci

Ukratko, namjerno smo dizajnirali, sintetizirali i razvili biokompatibilan, biorazgradiv, nisko toksičan, ali vrlo učinkovit i klinički dostupan transformirani foto-kemoterapijski nano-prolijek COS-BA/Ce6 NPs kombiniranjem tri multifunkcionalne komponente, prirodne male molekule betulinske kiseline koja se sama sastavlja (BA), COS topiv u vodi i nisko toksični fotosenzibilizator Ce6 za kombiniranu kemoterapiju/PDT. Naknadno pokreće vrlo učinkovite i sinergističke antitumorske imunološke odgovore u kombinaciji s blokadom protiv PD-L1, bilo sa samom kemoterapijom ili u kombinaciji s kemoterapijom/PDT. Konkretno, pokazujemo da molekularni raspored šuplje mreže može olakšati stvaranje nanočestica strukturiranih ljuski. Modifikacije COS-a topljivog u vodi mogle bi uvelike pojačati antikancerogeno djelovanje lipofilnih prirodnih malih molekula konstruiranjem amfifilnog prolijeka. Također pokazujemo da su dobiveni nanolijekovi pokazali višestruka povoljna terapeutska svojstva, posebno pametnu funkciju "mirovanja" s podmuklim učincima kemoterapije. U kombinaciji s karakterističnom pH reakcijom, ovi skupovi imaju nisku toksičnost i biosigurnost s normalnim tkivom, ali su vrlo toksični za tumorska tkiva. Zajedno s poboljšanom generacijom 1 O2, dobrom biorazgradivošću i biokompatibilnošću, sve je to pridonijelo visoko učinkovitoj, sinergističkoj i sigurnoj kemoterapiji protiv raka/PDT/imunoterapiji. Konkretno, pojedinačna kemoterapija bez PDT liječenja može aktivirati sustavne antitumorske imunološke odgovore, otvarajući atraktivne mogućnosti za klinički sinergističku imunoterapiju kemoterapije protiv raka. Sve u svemu, ovaj rad pruža obećavajući uvid u razvoj prirodnih višenamjenskih visoko bioaktivnih i niskotoksičnih nano-imunostimulansa za kliničku imunoterapiju.

Reference

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Nedavni napredak u sinergističkoj kombiniranoj imunoterapiji raka temeljenoj na nanomaterijalima. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ, et al. Imunoterapije raka temeljene na nanomedicini razvijene reprogramiranjem makrofaga povezanih s tumorom. Nanoskala 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL, et al. Kombinirana lokalna imunostimulacijska radioizotopna terapija i sustavna blokada imunološke kontrolne točke daju snažne antitumorske odgovore. Nat Biomed Eng 2018;2:611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY, et al. Integrirane nanočestice fototermalne kemoterapije s odgovorom mikrookruženja tumora pojačale su indukciju imunogene stanične smrti za učinkovito liječenje kolorektalnog raka. ACS Appl Mater sučelja 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K, et al. Unutarstanična agregacija nanosklopova malih molekula reprogramiranih peptidima poboljšava kemoterapiju raka i kombinatornu imunoterapiju. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.

6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X, et al. Poboljšana imunoterapija temeljena na fotodinamičkoj terapiji za iskorjenjivanje tumora primarnih i plućnih metastaza. ACS Nano 2018; 12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Imunološki odgovori potaknuti fototermalnom terapijom ugljikovim nanocjevčicama u kombinaciji s anti-CTLA-4 terapijom za inhibiciju metastaza raka. Adv Mater 2014;26:8154e62.

8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR, et al. Koordinacijski polimeri jezgre i ljuske na nanomjeri kombiniraju kemoterapiju i fotodinamičku terapiju kako bi pojačali imunoterapiju raka blokade kontrolnih točaka. Nat Commun 2016;7:12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Imunogena stanična smrt kod raka i zaraznih bolesti. Nat Rev Immunol 2017; 17: 97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH, et al. Kombinacija magnetskih nanočestica na bazi fukoidana i imunomodulatora poboljšava imunoterapiju lokaliziranu na tumoru. Nat Nanotechnol 2018;13:746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY, et al. Biorazgradiva nanovezikula derivata hipokretina kao teranostik blisko infracrvenom svjetlu za dualnu fotoaktivnu sliku i terapiju raka. Biomaterijali 2018;185:133e41.

