Feniletanolni glikozidi iz Herba Cistanche poboljšavaju mikrookruženje hipoksičnog tumora i pojačavaju učinke oksaliplatina preko HIF‑1 signalnog puta
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG i JIANHUA YANG
Sažetak.
Karcinom jetre jedan je od najčešćih vrsta zloćudnih tumora i karakterizira ga visoka malignost, brza progresija, visok morbiditet i mortalitet. Zabilježeno je da oksaliplatin (OXA) ima izraženu učinkovitost protiv uznapredovalog raka jetre s podnošljivom toksičnošću. U čvrstim tumorima, hipoksična mikrookoliša potiče epitelno-mezenhimalni prijelaz (EMT), koji također može inducirati rezistenciju raka jetre na lijekove platine. HerbaCistanche (Cistanche tubulosa) često se koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini i feniletanoidni glikozidi iz HerbeCistanche(CPhG) su glavne aktivne komponente. Cilj ove studije bio je istražiti učinke CPhG-a na održivost, apoptozu, migraciju i invaziju stanica raka jetre. HepG2 stanice raka jetre podijeljene su u kontrolne, DMSO, CoCl2, OXA, OXA plus CoCl2 i CPhGs plus OXA plus CoCl2 skupine. Nakon toga, provedena je kvantitativna PCR reverzna transkripcija i Western blot analiza kako bi se odredile razine ekspresije faktora 1 inducibilnog hipoksijom (HIF-1), lizil oksidazi sličnog 2 (LOXL2) i gena i proteina povezanih s EMT-om (tj. E ‑kadherin i Twist), kako bi se istražili učinci CPhG na rak jetre. Rezultati su pokazali da CPhG mogu pojačati učinke OXA na rak jetre i inhibirati migraciju, invaziju i stopu apoptoze stanica raka jetre. Osim toga, liječenje CPhG-ima učinkovito je induciralo smanjenje HIF-1, LOXL2 i Twista te povećanje E-kadherina. Sadašnji nalazi pokazuju da su CPhG-ovi izazvali značajno povećanje osjetljivosti na OXA i supresiju EMT-a izazvanog hipoksijom u jetri
dobrobit cistanche: protivRak jetre
Uvod
Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 smrtnih slučajeva povezanih s rakom jetre do 2030. godine, a od novopotvrđenih slučajeva, oni u kontinentalnoj Kini činit će 46,6 posto.
Zabilježeno je da oksaliplatin (OXA) ima inhibitorne učinke na rast raka jetre s podnošljivom toksičnošću u kliničkim uvjetima. Ipak, ukupna učinkovitost terapije lijekovima na bazi platine ometana je rezistencijom tumorskih stanica (4). Dobro je poznato da rak jetre pokazuje manju osjetljivost na kemoterapiju u usporedbi s drugim vrstama raka. Otpornost raka jetre na više lijekova pridonijela je njegovoj otpornosti na brojne terapijske tvari (5). U prethodnoj studiji, Xie i Zhong (6) su izvijestili da HepG2 stanice pokazuju slabu osjetljivost na adriamicin, 5-fluorouracil i cisplatin u uvjetima hipoksije. Unatoč činjenici da su kemoterapijski agensi na bazi platine glavna opcija liječenja raka, među pacijentima postoji otpornost na te lijekove. Nadalje, prognoza bolesnika s karcinomom jetre ostaje loša (7,8). Do danas su uloženi veliki napori u istraživanje rezistencije na lijekove i poboljšanje osjetljivosti na lijekove kod pacijenata s rakom jetre.
U uvjetima hipoksije dolazi do revaskularizacije u stanicama raka, što može dovesti do epitelno-mezenhimalne tranzicije (EMT) i vaskularne mimikrije (VM). EMT i VM mogu naknadno potaknuti invaziju i udaljene metastaze. Štoviše, nagađalo se da EMT ima ulogu pokretačke snage za napredovanje raka (9). Uz to, čimbenici inducirani hipoksijom (HIF) uključeni su u stvaranje novih žila, energetski metabolizam, staničnu proliferaciju, invaziju i metastaze (10).
