Floretin suzbija neuroupalu aktivacijom Nrf2 u makrofagima posredovanom autofagijom

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Sažetak

Pozadina: Makrofagi igraju dvostruku ulogu u neuroupalnim poremećajima kao što je multipla skleroza (MS). Oni sudjeluju u nastanku i progresiji lezije, ali mogu također pospješiti razrješenjeupalai popravak oštećenog tkiva. U ovoj studiji istražujemo je li i kakofloretin, flavonoid koji je obilno prisutan u jabukama i jagodama, smanjuje upalni fenotip makrofaga i suzbijaneuroinflamacija.

Metode: Transkripcijske promjene u makrofagima izvedenim iz koštane srži miša nakon izlaganja floretinu procijenjene su skupnim sekvenciranjem RNA. Osnovni putovi povezani s upalom, odgovorom na oksidativni stres i autofagijom potvrđeni su kvantitativnom PCR-om, fluorescentnim i apsorbancijskim testovima, nokautiranim miševima povezanim s nuklearnim faktorom eritroidnim 2-faktorom 2 (Nrf2), western blotom i imunofluorescencijom. Eksperimentalni model autoimunog encefalomijelitisa (EAE) korišten je za proučavanje utjecaja floretina na neuroinflamaciju in vivo i potvrđivanje temeljnih mehanizama.

Rezultati: Pokazujemo da floretin smanjuje upalni fenotip makrofaga i značajno potiskuje neuroupalu u EAE. Floretin posreduje svoj učinak aktiviranjem Nr2 signalnog puta. Aktivacija Nrf2 pripisana je 5'AMP-aktiviranoj protein kinazi (AMPK) ovisnoj aktivaciji autofagije i kasnijoj degradaciji proteina 1 (Keap1) povezanoj s ECH-om poput kelcha.

Zaključci: Ova studija otvara buduće perspektive za floretin kao terapijsku strategiju za neuroupalne poremećaje kao što je MS.

Probna registracija: Nije primjenjivo.

Ključne riječi: floretin, makrofagi, neuroinflamacija, multipla skleroza, autoimunost

Kliknite ovdje da saznate više informacija

Pozadina

Aktivne lezije multiple skleroze (MS) karakterizirane su prisutnošću brojnihmakrofagi[1-5]. Rane studije pokazale su da makrofagi usvajaju proupalni fenotip u MS lezijama, potičući takoneuroinflamacija, demijelinizacija i neurodegeneracija. Efektorske funkcije koje potiču bolest uključuju predstavljanje antigena izvedenih iz središnjeg živčanog sustava (SŽS) autoreaktivnim T stanicama i proizvodnju upalnih medijatora kao što su proupalni citokini, reaktivne kisikove vrste (ROS) i dušikov oksid (NO)[ 6,7]. Nedavno je otkriveno da makrofagi također imaju korisne funkcije u MS lezijama budući da mogu preoblikovati svoj fenotip u onaj koji je tipično povezan s imunosupresijom i popravkom CNS-a. Ovaj zaštitni fenotip karakterizira smanjena proizvodnja proupalnih medijatora, proizvodnja protuupalnih medijatora i faktora rasta te aktivacija antioksidativnih puteva kao što je put eritroidnog 2-srodnog faktora 2 (Nrf2) nuklearnog faktora [8-14]. Budući da je upalni status makrofaga povezan s progresijom MS-a i razvojem kroničnih aktivnih lezija, poticanje makrofaga na povoljan fenotip smatra se obećavajućom strategijom za ograničavanje progresije MS-a [15].

Dijetetske komponente pokreću funkciju makrofaga i neuroinflamaciju [16]. Posebno se sve više priznaje da obitelj flavonoida sadrži obećavajuće spojeve koji utječu na patogene puteve i moduliraju fenotip imunoloških stanica kao što su makrofagi [17,18]. Flavonoidi čine jednu od najvećih obitelji fitonutrijenata koja sadrži preko 8000 fenolnih spojeva s raznolikom bioaktivnošću. Nekoliko članova obitelji flavonoida pokazuje protuupalno i antioksidativno djelovanje na makrofage [19-21]. Flavonoid floretin je član dihidrohalkona i prisutan je u voću koje se često konzumira kao što su jabuke i jagode. Poznato je da floretin ima imunomodulirajuća svojstva i naširoko se koristi za njegu kože zbog svojih antioksidativnih svojstava [22-24]. Štoviše, floretin je inhibitor prijenosnika glukoze (GLUT), značajka koja utječe na fenotip makrofaga budući da aktivaciju makrofaga potiče GLUT [25, 26]. Sve u svemu, ove karakteristike čine floretin spojem koji obećava za modulaciju fenotipa makrofaga i neuroinflamacije. U ovoj studiji pokazujemo da floretin tjera makrofage prema fenotipu s manje upale i ublažava neuroupalu u eksperimentalnom modelu autoimunog encefalomijelitisa (EAE). Sekvenciranje RNA i funkcionalni eksperimenti identificirali su put Nrf2 kao središte i pokretač ovog zaštitnog fenotipa makrofaga induciranog floretinom. AMPK-ovisna aktivacija mehanizma autofagije i naknadna SQSTMl/p62-posredovana (u daljnjem tekstu p62) razgradnja Keapla, adaptera koji olakšava proteasomalnu razgradnju Nrf2, utvrđeno je da je u osnovi aktivacije Nrf2 u makrofagima. Ovi nalazi pokazuju da se floretin može koristiti u terapijskim strategijama za neuroupalne poremećaje.