12. Spicer CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Konjugati nanočestica peptida i proteina svestrane su platforme za biomedicinske primjene. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL, et al. Nedavni napredak u nanomaterijalima za isporuku nukleinske kiseline u imunoterapiji raka. Biomater Sci 2019;7:2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Nedavni napredak u sono foto dinamičkoj terapiji raka: od razvijenih novih senzibilizatora do strategija povećanja učinkovitosti temeljenih na nanotehnologiji. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Pametni supramolekularni fotodinamički metalo-nano lijekovi na bazi peptida dizajnirani višekomponentnim koordinacijskim samosastavljanjem. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Samosastavljeni gel prirodnih proizvoda malih molekula za isporuku lijekova: proboj u novoj primjeni prirodnih proizvoda malih molekula. Acta Pharm Sin B 2020; 10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB, et al. Pojedinačne nanočestice sastavljene od malih molekula posreduju u učinkovitoj oralnoj isporuci lijeka. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J, et al. Gelatori prirodnih proizvoda i opća metoda za njihovo dobivanje iz organizama. Nanoskala 2018;10:3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Samoskupljene prirodne male molekule diterpenske kiseline s povoljnim djelovanjem protiv raka i biološkom sigurnošću za sinergistički poboljšanu antitumorsku kemoterapiju. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Istraživanje prirodnog aktivnog procesa punjenja lijekom malih molekula i visoko učinkovite sinergističke antitumorske učinkovitosti. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J, et al. Jednostavni i višenamjenski prirodni samosastavljeni steroli s supramolekularnim fotosenzibilizatorima posredovanim antitumorskim djelovanjem za poboljšanu antitumorsku fotodinamičku terapiju. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Bioaktivna prirodna mala molekula podešena koassemblija fotoosjetljivih lijekova za visoko učinkovitu sinergističku i poboljšanu fotokemoterapiju tipa I. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicina-cum-carrier ko-sastavljanjem prirodnih malih proizvoda za sinergističko pojačano antitumorsko djelovanje sa zaštitnim djelovanjem na tkiva. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Liu HP. Nedavni napredak u dizajnu amfifilnih lijekova i cjepiva koji se sami oslobađaju. Adv Ther 2019;3:1900107.

25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. Poboljšanje staničnog unosa terapijskih entiteta kroz interakciju s komponentama stanične membrane. Drug Deliv 2019;26:328e42.

26. Pujals S, Giralt E. Prolinom bogati peptidi koji prodiru u amfipatske stanice. Adv Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H, et al. Pametne mikro/nanočestice u sustavima za dostavu lijeka/gena koji reagiraju na podražaj. Chem Soc Rev 2016; 45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Triterpenski prolijekovi bez nosača s odgovorom na glutation i biološkom sigurnošću za sinergistički poboljšanu fotokemoterapiju. ACS Appl Mater sučelja 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Supramolekularni fotosenzibilizatori pomlađuju fotodinamičku terapiju. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW, et al. Strukturna karakterizacija i antitumorski učinci oligosaharida kitozana protiv ortotopskog tumora jetre putem NF-kB signalnog puta. J Funct Foods 2019;57:157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY, et al. Oligosaharidi kitozana induciraju apoptozu u humanom bubrežnom karcinomu putem stresa endoplazmatskog retikuluma ovisnog o vrstama reaktivnog kisika. J Agric Food Chem 2019;67:1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY, et al. Kombinirana terapija protiv edema i antioksidansa za ishemijski moždani udar pomoću nanočestica betulinske kiseline pune gliburida. Theranostics 2019; 9: 6991e7002.