Protein lizil oksidaze (LOX) sličan 2 (LOXL2) član je obitelji LOX i usko je povezan s kovalentnim poprečnim povezivanjem kolagena i elastina, što može rezultirati fibrozom i ključno je za integritet izvanstaničnog matriksa ( 11). U prethodnoj studiji smatralo se da je LOXL2 usko povezan s metastazama stanica raka (12). Nadalje, pokazalo se da LOXL2 modulira patogenezu i progresiju brojnih tipova zloćudnog raka kroz izvanstanične i unutarstanične putove, što su bili važni pokazatelji za procjenu loše prognoze (13,14).Herba Cistancheje tonik biljka koja se obično koristi u pustinjskim regijama, a često se koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini (15,16).Cistanche tubulosa(C. tubulosa)je prirodni biljni lijek koji se obično sadi u autonomnoj regiji Xinjiang. Feniletanoidni glikozidi iz Herba Cistanche (CPhG) služe kao jedna od glavnih aktivnih komponenti Herba Cistanche. Prethodno su Hu i suradnici (17) naznačili da CPhG mogu ublažiti ozljedu jetre kod miševa s H22 tumorom i inhibirati rast stanica raka. Predloženo je da bi temeljni mehanizam mogao biti povezan sa smanjenjem serumskog ‑fetoproteina i da bi mogao poboljšati imunitet kod miševa.
U ovoj studiji, hipoksični model HepG2 stanica raka jetre induciran je pomoću CoCl2. Na temelju toga, cilj ove studije bio je istražiti učinke OXA na proliferaciju, apoptozu, migraciju i invaziju stanica raka u prisutnosti CPhG u hipoksičnim uvjetima. Osim toga, otkrivene su razine ekspresije mRNA i proteina HIF-1, LOXL2, E-kadherina i Twista. Štoviše, istraženi su točni mehanizmi koji leže u pozadini učinaka CPhG-a na patogenezu raka jetre.
dobrobit ekstrakta cistanche: liječenje raka jetre
Materijali i metode
Stanična linija. Stanična linija raka jetre HepG2, identificirana korištenjem STR metode, osigurana je od strane kliničke istraživačke ustanove, prve pridružene bolnice medicinskog sveučilišta Xinjiang (Urumqi, Kina). Stanice su uzgajane u DMEM s visokim sadržajem glukoze (HyClone; Cytiva) koji je sadržavao 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS; Hyclone; Cytiva) na 37˚C u inkubatoru koji je sadržavao 5 posto CO2.
Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >80 posto, među kojima je sadržaj ehinakozida i verbaskoze bio 44,5 odnosno 16,1 posto. Stabljike C. tubulosa (Schrenk) Wight sakupljene su u listopadu 2016. iz Xinjianga u Kini. Biljku je identificirao dr. Junping Hu. Svi ovi uzorci vaučera (br. 201610) pohranjeni su u Plant Herbarium, School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Xinjiang, Kina.
Eksperimentalni dizajn. HepG2 stanice (5x104/ml) tretirane su različitim koncentracijama CPhG (5, 25, 50, 100, 200 i 500 µg/ml) 48 h na 37˚C (24 h nakon nasađivanja) do probira CPhGs‑L/M/H doze. HepG2 stanice (5x104/ml) podijeljene su u sljedeće skupine: i) kontrolna skupina, uzgojena u DMEM s visokim sadržajem glukoze; ii) DMSO skupina, uzgojena u 0,1 postotnom DMSO (v/v); iii) CoCl2 skupina (skupina modela hipoksije), uzgojena u DMEM bez seruma koji sadrži 100 µM CoCl2; iv) OXA
skupina (pozitivna kontrolna skupina), uzgojena u 5 µM OXA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.); v) OXA plus CoCl2 skupina, uzgojena u 5 µM OXA u kombinaciji sa 100 µM CoCl2; i vi) CPhGs skupine, tretirane s CPhGs-L/M/H (25, 50 i 100 µg/ml, redom) u kombinaciji s 5 µM OXA i 100 µM CoCl2.