Metode

Antitijela i kemijski reagensi

floretin(Sigma Aldrich) otopljen je u 50 mM KOH do 15 mM osnovne otopine i pohranjen na -20 stupnjeva. Daljnja razrjeđenja su napravljena u mediju RPMI1640 (Gibco). Za in vivo tretman, floretin je otopljen u 1 N NaOH, nakon čega je pH ponovno podešen na 7,2 s 1 N HCL, a otopina je dalje razrijeđena u fiziološkoj vodi da se dobije koncentracija od 50 mg/kg. BML-275（1 μM, Santa Cruz Biotechnology） dodan je 1 sat prije tretmana floretinom kako bi se inhibirala aktivacija AMPK. Bafilomicin A1（BAF, 0,1 μM, InvivoGen） dodan je 2 sata prije sakupljanja kako bi se blokirala fuzija autofagosoma i lizosoma. Lipopolisaharid (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) korišten je za stimulaciju stanica za fenotipizaciju upale. Phorbol 12-miristat 13-acetat (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) korišten je za induciranje proizvodnje ROS-a. Za Western blot korištena su sljedeća protutijela: mišji anti- -aktin (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), mišji anti-GAPDH (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), zečji anti-AMPK (1:1000;5831S, tehnologija stanične signalizacije), zečji anti-fosforilirani AMPK (1:1000; 2535S, tehnologija stanične signalizacije), zečji anti-LC3 (1:1000; L7543, Sigma-Aldrich), zečji anti-p62 (1:1000; 23214, tehnologija stanične signalizacije). Za imunofluorescenciju su korištena sljedeća protutijela: štakorska anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), štakorska anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), zečja anti-LC3 (1:1000 ;L7543, Sigma-Aldrich), zečji anti-p62 (1:500;23214, Cell Signaling Technology), zečji anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig, Proteintech Europa), zečji anti-TMEM119(1 :100, ab209064, Abcam). Odgovarajuća sekundarna antitijela kupljena su od Invitrogena.

Miševi

Divlji tip (WT) C57BL/6JOlaHsd miševi kupljeni su od Enviga. Životinje su hranjene redovnom hranom i smještene u objektu za životinje Biomedicinskog istraživačkog instituta Sveučilišta Hasselt. Svi pokusi izvedeni su prema institucionalnim smjernicama i odobrilo ih je etičko povjerenstvo za pokuse na životinjama Sveučilišta Hasselt.

Kultura stanica

Dobiva se iz koštane sržimakrofagi(BMDM) izolirani su iz WT i Nrf2 nokautiranih (KO) C57BL/6JOlaHsd miševa, kupljenih od Enviga i osiguranih od strane RIEN BRC prema MTA prof. S. Kerdine-Römeru [27,28]. BMDM su dobiveni kako je prethodno opisano [29]. U kratkim stanicama koštane srži tibije i bedrene kosti iz 12-tjedno starih WT i Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd miševa uzgajane su u 10-cm Petrijevim pločama u koncentraciji od 10×106 stanica/ ploča, u mediju RPMI1640 s dodatkom 10 posto fetalnog telećeg seruma (FCS, Gibco), 50 U/ml penicilina (Invitro-gen), 50 U/ml streptomicina (Invitrogen) i 15 posto L929-kondicioniranog medija (LCM ). Nakon diferencijacije, BMDM su odvojeni na 37 stupnjeva s 10 mM EDTA u PBS (Gibco) i uzgajani (0,5 × 10 stupnjeva stanica/ml) u RPM1640 dopunjenom s 10 posto FCS, 50 U/ml penicilina, 50 U/ml streptomicina i 5 posto LCM ( 37 stupnjeva C, 5 posto CO2). Kulture mikroglije izolirane su iz mozgova postnatalnih P1-3 C57BL/6/OlaHsd mladunaca. Nakon što su moždano deblo, horoidni pleksus i moždane ovojnice uklonjeni, mozgovi su mehanički disocirani i enzimski digestirani 15 minuta s 1x tripsinom (Gibco) na 37 stupnjeva. Nakon toga, stanična suspenzija je zasijana u DMEM mediju s visokim sadržajem glukoze (Sigma) dopunjenom s 30 posto LCM, 10 posto FCS, 50 U/ml penicilina i 50 U/ml streptomicina u T75 bocama kulture. Dva do tri dana kasnije izvršena je potpuna promjena medija. Mješovite kulture glije su protresene (230 okretaja u minuti, 3 h, 37 stupnjeva) nakon 6-7 dana kako bi se dobile čiste kulture mikroglije.

