Sadržaj fenolnih spojeva i genetička raznolikost na razini populacije diljem prirodnog područja rasprostranjenosti medvjetke (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) na Iberijskom poluotoku

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Sažetak:Medvjeđe grožđe (Arctostaphylos uva-ursi) je ljekovita biljka koja se tradicionalno koristi u liječenju infekcija mokraćnog sustava zbog visokog sadržajaarbutin(hidrokinon-D-glukozid), koji se sada uglavnom koristi kao prirodno sredstvo za izbjeljivanje kože u kozmetici. Medvjetka je također predložena kao prirodnaantioksidansaditiv zbog visokog sadržaja fenolnih spojeva u lišću. Proučavali smo varijacije fenolnih spojeva u 42 divlje populacije medvjeđeg grožđa, s ciljem razjašnjenja utječu li intrinzični biološki, klimatski i/ili geografski čimbenici na sadržaj fenola u njegovoj prirodnoj distribuciji na Pirenejskom poluotoku. Listovi medvjetke skupljani su tijekom jeseni tijekom trogodišnjeg razdoblja (2014. – 2016.) u populacijama diljem geografske širine i visinskog gradijenta. Ekstrakti metanola pokazali su širok raspon varijacija ukupnog sadržaja fenola i različite fenolne profile u odnosu naarbutin(razine ovog glavnog sastojka varirale su od 87 do 232 mg/g suhe mase), ali i sadržaja katehina i miricetina, na koje su utjecali geografski i klimatski čimbenici. Umjerene razine varijacija veličine genoma—procijenjene protočnom citometrijom—i na dvjema regijama plastidne DNA također su otkrivene među populacijama. Genetska i citogenetička diferencijacija populacija bila je slaba, ali značajno povezana s fitokemijskom raznolikošću. Elitni genotipovi medvjetke s višimantioksidanskapaciteti su naknadno identificirani.

Ključne riječi: arbutin; genetička i fitokemijska varijabilnost; veličina genoma; haplotipovi;prirodniantioksidansi

cistanche su prirodni antioksidansi

1. Uvod

Sinteza metabolita specijaliziranih za biljke varira u vremenu (tj. ontogeneza, fenologija i inducirana obrana) i prostoru, budući da igra ključnu ulogu u prilagodbi biljaka na uvjete okoliša, dok također genetske varijacije doprinose kemoraznolikosti [1]. Među tim spojevima, fenol ima raznolik niz mono- i polimernih struktura koje ispunjavaju širok raspon fizioloških uloga [2]. Na biosintezu specijaliziranih metabolita uvelike utječu čimbenici okoliša kao što su temperatura, oborine ili sunčevo zračenje, koji su zauzvrat često podvrgnuti latitudinalnim, longitudinalnim ili visinskim gradijentima. Konkretno, nakupljanje fenolnih spojeva opći je odgovor na povećane razine UV-B (280–315 nm) zračenja. Specifične varijacije spojeva zabilježene su u biljkama koje rastu u mediteranskoj regiji tijekom ljeta i na velikim nadmorskim visinama, gdje se javlja veća učestalost UV-B zraka, a cimetne kiseline i flavonoidi pokazuju najviše stope UVapsorpcije [3].

Arbutin(hidrokinon -D-glukozid) je jednostavan fenolni spoj s ograničenom pojavom u lišću nekih vrsta koje pripadaju rodovima kao što su Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus ili Vaccinium. Glavni prirodni izvor arbutina, medvjetka (Arctostaphylos uva-ursi ( L.) Spreng.) se stoljećima koristi za liječenje infekcija mokraćnog sustava i drugih bubrežnih bolesti [4], a biljni pripravci se pripremaju i danas [5]. Tijekom posljednjih godina, spektar primjenaarbutinproširio se, uglavnom kao prirodno sredstvo za izbjeljivanje kože u kozmetičkoj industriji [6] i u kliničkim terapijama zbog svojeantioksidans, antibiotska, protuupalna i antitumorska svojstva [7]. Posljedično, raste interes za pronalaženje dodatnih prirodnih izvoraarbutin, kao i biotehnoloških procesa koji mogu zamijeniti kemijsku sintezu [8,9]. U tom kontekstu, in vitro proizvodnja arbutina korištenjem staničnih kultura Datura inoxia dosegla je pilot razmjere [10].