Test viabilnosti stanica. Viabilnost stanica određena je pomoću testa Cell Counting Kit-8 (CCK-8) u skladu s uputama proizvođača (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) i kako je prethodno opisano (18). Stanice (20x103 stanica/jažici) su nasađene u ploče s 96 jažica. Nakon toga, ~24 sata nakon nasađivanja, stanice su tretirane 48 sati u skladu s uvjetima tretmana u svakoj skupini. Medij je zatim zamijenjen sa 100 µl DMEM s visokim sadržajem glukoze, nakon čega je uslijedilo dodavanje 10 µl reagensa CCK-8; stanice su inkubirane 1 sat na 37˚C. Optička gustoća izmjerena je pomoću čitača mikropločica s više detekcija (Thermo Fisher Scientific, Inc.) na 450 nm. Za svaki uvjet pripremljeno je šest ponavljanja.
Određivanje stope apoptoze. Brzina apoptoze određena je korištenjem pribora za otkrivanje apoptoze Annexin V/PI (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). HepG2 stanice (5x105) inokulirane su u ploče sa 6 jažica na 37˚C u 5 posto CO2. Nakon toga, ~24 sata nakon tretmana, stanice su uzgajane u DMEM bez seruma tijekom 4 sata. Stanice su zatim digestirane pomoću 0,25 posto tripsiniziranog (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), nakon čega su uslijedila najmanje tri ispiranja prethodno ohlađenim PBS-om. Nakon centrifugiranja na 167,7 xg tijekom 5 minuta na 4˚C, stanice su resuspendirane s 1X puferom za vezanje i koncentracija je podešena na 1~5x106/ml, a zatim obojena s 5 µl Annexin V‑FITC i 5 µl PI tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Stanice su potom podvrgnute protočnoj citometriji pomoću protočnog citometra BD LSRFortessa (BD Biosciences) i FlowJo
10.6.2 softver (Tree Star, Inc.).
Test zacjeljivanja rana. Inhibicijski učinci CPhG-a na migraciju stanica ispitani su testom zacjeljivanja rana (19). Stanice su nasađene u ploče sa 6 jažica dok nije dobiven 100 posto konfluentnog monosloja. Nakon toga, stanice su ranjene pomoću vrha pipete od 200 µl, isprane s PBS-om i inkubirane s tretmanima u mediju bez seruma. Nakon liječenja lijekom, izmjerena je brzina zacjeljivanja rana nakon 0, 12, 24 i 48 sati. Slike rana dobivene su pomoću fluorescentnog mikroskopa (Nikon Ti‑S, Japan) pod povećanjem od x10. Zatvaranje rane mjereno je udaljenošću rane u svakom razdoblju i izraženo kao postotak početne udaljenosti rane u 0 h.
Transwell testovi. Invazija stanica procijenjena je Transwell testovima. Stanice (1x105 stanica/ml) su suspendirane u 200 µl DMEM s visokim sadržajem glukoze bez FBS-a. Stanice su zatim nasađene u gornje jažice obložene Matrigelom prekrivene membranom filtera od polietilen tereftalata (veličina pora, 8,0 µm). Ukupno 500 µl DMEM s visokim sadržajem glukoze koji sadrži 10 posto FBS-a stavljeno je u donju komoru. Pamučni štapići korišteni su za uklanjanje stanica s gornje površine filtra nakon 48 h na 37˚C. Stanice koje su prodrle kroz membranu fiksirane su s 4 posto paraformaldehida 30 minuta. Nakon toga, stanice su obojene s 0,1 posto kristal violeta tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Invazivne stanice promatrane su pod fluorescentnim mikroskopom (Nikon Ti‑S) pri povećanju od x100.
Kvantitativni PCR obrnute transkripcije (RT-qPCR). Ukupna RNA ekstrahirana je iz HepG2 stanica korištenjem TRIzol® reagensa (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), a sinteza cDNA provedena je korištenjem kompleta reagensa PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.) prema protokolu proizvođača. qPCR je izveden na 7500 Real-Time PCR sustavu (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) koristeći TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) u skladu s protokolom proizvođača. Početnice korištene za qPCR navedene su u tablici I. Uvjeti PCR-a sastojali su se od denaturacije na 95˚C tijekom 30 sekundi, nakon čega je slijedilo 40 ciklusa denaturacije na 95˚C tijekom 5 sekundi i žarenja na 60˚C tijekom 30 sekundi. Konačno, rezultati amplifikacije analizirani su pomoću metode 2‑ΔΔCq (20).