Sekvenciranje RNA

Stanice su prethodno tretirane floretinom (50 µM) tijekom 20 sati i stimulirane LPS-om (100 ng/ml) tijekom 6 sati. Liza stanica provedena je korištenjem Qiazol Lysis reagensa (Qiagen). RNA je ekstrahirana iz stanica pomoću RNeasy mini kita (Qiagen). Uzorke je zatim obradio Genomics Core Leuven (Belgija). Priprema biblioteke obavljena je pomoću Lexogenovog kompleta QuantSeq za generiranje biblioteka kompatibilnih s Illuminom. Biblioteke su sekvencirane na Illumina HiSeq4000 sustavu za sekvenciranje. Poravnanje s obzirom na spajanje izvedeno je sa STAR v2.6.1b[30]. Kvantifikacija očitavanja po genu provedena je s HT-seq Count v2.7.14. Analiza diferencijalne ekspresije temeljena na brojanju učinjena je pomoću R-based (The R Foundation for Statistical Computing, Beč, Austrija) Bioconductor paketa DESeq2. Popis različito izraženih gena odabran je na ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Kvantitativna reverzna transkripcija PCR

Stanice su prethodno tretirane floretinom（50 μM） 20 sati i stimulirane LPS-om (100 ng/ml) 6 sati. Liza je provedena pomoću Qiazol Lysis reagensa (Qiagen). RNA je ekstrahirana korištenjem RNeasy mini kita (Qiagen). Koncentracija i kvaliteta RNA određene su Nano-drop spektrofotometrom (Isogen Life Science). Sinteza cDNA provedena je korištenjem Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) prema uputama proizvođača. qPCR je izveden na StepOne-Plus" Real-Time PCR sustavu (Applied Biosystems) korištenjem SYBR zelene mješavine koja je sadržavala 1× SYBR green (Applied Biosystems）, 0,3 μM primera (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNA i vode bez nukleaze Komparativna Ct metoda korištena je za kvantificiranje genske ekspresije Podaci su normalizirani na najstabilnije referentne gene ciklin A i hipoksantin fosforiboziltransferazu 1. Prajmer sekvence dostupne su na zahtjev.

Određivanje reaktivnih spojeva kisika

Stanice su prethodno tretirane floretinom (50 uM) 2 sata. Nakon toga, stanice su stimulirane s PMA (15 min, 100 ng/ml) i proizvodnja ROS je mjerena korištenjem fluorescentne sonde 2',7'-diklorodihidrofluorescein diacetata na 10 μM u PBS-u tijekom 30 minuta. Fluorescencija je mjerena korištenjem fluorescentnog čitača mikropločica FLUOstar optima (BMG Labtech, Ortenberg, Njemačka) (ekscitacija: 495 nm, emisija: 529 nm).

Mjerenja dušikovog oksida

Stanice su prethodno tretirane floretinom (50 µM) tijekom 2 sata. Nakon toga, stanice su stimulirane s LPS (24 h, 100 ng/ml). NO je neizravno praćen korištenjem kompleta za mjerenje Griess reagensa nitrita (Abcam). Ukratko, nitrat reagira sa sulfanilamidom i N-(1-naftil)etilen-diamin dihidrokloridom da proizvede ružičastu azo boju. Apsorbancija ovog azo derivata je zatim izmjerena na 540 nm upotrebom čitača mikropločica (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Stanice su tretirane floretinom（5{{10}} μM） i LPS（100 ng/ml) 1 h ili 24 h da se odredi aktivacija AMPK odnosno razine proteina p62, LC3 i Keapl. Stanice su lizirane upotrebom RIPA-pufera (150 mM NaCl, 1 posto Triton X-100, 0,5 posto natrijevog deoksikolata, 1 posto SDS, 50 mM Tris) i odvojene elektroforezom na natrijevom dodecil sulfatu u poliakrilamidnom gelu. Gelovi su prebačeni na PVDF-membranu (VWR) i mrlje su blokirane 1 sat u 5-postotnom goveđem serumskom albuminu u tris-puferiranoj fiziološkoj otopini koja sadrži 0,1 posto Tween-20(TBS-T). Membrane su ispitivane primarnim antitijelima preko noći na 4°C, isprane s TBS-T i inkubirane s odgovarajućim sekundarnim antitijelima obilježenim peroksidazom hrena 1 h na sobnoj temperaturi (RT). Imunoreaktivni signali detektirani su pojačanom kemiluminiscencijom (ECL Plus, Thermo Fisher) koristeći Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences).Gustoće traka određene su pomoću ImageJ.