Osim togaarbutin, drugi fenolni spojevi pridonose aktivnim svojstvima A. uva-ursi, kao što su flavonoidi i tanini [11,12], od kojih su katehin i korilagin najrelevantniji u lišću [13]. U prehrambenoj industriji prirodni spojevi kao biljni fenoli zamjenjuju se sintetskimantioksidanskonzervansi [14]. A. uva-ursi se koristi kao aditiv, posebno u mesnim proizvodima [15-19], ali iu aktivnom pakiranju [20]. Konačno, nedavno je predložen potencijal A. uva-ursi kao izvora sredstava za štavljenje za industriju kože [21].

U monografiji Europske agencije za lijekove "List medvjetke" [5] predloženo je najmanje 7 postoarbutinsadržaj u suhom lišću kao uvjet za biljne pripravke. Studije provedene tijekom proteklih desetljeća opisale su sadržaj arbutina u listovima medvjetke koji varira od 0 posto do 18 posto, što se objašnjava analitičkim postupcima, prirodnom varijabilnošću, uvjetima rasta i datumom berbe [4]. Sadržaj arbutina obično se određuje tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti [4,12,22–24], a prethodne studije otkrile su većearbutinSadržaji u biljkama medvjeđeg grožđa sakupljenim u jesen nego u onima sakupljenim u proljeće [4]. Opisani su različiti kemotipovi medvjeđeg grožđa, povezani s geografskom distribucijom i intraspecifičnom diferencijacijom u podvrstama A. uva-ursi. Najupečatljivija prijavljena fitokemijska varijacija je odsutnost arbutina u A. uva-ursi subsp. stipitata Packer i Denford, ali su navedene i razlike u sadržaju metil-arbutina, elaginske kiseline ili miricetina. Kvercetin je također prisutan u lišću medvjeđeg grožđa, u kojem su i aglikoni, kao i njihovi 3-O-glikozidi češći flavonoidi [4]. Međutim, većina ovih istraživanja provedena je prije nekoliko desetljeća, a danas se unutarvrsna varijacija medvjetke smatra kontinuiranom. 14 opisanih podvrsta, uključujući jednu iz Španjolske (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre, Alcaraz i MB Crespo), trenutno su neprihvaćena imena i sinonim za A. uva-ursi [ 25]. Stoga su potrebna nova istraživanja kako bismo unaprijedili naše znanje o spojevima koji su stvarno prisutni u sirovinama sakupljenima s različitih lokacija u industrijske svrhe budući da je opisano da kemijski profil lišća A. uva-ursi uključuje raznolik niz fenola, tanina, i flavonoide u novijim studijama koje su provedene kako bi se istražile razlike na međuvrsnoj razini [23,26,27].

Genetska (uključujući citogenetička) raznolikost na razini populacije potiče prilagodbu na različite uvjete okoliša [28]. Nedavno su pregledani učinci poliploidizacije na proizvodnju specijaliziranih metabolita u ljekovitom i aromatičnom bilju [29]. U ovom kontekstu, veličina genoma je parametar koji se često koristi u procjenama varijabilnosti biljaka, budući da se intraspecifične varijacije često otkrivaju ([30], i reference u njima), u korelaciji s mnogim drugim biološkim svojstvima i igraju relevantnu ulogu u evolucijskim procesima [31-35]. ]. Međutim, studije koje se bave vezom između količine nuklearne DNA (tj. veličine genoma) i fitokemijske raznolikosti vrlo su rijetke [36,37]. Odnos između fitokemijske i genetske raznolikosti procijenjen je korištenjem nuklearnih, ali posebno plastidnih DNA markera [38], osobito u medicinskim [39] i kultiviranim [40] biljnim vrstama.