Western blot analiza. Proteini su ekstrahirani iz stanica tretiranih 48 sati homogenizacijom u puferu za lizu RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) koji sadrži inhibitore proteaze i fosfataze. Sadržaj staničnih proteina određen je BCA metodom. Proteini (40 µg) su potom odvojeni pomoću SDS-PAGE na 10 postotnom gelu i prebačeni na PVDF membranu. Membrana je blokirana u 5 posto nemasnog mlijeka 1 h na 4°C i inkubirana sa sljedećim primarnim antitijelima: ‑aktin (1:5,000; kat. br. bs‑0061R; BIOSS), HIF –1 (1:1,000; kat. br. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; kat. br. ab179810; Abcam), E-kadherin (1:1,000 ; kat. br. bs-10009R; BIOSS) i Twist1 (1:500; kat. br. bs-2441R; BIOSS) preko noći na 4˚C. Membrana je zatim inkubirana s kozjim anti-zečjim IgG H&L sekundarnim protutijelima (1:2000; kat. br. ab205718; Abcam) 4 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s TBS-0,05 posto Tween-20, mrlje su vizualizirane pomoću Enhanced Chemiluminescence sustava (Amersham; Cytiva). Relativni intenzitet vrpci polu-kvantificiran je denzitometrijskom analizom pomoću softvera ImageJ2x (verzija 2.1.4.7; Rawak Software Inc.), a denzitometrijski grafikoni rezultata normalizirani su na intenzitet -aktina.
Statistička analiza. Za analizu podataka korišten je softver SPSS 19.0 (SPSS, Inc.). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija i analizirani su jednosmjernom ANOVA-om nakon koje je slijedio Tukeyev post hoc test. P<0.05 was="">smatra se da ukazuje na statistički značajnu razliku. Svi pokusi izvedeni su najmanje u tri primjerka.
Rezultati
Učinci CPhG na vitalnost stanica. HepG2 stanice su tretirane različitim koncentracijama CPhG (5, 25, 50, 100, 200 i 500 µg/ml) tijekom 48 sati (24 sata nakon nasađivanja). Kao što je prikazano na slici 1, postojao je značajan pad u održivosti stanica tretiranih s 200 i 500 µg/ml CPhG u usporedbi s onim u kontrolnoj skupini (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">
CPhG pojačavaju učinke OXA na rak jetre. Naknadno su procijenjeni učinci CPhG-a na vitalnost HepG2 stanica moduliranih OXA (slika 2). Nakon ~48 h, kombinacija CPhG i OXA značajno je smanjila održivost HepG2 stanica u usporedbi s onom u OXA plusCoCl2 skupina. Konkretno, CPhGs-M plus OXA plus CoCl2 i CPhGs-H plus OXA plus CoCl2 značajno su inhibirali održivost HepG2 stanica u usporedbi sa skupinom OXA plus CoCl2 (P<0.05 and=""><0.01,>
CPhG inhibiraju migraciju i invaziju stanica raka jetre. Za daljnje proučavanje invazivnog potencijala i migracijske sposobnosti stanica raka jetre nakon tretmana s CPhGs i OXA, provedeni su testovi zacjeljivanja rana i Transwell testovi. Ispitivanje zacjeljivanja rana pokazalo je da je, u usporedbi s onom u skupini koja je primala DMSO, migracija stanica HepG2 smanjena nakon tretmana s CoCl2, OXA i CPhG (200 ili 500 µg/ml) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">
Učinci CPhG i OXA na apoptozu. Nakon liječenja kombinacijom CPhG i OXA za
Nakon 48 h, HepG2 stanice su obojene aneksinom V-FITC i PI, nakon čega je uslijedila protočna citometrija za određivanje stanične apoptoze. Kao što je prikazano na slici 4A, skupine koje su liječene zajedno (CPhGs-L/M/H plus OXA plus CoCl2) pokazale su postupno povećanje udjela apoptotskih stanica s porastom koncentracije CPhGs. Većina stanica tretiranih CPhGs i OXA bila je lokalizirana u Q4 regiji, što ukazuje da je kombinacija CPhGs i OXA inducirala apoptozu u ranoj fazi. U usporedbi sa skupinom OXA plus CoCl2, značajno povećanje stope apoptoze stanica otkriveno je u skupinama liječenim OXA, CoCl2 i umjerenim ili visokim dozama CPhG (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">
mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; sl. 5A-D). Nasuprot tome, CoCl2 je izazvao značajno povećanje razina ekspresije mRNA LOXL2, HIF‑1 i Twista u usporedbi s onima u DMSOgrupa (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">
Razine ekspresije proteina HIF-1, LOXL2, E-kadherina i Twista nakon koinkubacije CPhGs i OXA. Rezultati Western blottinga otkrili su da su razine ekspresije proteina HIF-1, LOXL2 i Twist bile regulirane prema gore u uvjetima hipoksije u usporedbi s onima u skupini koja je primala DMSO. Po kontrastu,
razine ekspresije proteina E-kadherina bile su smanjene u uvjetima hipoksije (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">
Rasprava
Hipoksija je uobičajena značajka u mikrookruženju raka; ovo je uglavnom povezano s činjenicom da je proliferacijastanica raka brži je u usporedbi s vaskularnim stvaranjem aberantnih novožila. Osim toga, hipoksija utječe na druge biološke procese, uključujući proliferaciju, metastaze i osjetljivost na lijek (21). Tumorsko hipoksično mikrookruženje ključno je za patogenezu i progresiju raka, a također je važno u rezistenciji na lijekove i vaskularizaciji raka jetre (22).
U ovoj studiji, HepG2 stanice su tretirane različitim koncentracijama CPhG-a, među kojima su CPhG-ovi (200 µg/ml) mogli značajno inducirati smanjenje stanične vitalnosti. Naime, CPhG bi mogli modulirati staničnu održivost na način ovisan o dozi. Pod hipoksičnim uvjetima, kombinacija OXA i CPhG (50 ili 100 µg/ml) značajno je inhibirala održivost HepG2 stanica u usporedbi sa samim liječenjem OXA. Sličan trend ovisan o dozi primijećen je u testovima migracije i invazije stanica raka jetre. Trenutno su provedena opsežna istraživanja kako bi se istražila uloga apoptoze stanica raka u patogenezi bolesti jetre (23-26). Razvijeno je nekoliko strategija za liječenje raka jetre poticanjem apoptoze (27-29); dakle, uplitanje u
Apoptoza HepG2 stanica može poslužiti kao obećavajući kandidat za prevenciju i liječenje raka jetre. Apoptoza stanica HepG2 bila je značajno pojačana nakon tretmana kombinacijom CPhGs-M/-H i OXA u usporedbi s onom u stanicama tretiranim samo OXA-om. Stoga je naznačeno da CPhG mogu značajno pojačati antitumorske učinke OXA.
HIF-1 može povećati razinu ekspresije E-kadherina, N-kadherina i vimentina, kao i nekih faktora transkripcije, kao što su Snail1/2, Zeb1 i Twist1. Posljedično, to bi moglo dovesti do gubitka stanične polarnosti, labavljenja spojeva stanica-stanica, promjena u proteinu citoskeleta te migracije i invazije stanica raka, što bi moglo rezultirati translokacijom stanica raka u krvožilni sustav kroz bazilarnu membranu i naknadne metastaze (30). U ovoj studiji, CoCl2 je korišten za induciranje modela hipoksije, što je izazvalo povećanje vitalnosti HepG2 stanica, kao i migraciju i invaziju stanica. Nadalje, razine ekspresije mRNA i proteina HIF-1 značajno su povećane, što ukazuje da je CoCl2 inducirao stvaranje
hipoksična mikrookoliša. Liječenje kombinacijom CPhG i OXA značajno je inhibiralo razine ekspresije mRNA i proteina HIF-1 izazvane hipoksijom. Ovi nalazi upućuju na to da bi CPhGs mogli ublažiti mikrookruženje raka jetre na način ovisan o dozi.