Imunofluorescencija

Kriosekcije leđne moždine osušene su na zraku i fiksirane u ledeno hladnom acetonu 10 minuta na - 20 stupnjeva. Mišji BMDM-i uzgajani su na stakalcima i fiksirani u ledeno hladnom metanolu 10 minuta na -20 stupnjeva. Sekcije i BMDM blokirani su 30 minuta pomoću Dako proteinskog bloka (Agi-lent). Nakon toga su inkubirani preko noći na 4°C s primarnim protutijelima, isprani i inkubirani s odgovarajućim sekundarnim protutijelima 1 h na sobnoj temperaturi. Slike tkiva leđne moždine snimljene su mikroskopom Nikon Eclipse 80i (10× objektiv) i NIS Softver Elements BR 3.10 (Nikon). Slike BMDM-ova obojenih za p62, LC3 i Keapl snimljene su konfokalnim mikroskopom Zeiss LSM 880 i korigirane su Airyscan (63× objektiv).P62-i LC3- pozitivne točke određene su poluautomatiziranom analizom puncta imageJ. Ukratko, nakon što je slika binarna i stanice odabrane ručno, točke su analizirane po ćeliji. Kolokalizacija P62 i Keapl izvedena je pomoću cjevovoda kolokalizacije u softveru CellProfiler [31 Slike prikazane na slikama su digitalno poboljšane.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, terapijski postav). Miševi su svakodnevno vagani i ocjenjivani na neurološke znakove bolesti prema proizvođačevom vodiču za ocjenjivanje EAE miševa:0:nema kliničkih simptoma,0.5:vrh repa je mlohav, 1:mlakav rep , 1.5: mlohav rep i inhibicija stražnjih nogu 2: mlohav rep i slabost stražnjih nogu, 2.5: mlohav rep i povlačenje stražnjih nogu, 3: mlohav rep i potpuna paraliza stražnjih nogu, 3.5: mlitav rep i potpuna paraliza stražnjih nogu noge i miš se ne mogu uspraviti kada se stave na bok,4: paraliza dijafragme, 5: smrt od EAE.

Statistička analiza

GraphPad Prism korišten je za statističku analizu podataka, koji su predstavljeni kao srednja vrijednost±sem D'Agostino, a Pear-sonov omnibus test normalnosti korišten je za testiranje normalne distribucije. Dvostrani nespareni Studentov t-test (s Welchovom korekcijom ako je potrebno) korišten je za normalno distribuirane podatke. Mann-Whitneyeva analiza korištena je za podatke koji nisu prošli test normalnosti.p-vrijednosti<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Rezultati

Transkripcijske promjene povezane s liječenjem makrofaga floretinom

Kako bismo utvrdili potencijalne protuupalne učinke i identificirali temeljne mehanizme liječenja floretinom na makrofagima, izvršili smo masovno sekvenciranje RNA (dodatna slika 1). Analiza puta aktiviranih makrofaga tretiranih floretinom pokazala je da su različito izraženi geni bili previše zastupljeni u kanonskim putovima koji se odnose naupala, kao što je iNOS(z-rezultat:-2.449), naplatni receptor (z-rezultat:-2.236), interferonska signalizacija (z-rezultat:- 2), i put odgovora akutne faze (z-rezultat: - 1.633) (Slika 1A, B). Slično analizi kanonskog puta, uzvodna analiza podataka RNA-seq predvidjela je da floretin smanjuje aktivaciju ključnih proupalnih regulatora transkripcije kao što su IRF7 (z-rezultat: 2,229), IRF1 (z-rezultat: -2). 025) i STAT1(z-rezultat:-2.022)(Slika 1D). Pored regulacije proupalnih puteva makrofaga, RNA-seq analiza makrofaga tretiranih floretinom pokazala je da je, između ostalih putova, floretin snažno aktivirao put Nrf2 (z-rezultat: 1,897), što dokazuje pojačana regulacija Nrf2-povezanog geni kao što su mafG i proxy (slika 1A, C). Čak štoviše, Nrf2 (NFE2L2) identificiran je kao najaktivniji uzvodni transkripcijski regulator (z-rezultat: 2,801), a regulacija razina ROS-a identificirana je kao jedna od najviše reguliranih bioloških funkcija u BMDM-ovima tretiranim floretinom (z-rezultat: 2,008 )(Slika 1D, E). Zajedno, nalazi pokazuju da floretin aktivira Nrf2 i potiskuje upalni fenotip makrofaga.