33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. Jednostavno peptidno podešeno samosklapanje fotosenzibilizatora prema fotodinamičkoj terapiji protiv raka. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y, et al. Nanolijek inspiriran tumorskim mikrookruženjem samociljajućim virusom za preokret oblika za blisku infracrvenu II fototermalnu kemoterapiju. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y, et al. Hibridni sklop nanogela za intracelularnu dostavu egzosoma: učinci na endocitozu i fuziju inženjeringom površinskog polimera egzosoma. Biomater Sci 2020; 8: 619e30.

36. Chou TC. Teorijske osnove, eksperimentalni dizajn i kompjutorizirana simulacija sinergizma i antagonizma u studijama kombinacije lijekova. Pharmacol Rev 2006;58:621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z, et al. Nanošipke bez nosača s dvostrukom funkcijom putem samosastavljanja čistih molekula lijeka za sinergističku kemo-fotodinamičku terapiju. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. Biomedicinske primjene supramolekularnih sustava temeljenih na interakcijama domaćin-gost. Chem Rev 2015;115:7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y, et al. Nanoinženjering novo dizajniranog derivata klorina e6 za pojačanu fotodinamičku terapiju putem regulacije metabolizma laktata. Nanoskala 2021;13:11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM, et al. Nanolijek bez nosača koji se može regulirati mitohondrijskim metabolizmom za pojačavanje osjetljivosti fototermalne terapije. Chem Commun (Camb) 2021;57:8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y, et al. Jednostavan supramolekularni pristup aktiviranoj nanoteranostici pokretanoj nukleinskom kiselinom koja prevladava nedostatke fotodinamičke terapije. ACS Nano 2018; 12:681e8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hibridni TiO2-rutenijev nano-fotosenzibilizator sinergijski proizvodi reaktivne vrste kisika u hipoksičnim i normoksičnim uvjetima. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J, et al. Podešavanje singlet-tripletnog energetskog jaza: jedinstveni pristup učinkovitim fotosenzibilizatorima s karakteristikama emisije inducirane agregacijom (AIE). Chem Sci 2015;6:5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ, et al. Polimerizacija pojačana fotosenzibilizacija. Chem 2018;4:1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. Svjetlosno kontrolirano samosklapanje nanočestica koje ne reagiraju na svjetlo. Nat Chem 2015;7:646e52.

46. ​​Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. pH-osjetljivi polimerom modificirani liposomi na bazi hijaluronske kiseline za stanično-specifične intracelularne sustave isporuke lijekova. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L, et al. Selektivno oslikavanje i smrt stanica raka putem fluorescencije blizu infracrvenog zračenja s promjenom pH i fototermalnih učinaka. Chem Sci 2016;7:5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ, et al. Lagana sinteza multifunkcionalnih magnetskih Fe3O4@ SiO2@CS@pyropheophorbide-a potpomognuta hitozanom fluorescentnih nanočestica za fotodinamičku terapiju. Novi J Chem 2016;40:8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Istraživanje mehanizma samosastavljanja i učinkovite sinergističke antitumorske kemofototerapije biorazgradivog fotoosjetljivog nanolijeka posredovanog ursolnom kiselinom koji reagira na glutation. Biomater Sci 2021; 9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS, et al. Reakcija logičkog računanja temeljena na aptameru na živim stanicama kako bi se omogućila terapija blokade imunološke kontrolne točke bez antitijela. J Am Chem Soc 2021; 143: 8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC, et al. Uklanjanje ustanovljenih tumora kombiniranom kemoimunoterapijom na bazi nanodiska. Sci Adv 2018;4:eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG, et al. Detekcija PD-L1 u tumorima pomoću [(64)Cu]atezolizumaba s PET. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. Terapijski antitumorski imunitet blokadom kontrolnih točaka pojačan je ibrutinibom, inhibitorom i BTK i ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q, et al. Interna radioizotopna terapija posredovana nanočesticama za lokalno povećanje propusnosti vaskulature tumora za sinergistički poboljšane terapije raka. Biomaterijali 2019;197:368e79.