E-kadherin je adhezijska molekula ovisna o Ca2 plus, koja ima ključnu ulogu u adheziji između stanica, održavanju cjelovitosti strukture tkiva i prijenosu signala. U slučajevima smanjene regulacije ili čak gubitka adhezijske funkcije, stanice raka mogu pokazivati nekontroliranu proliferaciju i dediferencijaciju, što može pospješiti povećanu invaziju stanica raka i naknadne metastaze (31). Osim toga, E-kadherin je ključan za inhibiciju EMT-a stanica raka, što je usko povezano s diferencijacijom, invazijom, metastazama i prognozom višestrukih zloćudnih bolesti epitela. EMT-inducirajući transkripcijski faktori (EMT-TF), kao što su Twist, Snail i Zeb, ključni su za EMT. Zabilježeno je da hipoksija aktivira signalne putove koji induciraju ekspresiju EMT-TF; posebno, mogao bi izravno promovirati EMT putem transkripcijske aktivacije ovih čimbenika (32). Zavoj je visoko očuvana spirala-prsten-heliks
transkripcijski faktor koji je nedavno identificiran posljednjih godina. Ekspresija visokog Twista otkrivena je u brojnim vrstama stanica raka (33). Stoga je bitno istražiti povezanost između Twist ekspresije i migracije ili metastaze stanica raka, kao i kliničku prevenciju i liječenje metastaza (34). U ovoj studiji otkriveno je da su razine ekspresije mRNA i proteina E-kadherina bile smanjene u prisutnosti hipoksije, dok su razine ekspresije mRNA i proteina Twista bile povišene. Ovi su nalazi bili u skladu s rezultatima testova invazije i migracije, koji su implicirali da hipoksija može pridonijeti pojavi EMT-a. Nakon tretmana s OXA-om, razine ekspresije proteina E-kadherina bile su smanjene; to je pokazalo da je OXA pokazao slabu učinkovitost u inhibiciji rasta stanica raka jetre, dok je mogao promovirati EMT. Međutim, u kombinaciji s CPhGs, osjetljivost HepG2 stanica na OXA pokazala je izrazito poboljšanje u prisutnosti hipoksije. Nadalje, zajedničko liječenje s CPhGs i OXA moglo bi inhibirati staničnu održivost, migraciju i invaziju HepG2 stanica. Ovo istraživanje samo je otkrilo
Twist i ekspresija E-kadherina; stoga se buduće studije nastoje usredotočiti na više markera povezanih s EMT-om, kako bi se procijenio inhibitorni učinak CPhG-a na EMT izazvan hipoksijom kod raka jetre.
Prijavljeno je da HIF‑1 potiče ekspresiju LOXL2 i pojačava migraciju i invaziju stanica raka jetre, što može biti usko povezano s lošom prognozom raka jetre (30). U prethodnoj studiji, razine ekspresije LOXL2 u susjednim tkivima raka jetre bile su izrazito povećane u usporedbi s onima u tkivima raka (35). Osim toga, bio je usko povezan s invazijom i metastazom raka jetre. Utišavanje gena LOXL2 pomoću male interferirajuće RNA inhibiralo je proliferaciju stanica HepG2 i SMCC‑7721, što je rezultiralo zaustavljanjem staničnog ciklusa stanica raka i povećanom apoptozom (36). Shao i suradnici (35) istraživali su korelaciju između LOXL2 u uzorcima raka jetre i kliničko-patoloških čimbenika, VM i prognoze među 201 slučajem koji su podvrgnuti operaciji za liječenje. Pretpostavlja se da LOXL2 ima važnu ulogu u patogenezi i napredovanju raka jetre, što može poslužiti kao meta za razvoj lijekova. Nadalje, Peng i suradnici (37) pokazali su da LOXL2 može aktivirati signalne putove Puž/E-kadherin i Src kinaza/Fokalna adhezijska kinaza, što može doprinijeti patogenezi i napredovanju EMT-a stanica raka želuca. U ovoj studiji, pod hipoksičnim uvjetima, razine ekspresije mRNA i proteina LOXL2 bile su povećane, dok je njegova ekspresija bila smanjena nakon tretmana s OXA. Nadalje, liječenje kombinacijom CPhGs i OXA rezultiralo je očiglednim smanjenjem ekspresije LOXL2, što može učinkovito pomoći antitumorskim učincima OXA na rak jetre.