Nrf2 put kontrolira fenotip makrofaga tretiranih floretinom

Zatim smo potvrdili protuupalni učinak floretina i odredili modulira li upalni fenotip makrofaga djelovanjem na Nrf2. Smanjene razine ROS-a primijećene su u WT BMDM-ovima tretiranim floretinom stimuliranim s PMA (Slika 2A). Štoviše, smanjena proizvodnja NO i razine mRNA proupalnih gena NOS2, I-6, COX2 i I-12 uočene su u WT BMDM-ovima tretiranim floretinom stimuliranim s LPS-om (Slika 2B, C). U odnosu na ključnu ulogu Nrf2 u induciranju manje upalnog fenotipa, naši podaci pokazuju da floretin aktivira Nrf2-gene odgovora HO1 i NQO1 u WT, ali ne i Nrf2 KO BMDM-ove stimulirane LPS-om (Slika 2D). Nadalje, liječenje floretinom smanjilo je proizvodnju ROS-a u WT, ali ne i u Nrf2 KO BMDM (slika 2E). Osim kontrole antioksidativnih odgovora, Nrf2 navodno suzbija upalni fenotip makrofaga [12]. U prilog potonjem, floretin nije mogao smanjiti ekspresiju proupalnih gena NOS2, IL-6, COX2 , i IL-12 u aktiviranim BMDM-ovima s nedostatkom Nrf2- (Slika 2F). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da Nrf2 pokreće upalni fenotipski pomak makrofaga posredovan floretinom.

Floretin potiče aktivaciju AMPK

Phloretin je dobro definiran inhibitor GLUT-a i nedavne studije naglašavaju važnost unosa glukoze posredovanog GLUT-om za aktivaciju makrofaga [26,32]. Stoga smo utvrdili može li floretin aktivirati energetski senzor AMPK, koji se aktivira pri niskim razinama energije/glukoze. Naši rezultati pokazuju da liječenje floretinom dovodi do fosforilacije i aktivacije AMPK (Slika 3A, B). Štoviše, dodavanje inhibitora AMPK BML-275 u velikoj mjeri sprječava aktivaciju AMPK u BMDM-ovima tretiranim floretinom (Slika 3A, B). Štoviše, naši nalazi pokazuju da je aktivacija AMPK ključna za floretin za suzbijanje proizvodnje ROS-a, kao što pokazuju više razine ROS-a u BMDM-ima tretiranim i floretinom i inhibitorom AMPK-a u usporedbi s BMDM-ima tretiranim samo floretinom (Slika 3C). Ukupno, naši podaci sugeriraju da je aktivacija AMPK izazvana floretinom presudna za usmjeravanje makrofaga prema fenotipu s manje upale.

Floretin stimulira autofagiju na način ovisan o AMPK

Budući da je aktivacija AMPK povezana s aktivacijom kataboličkih procesa kao odgovor na nedostatak hranjivih tvari [33], zatim smo istražili može li floretin aktivirati autofagiju. Autofagija je očuvani katabolički proces koji je izazvan gladovanjem i drugim odgovorima na stres, koji potiče lizosomalnu degradaciju unutarstaničnog tereta izdvojenog u vezikulama koje se nazivaju autofagosomi. RNA-seq analiza predvidjela je autofagiju kao jedan od nizvodnih bioloških procesa koji pokazuje povećanu aktivnost u BMDM-ovima tretiranim floretinom (z-rezultat: 0.779) (Slika 4A). Štoviše, imunocitokemijska analiza BMDM-ova tretiranih floretinom i inhibitorom autofagije bafilomicinom Al pokazala je povećanu akumulaciju markera autofagije MAP1LC3/LC3 (protein 1 lakog lanca 3 povezanog s mikrotubulama) i p62 u usporedbi s BMDM-ovima tretiranim bafilomicinom A1- (slika 4B-D), što ukazuje na povećani autofagijski protok nakon liječenja floretinom [34]. Nakon indukcije autofagije, LC3 se pretvara iz LC3I oblika u lipidirani LC3I oblik, što korelira s brojem autofagosoma. U skladu s tim, više razine proteina LC3II i p62 određene su u BMDM stimuliranim floretinom western blotom (Slika 4E, F). Zanimljivo je da je ovo povećanje p62 i LC3II pomoću floretina spriječeno tretiranjem BMDM-a inhibitorom AMPK BML-275 (Slika 4E-F). Zajedno, naši podaci pokazuju da floretin stimulira autofagiju na način ovisan o AMPK.