Medvjeđe grožđe široko je rasprostranjeno po cirkumborealnom području, ali većina prikupljenih divljih populacija u Europi nalazi se u istočnim zemljama, Austriji, Švicarskoj, Italiji i Španjolskoj. Arctostaphylos uva-ursi raste u istočnom srednjem dijelu Španjolske, u planinama, u nadmorske visine u rasponu od 550 do 2350 m nadmorske visine (nm). Češći je na sjeveru jer su populacije smještene na nižim geografskim širinama rjeđe i obično imaju manje jedinki. Postojeće studije o varijabilnosti sadržaja arbutina u Španjolskoj odnosile su se na vrijednosti u rasponu od 8 posto u sjeveroistočnim populacijama [41] i 19 posto u španjolskom biljnom materijalu procijenjeno u studiji provedenoj u Njemačkoj [42]. Naša studija ima za cilj razjasniti čimbenike, uključujući veličinu genoma i genetsku raznolikost, koji objašnjavaju fitokemijske varijacije u prirodnoj rasprostranjenosti medvjetke u Španjolskoj. Naši rezultati mogli bi doprinijeti odabiru biljnog materijala za farmaceutsku, kozmetičku i prehrambenu industriju.

hrana za izbjeljivanje kože:CISATNCHE

2. Rezultati i rasprava

2.1. Analiza kemijske raznolikosti

Lišće medvjeđeg grožđa uzorkovano s ukupno 249 biljaka koje rastu na 42 španjolske lokacije, i kroz trogodišnje razdoblje, 2014. – 2016. (Slika 1, Tablica S1), pokazalo je različite postotke suhe težine (dr wt), u rasponu od 46,7 (LO) do 55,1 posto (CP), s prosjekom od 50,1 ± 2,7 posto (podaci nisu prikazani). Za određivanje sadržaja ukupnih fenola i arbutina korišteni su metanolni ekstrakti pripremljeni iz uzoraka prikupljenih 2014. i 2015. godine. Uočili smo širok raspon kontinuiranih varijacija za oba parametra sa značajnim razlikama (p < 0,001)="" među="" biljkama.="" ekstrakti="" lišća="" 80="" biljaka="" uzorkovanih="" u="" jesen="" 2014.="" (slika="" 2a)="" pokazali="" su="" ukupni="" sadržaj="" fenola="" u="" rasponu="" od="" 103,3="" ±="" 4,8="" mg="" gae/g="" suhe="" mase="" (uzorak="" li-4)="" do="" 206,4="" ±="" 6,5="" mg="" gae/g="" suhe="" mase="" (sr="" -2),="">arbutinsadržaji su varirali od 92.0 ± 3.0 mg/g suhe težine (AN-6) do 194,2 ± 5,6 mg/g suhe težine (SE-8). Analiza ekstrakata pripremljenih iz listova sakupljenih u 2015 od 94 biljke (Slika 2b) također je pokazala široku fitokemijsku varijaciju, od 110,5 ± 3,6 mg GAE/g dr wt(PI-4) do 200,9 ± 9,8 mg GAE/g suhe mase (LO-4) u ukupnom sadržaju fenola, dok se sadržaj arbutina kretao između 87,1 ± 0,4 mg/g suhe mase (ET-2) i 211,5 ± 5,9 mg/g suhe mase (LI -2). Nadalje, bez obzira na godinu sakupljanja, značajne razlike u ukupnim fenolima iarbutinsadržaji su otkriveni među biljkama medvjeđeg grožđa koje rastu na istoj lokaciji za većinu populacija (podaci nisu prikazani). Razine arbutina bile su u značajnoj korelaciji s ukupnim sadržajem fenola u ekstraktima lista medvjeđeg grožđa jer smo procijenili značajne Pearsonove koeficijente {{0}} 0,332 (p=0.003) za 2014. i 0,289 za podatke iz 2015. (p=0.005). Sadržaj arbutina u 48 biljaka uzorkovanih u obje godine nije značajno varirao (p=0.380).