Postoje neka ograničenja ove studije. Ova studija trebala je koristiti još dvije stanične linije raka jetre, uključujući staničnu liniju SMCC-7721, ali one se nisu mogle koristiti jer nije bilo moguće kupiti te stanične linije jer su bile pogrešno identificirane i izvedene su iz HeLa stanica. Osim toga, ova studija nije analizirala antioksidativne učinke različitih koncentracija CPhG u stanicama.
U zaključku, CPhG bi mogli mijenjati mikrookruženje hipoksičnog tumora stanica raka jetre modulacijom signalnog puta HIF-1. Osim toga, osjetljivost stanica raka jetre na OXA bila je značajno povišena kao odgovor na liječenje kombinacijom CPhGs i OXA. Ova otkrića mogu pružiti novu strategiju liječenja za poboljšanje osjetljivosti raka jetre na kemoterapiju.
Priznanja
Nije primjenjivo.
Financiranje
Ovu studiju poduprli su Xinjiang Key Laboratory of Natural Drug Active Components and Drug Release Technology (grant br. XJDX1713), projekt rezervnog kandidata za voditelja znanstvenih i tehnoloških inovacija u autonomnoj regiji Xinjiang Uygur (grant br. 2019XS14), Nacionalna zaklada za prirodne znanosti Kine (potpora br. 81860735) i Bethune Charitable
Zaklada „Bethune·Quest‑izgradnja kapaciteta za farmaceutska znanstvena istraživanja” (potpora br. B‑19‑H‑20200622).
Dostupnost podataka i materijala
Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tijekom trenutne studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Prilozi autora
LMW i JWZ izveli su pokuse, izradili rukopis i potvrdili autentičnost svih neobrađenih podataka. JPH i JHY osmislili su ovu studiju. Svi su autori pročitali i odobrili konačni rukopis.
Etičko odobrenje i pristanak za sudjelovanje
Nije primjenjivo.
Pristanak pacijenta za objavu
Nije primjenjivo.
Suprotstavljeni interesi
Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljenih interesa.
Reference
1. Hepatocelularni karcinom. Nat Rev Dis Primers 2: 16019, 2016.
2. Gingold JA, Zhu D, Lee DF, Kaseb A i Chen J: Genomsko profiliranje i metabolička homeostaza u primarnim karcinomima jetre. Trends Mol Med 24: 395-411, 2018.
3. McGuire S: Svjetsko izvješće o raku 2014. Ženeva, Švicarska: Svjetska zdravstvena organizacija, međunarodna agencija za istraživanje raka, WHO press, 2015. Adv Nutr 7: 418-419, 2016.
4. Gholamreza K, Jadidi‑Niaragh F, Jahromi AS, Zandi K i Hojjat‑Farsangi M: Mehanizmi otpornosti tumorskih stanica na trenutne agense ciljane terapije. Tumor Biol 37: 10021-10039, 2016.
5. Dong X i Mumper RJ: Nanomedicinske strategije za liječenje tumora otpornih na više lijekova: trenutni napredak. Nanomedicine (Lond) 5: 597-615, 2010.
6. Xie Y i Zhong DW: AEG-1 je povezan s kemorezistencijom hepatocelularnog karcinoma izazvanom hipoksijom putem reguliranja puta PI3K/AKT/HIF-1alpha/MDR-1. EXCL J 15: 745-757, 2016.
7. Xiong H, Ni Z, He J, Jiang S, Li X, He J, Gong W, Zheng L, Chen S, Li B, et al: LncRNA HULC pokreće autofagiju putem stabilizacije Sirt1 i smanjuje kemosenzitivnost HCC stanica. Oncogene 36: 3528-3540, 2017.
8. Gade TPF, Tucker E, Nakazawa MS, Hunt SJ, Wong W, Krock B, Weber CN, Nadolski GJ, Clark TWI, Soulen MC, et al: Ishemija izaziva mirovanje i ovisnost o autofagiji u hepatocelularnom karcinomu. Radiologija 283: 702-710, 2017.
9. Siegel RL, Miller KD i Jemal A: Statistika raka, 2017. CA Cancer J Clin 67: 7-30, 2017.
10. Dong LQ, Shen BQ i Ma Y: Napredak istraživanja mikrookruženja hipoksije u hepatocelularnom karcinomu. Zhong Guo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi 25: 1254-1258, 2018. (na kineskom).