Floretin aktivira put Nrf2 putem degradacije Keap1 posredovane autofagijom

Naši podaci pokazuju da floretin aktivira Nrf2 i stimulira autofagiju u makrofagima. Zanimljivo je da se autofagijski receptor p62 može natjecati s Nrf2 za vezanje na Keapl, adapter koji olakšava ubikvitinaciju i razgradnju Nrf2 u normalnim uvjetima. Ova p62-posredovana disocijacija Keap1/Nrf2 stoga će spriječiti degradaciju Nrf2 i na kraju dovesti do aktivacije Nrf2 [35]. Iz tog razloga, utvrdili smo potiče li floretin interakciju p62/Keapl, čime aktivira Nrf2 put. Ovdje pokazujemo da floretin aktivira put Nrf2 kroz p62-posredovanu razgradnju Keapl u makrofagima. Korištenjem Airyscan konfokalne mikroskopije visoke razlučivosti u kombinaciji s analizom kolokalizacije, pokazujemo da floretin stimulira interakciju p62 i Keapl, kao što je prikazano povećanom vrijednošću parametra kolokalizacije (Pearsonov koeficijent) u BMDM-ovima tretiranim floretinom (Slika 5A). , B). Štoviše, naša otkrića pokazuju da su niže razine proteina Keapla prisutne u BMDM-ovima tretiranim floretinom, što potvrđuje razgradnju Keapla (Slika 5C). Kako bismo potvrdili da je razgradnja ovisna o autofagiji, dodali smo inhibitor autofagije bafilomicin A1 tretiranom floretinom BMDM-ovi. Zanimljivo je da je ovo smanjenje Keapla poništeno liječenjem bafilomicinom Al (slika 5C). Ovi rezultati su potvrđeni Western blotom, pokazujući smanjenje razine Keapl proteina u BMDM tretiranim floretinom što je spriječeno bafilomicinom A1 (Slika 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), floretin je smanjio ozbiljnost bolesti (slika 6B). Smanjena ozbiljnost bolesti kod životinja liječenih floretinom bila je usporedna sa smanjenom ekspresijom upalnih gena MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 i CXCL2 u leđnoj moždini (Slika 6C). Štoviše, smanjena količina F4/80t stanica pronađena je u leđnoj moždini životinja tretiranih floretinom (Slika 6E, F). Budući da i F4/80*mikroglija i F4/80* makrofagi doprinose neuroinflamaciji, dublja analiza je pokazala da je floretin značajno smanjio količinu F480 plus TMEMl19-

makrofaga u EAE miševa (dodatna slika 2 DF), dok je primijećen neznačajan trend prema smanjenju u F480 plus TMEMl19 plus mikroglija. U skladu s ovim nalazom, floretin je potisnuo proizvodnju upalnih medijatora u mikrogliji, ali je ta supresija bila manje izražena u usporedbi s makrofagima (dodatna slika 2 AC). Ovi nalazi sugeriraju da je poboljšanje EAE floretinom uglavnom potaknuto makrofagima. Osim smanjenja ekspresije upalnih gena, floretin je povećao ekspresiju protuupalnih i neurotrofnih čimbenika, tj. IL-4, CNTF i IGF-1 u leđnoj moždini EAE životinja (Slika 6D ). Ova otkrića snažno upućuju na to da floretin smanjuje ozbiljnost EAE bolesti vodeći makrofage prema fenotipu koji rješava bolest. U skladu s našim prethodnim nalazima in vitro, također smo otkrili povišeni Nrf2 signal-ling u CNS-u EAE životinja tretiranih floretinom, što je naznačeno povećanom ekspresijom mRNA Nrf2 i njegovih nizvodnih ciljeva NQO1 i GPX1 (Slika 6G). Sveukupno, ovi podaci pokazuju da floretin suzbija neuroinflamaciju u profilaktičkom i terapijskom okruženju. Nadalje, naša otkrića pokazuju da floretin može smanjiti neuroupalu potiskivanjem upalnih značajki makrofaga aktivacijom Nrf2.

Rasprava

U ovoj studiji pokazujemo da floretin tjera makrofage prema fenotipu s manje upale na način ovisan o Nrf2-. Utvrđeno je da AMPK-ovisna aktivacija autofagije i kasnija Keapl degradacija leži u osnovi Nrf2 aktivacije floretinom. Nadalje, potvrđujemo protuupalne učinke floretina u EAE modelu gdje smanjuje ozbiljnost bolesti i ublažava ovisne o makrofagimaneuroinflamacija.

Pokazali smo da floretin suzbija upalni fenotip makrofaga. Ovo je u skladu s nalazima Wei-Tien Changa i sur. koji je pokazao da floretin ima protuupalna svojstva u liniji stanica makrofaga [36]. Pokazujemo da indukcija ove promjene fenotipa ovisi o Nrf2. Nrf2 je glavni regulator antioksidativnih odgovora i poznato je da njegova aktivacija tjera makrofage prema protuupalnom fenotipu [1l, 12, 37]. Osim toga, nekoliko je studija definiralo da aktivacija Nrf2 smanjuje neuroupalu i neurodegeneraciju kod poremećaja središnjeg živčanog sustava [{{10 }}]. Međutim, iako naša otkrića pokazuju da je Nrf2 u osnovi promjene fenotipa makrofaga tretiranih floretinom, podaci sekvenciranja RNA pokazuju da su, među aktivacijom Nrf2, drugi putovi regulirani naviše. Konkretno, regulacija PPAR puta je od interesa zbog njegovih protuupalnih svojstava i međusobnog razgovora s Nrf2 [41-45]. Dodatno, budući da je floretin dobro definiran inhibitor GLUT-a i da je prebacivanje na glikolizu ključni metabolički događaj za aktivaciju makrofaga, promjene fenotipa također mogu biti djelomično izazvane izravnim metaboličkim učincima floretina na te transportere glukoze [46,47]. Potrebna su dodatna istraživanja kako bi se definirala važnost PPAR-a u aktivaciji Nrf2 izazvanoj floretinom i do koje mjere na imunomodulaciju izazvanu floretinom utječu izravne metaboličke promjene. Sveukupno, naša otkrića jasno pokazuju da aktivacija Nrf2 igra bitnu ulogu u promjeni fenotipa posredovanoj floretinom.