Unatoč varijabilnosti utvrđenoj unutar populacija, i neovisno o godini berbe, analiza varijance pokazala je da sadržaj arbutina u ekstraktima lista medvjetke također ovisi (p < {{0}}.00="" 1)="" na="" populacijskoj="" lokaciji="" (slika="" 3a,b),="" kao="" što="" se="" dogodilo="" za="" ukupni="" sadržaj="" fenola="" u="" listovima="" medvjetke="" analiziranim="" u="" 2015="" (p="">< 0.001,="" slika="" 3b).="" nasuprot="" tome,="" značajne="" razlike="" u="" ukupnim="" sadržajima="" fenola="" nisu="" primijećene="" (p="0.080)" među="" 10="" populacija="" uzorkovanih="" 2014.,="" koje="" su="" bile="" smještene="" na="" relativno="" malom="" području,="" ali="" raspoređene="" u="" širokom="" rasponu="" nadmorske="" visine,="" od="" 424="" (ba="" stanovništvo)="" do="" 1410="" m="" n.m.(pa="" stanovništvo).="" ova="" varijacija="" u="" nadmorskoj="" visini="" povezana="" je="" s="" razlikama="" u="" klimatskim="" uvjetima="" (tablica="" s1),="" budući="" da="" su="" lokacije="" na="" većim="" nadmorskim="" visinama="" karakterizirane="" nižim="" srednjim="" temperaturama="" (pearsonov="" koeficijent="" korelacije,="" r="−0,666," p="">< 0,001)="" i="" višim="" godišnjim="" oborinama="" (="" r="0.485," p="">< 0,001),="" što="" je="" zauzvrat="" rezultiralo="" nižim="" globalnim="" razinama="" zračenja="" (r="−0,390," p="">< 0,001).="" nadalje,="" iz="" ovog="" skupa="" podataka="" procijenili="" smo="" nisku,="" ali="" značajnu="" pozitivnu="" korelaciju="" između="" godišnje="" količine="" padalina="" i="" ukupnog="" sadržaja="" fenola="" u="" biljkama="" medvjetke="" (spearmanov="" koeficijent="" rho="0.256," p="0.022)," dok="" je="" iz="" skupa="" podataka="" iz="" 2015.="" kada="" smo="" uzorkovali="" populacije="" na="" većem="" području,="" otkrili="" smo="" značajnu="" pozitivnu="" korelaciju="" između="" godišnje="" količine="" padalina="" i="" sadržaja="" arbutina="" (rho="0.246," p="0.017)." ova="" značajna="" korelacija="" pokazuje="" da="" su="" biljke="" medvjeđeg="" grožđa="" koje="" rastu="" na="" sjevernim="" mjestima="" i="" na="" relativno="" većim="" nadmorskim="" visinama="" često="" pokazivale="">arbutinsadržaj (rho=0.217, p=0.035 i rho=0.269, p=0.009, redom). Kao što je spomenuto, ovi viši sadržaji arbutina u značajnoj su korelaciji s višim ukupnim sadržajem fenola u listovima medvjetke, koji su bili slični (u prosjeku 154,4 ± 19,6 mg GAE/g suhe težine) onima koji se nalaze u vodenim ekstraktima drugih biljnih vrsta koje se koriste kaoantioksidansaditivi u prehrambenoj industriji [43], kao što je ružmarin (185.0 mg GAE/g suhe mase), čaj (149,3 mg GAE/g suhe mase), ili guava (154,4 mg GAE/g suhe mase). Ovi rezultati su u skladu s prethodnim referencama i potkrijepljeni su u studiji koju su proveli Wrona et al. [20] koristeći neke od uzoraka lišća španjolske medvjetke prikupljene 2015., za koje je višiantioksidanskapacitet je bio povezan s većimarbutinsadržaj. Elitni genotipovi medvjetke također se mogu identificirati za ovu svrhu, kao što su pojedinci 1, 4, 7 i 8 iz LO populacije, koji su akumulirali prosječno 183,3 ± 16,4 mg GAE/g suhe težine u dvije godine istraživanja.