11. Moon HJ, Finney J, Ronnebaum T i Mure M: Human lysyl oxidase-like 2. Bioorg Chem 57: 231-241, 2014.
12. Ferreira S, Saraiva N, Rijo P i Fernandes AS: Inhibitori LOXL2 i progresija raka dojke. Antioksidansi (Basel) 10: 312, 2021.
13. Philp CJ, Siebeke I, Clements D, Miller S, Habgood A, John AE, Navaratnam V, Hubbard RB, Jenkins G i Johnson SR: Unakrsno povezivanje izvanstaničnog matriksa pojačava rast fibroblasta i štiti od proteolize matriksa kod fibroze pluća. Am J Respir Cell Mol Biol 58: 594-603, 2018.
14. Galván JA, Zlobec I, Wartenberg M, Lugli A, Gloor B, Perren A i Karamitopoulou E: Ekspresija represora E-kadherina SNAIL, ZEB1 i ZEB2 tumorskim i stromalnim stanicama utječe na fenotip pupanja tumora i ukazuje na heterogenost stromalnih stanica kod raka gušterače. Br J Cancer 112: 1944-1950, 2015.
15. Gu C, Yang X i Huang L: Cistanches herba: neurofarmakološki pregled. Front Pharmacol 7: 289, 2016.
16. Fu Z, Fan X, Wang X i Gao X: Cistanches Herba: Pregled njegovih kemijskih, farmakoloških i farmakokinetičkih svojstava. J Ethnopharmacol 219: 233-247, 2018.
17. Hu Q, You SP, Liu T, Wang B, Liu X i Jiang Y: Istraživanje učinka cistanhe protiv raka jetre. Carcinog Teratog Mutagen 30: 194-199, 2018.
18. Mao J, Tian Y, Wang C, Jiang K, Li R, Yao Y, Zhang R, Sun D, Liang R, Gao Z, et al: CBX2 regulira proliferaciju i apoptozu putem fosforilacije YAP-a u hepatocelularnom karcinomu. J Cancer 10: 2706-2719, 2019.
19. Qin Y, Liu HJ, Li M, Zhai DH, Tang YH, Yang L, Qiao KL, Yang JH, Zhong WL, Zhang Q, et al: Salidrozid poboljšava mikrookruženje hipoksičnog tumora i poništava otpornost na lijekove platinskih lijekova putem HIF-1 signalni put. EBioMedicine 38: 25-36, 2018.
20. Livak KJ i Schmittgen TD: Analiza podataka o relativnoj ekspresiji gena korištenjem kvantitativne PCR u stvarnom vremenu i metode 2(-Delta Delta C(T)). Metode 25: 402-408, 2001.
21. Vaupel P: Fiziologija mikrookoliša tumora i njezine implikacije na radijacijsku onkologiju. Semin Radiat Oncol 14: 198-206, 2004.
22. Chen C i Lou T: Čimbenici inducirani hipoksijom u hepatocelularnom karcinomu. Oncotarget 8: 46691-46703, 2017.
23. Schwabe RF i Luedde T: Apoptoza i nekroptoza u jetri: Pitanje života i smrti. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 15: 738-752, 2018.
24. Kanda T, Matsuoka S, Yamazaki M, Shibata T, Nirei K, Takahashi H, Kaneko T, Fujisawa M, Higuchi T, Nakamura H, et al: Apoptoza i nealkoholne masne bolesti jetre. World J Gastroenterol 24: 2661-2672, 2018.
25. Pittala S, Kremlin Y i Shoshan-Barmatz V: Ciljanje na rak jetre i povezane patologije kod miševa s mitohondrijskim peptidom baziranim na VDAC1. Neoplasia 20: 594-609, 2018.
26. Jing ZT, Liu W, Xue CR, Wu SX, Chen WN, Lin XJ i Lin X: AKT aktivator SC79 štiti hepatocite od apoptoze posredovane TNF-om i ublažava oštećenje jetre izazvano d-Gal/LPS-om. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 316: G387-G396, 2019.