Naši nalazi pokazuju da je aktivacija Nrf2 floretinom posredovana aktivacijom AMPK. AMPK igra ključnu ulogu u obnavljanju homeostaze stanične energije u slučaju stresa koji iscrpljuje ATP što rezultira povećanim omjerom ADP:ATP, čime se uključuju alternativni katabolički putovi koji stvaraju ATP, dok se isključuju anabolički putovi koji troše ATP [48]. U skladu s tim, floretin je dobro dokazan inhibitor GLUT-a i snižava razinu glukoze u stanicama [49-51]. Nekoliko je studija pokazalo da aktivacija AMPK u makrofazima izaziva imunosupresivni fenotip, što potvrđuje naše rezultate koji pokazuju da je aktivacija AMPK ključna za floretin za smanjenje upale [52,53]. Naši su podaci također u skladu s prethodnim studijama u kojima je dokazano da floretin aktivira AMPK u drugim tipovima stanica uključujući adipocite i endotelne stanice [50, 54-56]. Floretin može neizravno aktivirati AMPK povećanjem AMP i snižavanjem razine ATP, budući da AMP i ATP alosterički stimuliraju odnosno inhibiraju aktivaciju AMPK [48, 57]. Unatoč tome, CaMKK, koji je kinaza uzvodno od AMPK, može potaknuti aktivaciju AMPK kao odgovor na povećane stanične razine Ca2 plus bez ikakve promjene u razinama AMP/ATP [58]. Osim toga, s obzirom na široku mrežu međudjelovanja između AMPK i uzlaznih i nizvodnih putova, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razjasnio temeljni mehanizam aktivacije AMPK izazvane floretinom.

Naši podaci sugeriraju da AMPK posredovana floretinom stimulira autofagiju u makrofagima. Kao što je gore spomenuto, aktivacija AMPK je samozaštitni proces koji ima za cilj vratiti energetsku ravnotežu stanice [48]. Iako niti jedna studija nikada nije pokazala da je floretin bio u stanju stimulirati fenotip makrofaga poticanjem autofagije, neke studije su ipak pokazale učinak floretina na puteve autofagije u stanicama raka i hepatocitima [59-61]. Štoviše, različite studije pokazuju da nizvodni katabolički procesi aktivacije AMPK mogu aktivirati autofagiju [60, 62, 63]. Zanimljivo je da je kao odgovor na izgladnjivanje glukoze, AMPK-posredovana autofagija inducirana fosforilacijom važnog inicijatora autofagije unc-51 poput kinaze koja aktivira autofagiju [64,65]. S obzirom na to, nagađamo da AMPK stimulira autofagiju za obnavljanje ATP-a iz staničnih komponenti kao odgovor na smanjenje glukoze izazvano floretinom. Međutim, gladovanje glukozom također može aktivirati autofagiju na način neovisan o AMPK [66-68]. Stoga su potrebna dodatna istraživanja kako bi se utvrdilo događa li se aktivacija autofagije floretinom i djelomično neovisno o AMPK.