Kako bismo dodatno razjasnili klimatske i geografske čimbenike koji utječu na obrasce fenolnih varijacija, izveli smo iscrpnije prikupljanje uzoraka u jesen 2016: 140 biljaka medvjetke koje rastu na 29 lokacija, i kvantificirali smo pet fenolnih spojeva (Slika S1a) koji su identificirani ko-elucijom sa standardima u gradijentu acetonitril/voda (Slika S1b). Analiza je pokazala široke raspone kontinuiranih varijacija sadržaja arbutina, kafeinske kiseline, katehina, miricetina i kvercetin glukozida, sa značajnim razlikama među biljkama koje su također općenito uočene unutar populacija (podaci nisu prikazani). Za glavne fenolne sastojke otkrili smo da se sadržaj arbutina kreće od 91,1 ± 5.0 (LB{{10}}) do 232,4 ± 2,8 mg/g suhe mase (PT{{15 }}), dok je sadržaj katehina bio u rasponu od 4,1 ± 0.1 (AF{{20}}) do 45,5 ± 1,4 mg/g suhe težine (LB-5). Što se tiče druga dva utvrđena flavonoida, miricetin nije otkriven u nekim biljkama iz nekoliko populacija, dok je dosegao 21,2 ± 1,2 mg/g suhe težine u PO{{30}}, a kvercetin glukozid varirao je od 3,8 ± 0,1 (CO -3) do 22,8 ± 0,8 mg/g suhe težine (BT-3). Niži sadržaj kavene kiseline utvrđen je u ekstraktima listova medvjetke, koji je varirao od 1,8 ± 0,0 (IZ-1) do 7,1 ± 0,3 mgBiljke/g suhe mase (SI-4).

Unatoč varijacijama uočenim među pojedincima, značajne razlike među populacijama također su procijenjene za ovih pet spojeva (Kruskal–Wallis testovi, p < {{0}}.001="" i="" p="0)." 009="" sadržaj="" forkafeinske="" kiseline).="" viši="" sadržaji="" arbutina="" utvrđeni="" su="" u="" prosjeku="" u="" biljkama="" iz="" ab,="" gu,="" ln="" i="" lo="" prirodnih="" populacija="" (slika="" 4a),="" koji="" se="" značajno="" razlikuju="" (nakon="" bonferronikove="" korekcije)="" od="" niskih="" sadržaja="" utvrđenih="" u="" biljkama="" iz="" lb="" populacije="" (186,7="" ±="" 22,3,="" 193,9="" ±="" 12,1,="" 169,5="" ±="" 10,0,="" odnosno="" 169,2="" ±="" 5,2="" mg/g="" suhe="" mase="" sprijeda="" do="" 111,8="" ±="" 16,0="" mg/g="" suhe="" mase).="">arbutinsadržaj biljaka koji je također uzorkovan u 2015 nije značajno varirao između godina (p=0.821). Populacija LB pokazala je zauzvrat višu srednju razinu katehina (Slika 4b), koja se značajno razlikovala od niskih srednjih sadržaja ovog flavonoida otkrivenog u populacijama AF i LC (32,8 ± 9,8 naprijed do 5,7 ± 1,9 i 5,3 ± {{2{{62} }}}.5 mg/g dr wt odnosno). Srednji sadržaj miricetina i kvercetin glukozida prikazan je na slici 4c, sa značajnim razlikama među populacijama AB, CG, LB i PO, s višim sadržajem miricetina (15,1 ± 4.0, 14,6 ± 5,7, 10 0,7 ± 2,8, odnosno 17,2 ± 3,9 mg/g suhe mase), u usporedbi s niskim razinama koje su akumulirane na prosječnim biljkama iz populacija CO i OD (1,2 ± 1,5 odnosno 2,4 ± 3,6 mg/g suhe mase) , a također znači da su se sadržaji kvercetin glukozida određeni u populacijama AA, BT, CP, IZ i LB (15,2 ± 3,7, 15,9 ± 4,6, 11,8 ± 2,3, 15,7 ± 3,4 i 13,1 ± 4,6 mg/g suhe težine, respektivno) značajno razlikovali od onog u populaciji CO (4.0 ± 0,1 mg/g suhe težine). Nasuprot tome, srednji sadržaj kafeinske kiseline oscilirao je od 2,1 ± 0,2 mg/g suhe težine u populacijama AB, CE, PT i SA do 3,5 ± 1,2 mg/g suhe težine u populaciji AF ili 3,4 ± 2,2 mg/g suhe težine u stanovništvo SI; stoga značajne razlike nisu primijećene zbog intrapopulacijskih varijacija (prosječni sadržaj 2,7 ± 0,8 mg/g suhe težine). Ovi rezultati nadopunjuju varijacije fenolnih metabolita koje su uočili Wrona et al. [20], za osam lokacija medvjeđeg grožđa uzorkovanih 2015. koje su analizirane pomoću tehnologije UPLC®-ESI-Q-TOF withMSE.