Nedavne studije pokazale su važnost autofagije za pokretanje funkcionalnog fenotipa makrofaga. U ovom kontekstu, disregulacija autofagije u makrofagima je osobito povezana s pojavom ateroskleroze i neuroloških bolesti [69-72]. Ovdje pružamo vezu između liječenja floretinom, indukcije autofagije i aktivacije Nrf2 pokazujući da floretin potiče aktivaciju Nrf2 putem p62-posredovane degradacije Keap1. Donedavno se povećanje p62 puncta smatralo znakom smanjene autofagije jer se p62 razgrađuje u autofagosomima nakon aktivacije autofagije [34]. U vezi s tim, nakupljanje p62 povezano je s disfunkcijom autofagije u aterosklerotskim lezijama [73]. Međutim, ova je predodžba dovedena u pitanje posljednjih godina i sada se smatra da je p62 neophodan za formiranje autofagosoma i da povećanje razine p62 paralelno s povećanjem LC3Il puncta može biti znak indukcije autofagije [74]. Stoga, zajedno sa sposobnošću floretina da aktivira AMPK i njegovom poznatom ulogom u aktivaciji autofagije, naši rezultati sugeriraju da je akumulacija P62 i LC3 nakon tretmana bafilomicinom A1 u makrofagima stimuliranim floretinom uzrokovana povećanim autofagičnim protokom, a ne oštećenjem autofagija. Zanimljivo, Lee Y i sur. nedavno su pokazali da je, osim aktiviranja Nrf2, vezanje p62 na Keapl također uključeno u formiranje autofagosoma, što sugerira da je aktivacija autofagije posredovana floretinom izravno povezana s povećanom aktivnošću p62 s jedne strane, ali i s većom interakcijom Keapl-p62 s druge strane [ 75]. Keapl je adapter Cullin-3-temeljene ubikvitin ligaze koja tvori homodimer s Nrf2 u homeostatskim uvjetima, čime se potiče ubikvitinacija Nrf2 i proteasomalna degradacija [76]. Poremećaj Keapl-Nrf2 kompleksa dovodi do stabilizacije Nrf2 i translokacije u jezgru [77, 78]. Dobro je dokumentirano da do poremećaja ovog kompleksa dolazi bilo modifikacijom Keapl cisteinskih ostataka elektrofilnim molekulama, izravnom interakcijom malih molekula s Keapl-om ili razgradnjom Keapl-a posredovanom p62- [35]. Ying Y et al. sugeriraju izravnu interakciju floretina i Keapla na temelju in silico eksperimenata, što zatim dovodi do aktivacije puta Nrf2 u staničnoj liniji kardiomiocita [79]. Ovdje smo uspostavili dodatni mehanizam povezan s autofagijom kojim floretin aktivira Nrf2.

Korištenjem EAE modela ustanovili smo da floretin in vivo ublažava neuroinflamaciju. Naši podaci snažno upućuju na to da floretin poboljšava EAE suzbijanjem upalnog odgovora posredovanog makrofagima i aktiviranjem puta Nrf2. U drugim modelima bolesti, floretin je također pokazao neuroprotektivna i imunomodulacijska svojstva. Konkretno, utvrđeno je da floretin aktivira put Nrf2 u mozgu nakon cerebralne ishemije i smanjuje nakupljanje amiloida beta u modelu Alzheimerove bolesti štakora [80-84]. Floretin također može utjecati na druge imunološke stanice in vivo, jer je otkriveno da ovaj spoj inhibira aktivaciju T stanica i dendritičnih stanica in vitro [85, 86]. S obzirom da neuroinflamacija u EAE modelu nije čisto ovisna o makrofagima, bilo bi od interesa definirati u kojoj je mjeri smanjenje neuroinflamacije posredovano drugim imunološkim stanicama. S tim u vezi, iako naši podaci sugeriraju da poboljšanje EAE-a uglavnom pokreću makrofagi i manje ovisi o modulaciji mikroglije, potrebni su daljnji eksperimenti kako bi se razjasnilo u kojoj mjeri floretin utječe na mikrogliju u neuroupalnim bolestima. Sve u svemu, naša otkrića pokazuju da floretin smanjuje neuroupalu utječući na fenotip makrofaga, pokazujući terapeutski potencijal floretina za neuroupalne poremećaje.

Zaključci

Naša studija pokazuje da je floretin snažno imunomodulatorno sredstvo koje modulira upalna svojstva makrofaga u neuroupalnim poremećajima. Utvrđeno je da aktivacija puta Nrf2, posredovana aktivacijom autofagije ovisnom o AMPK-u i naknadnom degradacijom Keapl-a, pokreće ovu promjenu fenotipa. Stoga je floretin obećavajuće prirodno sredstvo koje se može koristiti za smanjenje upalnog opterećenja neuroupalnih bolesti kao što je MS.

Reference

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY, et al. Dihidromiricetin poboljšava stvaranje pjenastih stanica putem LXRalpha-ABCA1/ABCG1-ovisnog efluksa kolesterola u makrofagima. Biomed Pharmacother. 2018;101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q, et al. Antocijanini induciraju efluks kolesterola iz mišjih peritonealnih makrofaga: uloga receptora aktiviranog proliferatorom peroksisoma {gama}-jetreni X receptor {alfa}-ABCA1 put. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.1 074/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Kvercetin pojačava ekspresiju ABCA1 i efluks kolesterola kroz ap38-ovisan put u makrofagima. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Fiziologija pjenastih fagocita kod multiple skleroze. Acta Neuropathol Commun. 2018;6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Podskupine makrofaga i mikroglija u multiploj sklerozi. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Multipla skleroza: mehanizmi i imunoterapija. Neuron. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neuron.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, et al. Stearoil-CoA desaturaza-1 narušava reparativna svojstva makrofaga i mikroglije u mozgu. J Exp Med. 2020;217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Makrofagi koji fagocitiraju mijelin moduliraju autoreaktivnu proliferaciju T stanica. J Neuroinflamacija. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA, et al. Lipidi izvedeni iz mijelina moduliraju aktivnost makrofaga aktivacijom X receptora jetre. PLoS jedan. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T, et al. Mijelin mijenja upalni fenotip makrofaga aktiviranjem PPAR-a. Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.