Za razliku od rezultata dobivenih analizom uzoraka medvjetke iz 2014. i 2015. godine,arbutinsadržaji određeni u 2{{10}}16 uzoraka pokazali su nisku, ali značajnu pozitivnu korelaciju sa zračenjem (rho=0.256, p=0.002) i maksimalnim srednjim temperaturama (rho{ {5}}.183, p=0.030), te su prema tome bile u obrnutoj korelaciji s godišnjim vrijednostima padalina (rho=−0.265, p=0.002). Te su razlike također povezane s varijacijama u nadmorskoj visini (rho=−0,192, p=0,023), ali ova negativna korelacija objašnjena je spomenutom niskomarbutinsadržaj biljaka iz LB populacije koje se nalaze na 1720m. Sličan obrazac varijacije primijećen je za sadržaj miricetina jer su više razine ovog spoja bile značajno povezane s biljkama medvjeđeg grožđa koje rastu na lokacijama s višim razinama zračenja (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}}07). Uzorak suprotan onom kod arbutina uočen je za katehin, jer je procijenjena pozitivna korelacija između ovog flavonoida i godišnje količine padalina (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1),="" a="" negativne="" korelacije="" u="" skladu="" s="" tim="" otkrivene="" su="" sa="" zračenjem="" i="" s="" maksimalnom="" srednjom="" temperaturom="" (rho="−0.307," p="">< 0,001="" i="" rho="−0,470," p="">< 0,001,="" odnosno).="" ova="" varijacija="" klimatskih="" čimbenika="" objasnila="" je="" da="" i="" nadmorska="" visina="" i="" širina="" utječu="" na="" sadržaj="" katehina="" u="" listovima="" medvjetke="" (rho="0,410" odnosno="" 0,490,="" p="">< 0,001).="" analiza="" glavnih="" komponenti="" provedena="" s="" fitokemijskim,="" klimatskim="" i="" zemljopisnim="" podacima="" koji="" odgovaraju="" 29="" lokacija="" uzorkovanih="" 2016.,="" u="" kojima="" su="" dvije="" prve="" komponente="" objasnile="" 60="" posto="" promatrane="" varijacije,="" potvrdila="" je="" ove="" rezultate="" (slika="" 5).="" nismo="" otkrili="" nikakvu="" značajnu="" korelaciju="" između="" sadržaja="" kavene="" kiseline="" ili="" kvercetin="" glukozida="" u="" biljkama="" medvjetke="" i="" klimatskih="" ili="" geografskih="" čimbenika,="" iako="" smo="" procijenili="" male,="" ali="" značajne="" korelacije="" između="" sadržaja="" miricetina="" i="" kvercetin="" glukozida="" (rho="0.184," str="" {{31}="" }.030)="" i="" između="" sadržaja="" miricetina="" i="" kavene="" kiseline="" (rho="−0.176," p="0.037)" biljaka="">

Uočeni kontrastni klimatski obrasci varijacija uarbutinSadržaj biljaka medvjetke sugerira da, iako je biosinteza ovog metabolita vjerojatno povećana u uvjetima većeg zračenja i temperature, vjerojatno je nedostatak vode ograničavajući faktor za A. uva-ursi u mediteranskim i južnim regijama. Del Valle i sur. [44] izvijestili su o geografskoj širini akumulacije flavonoida Silene littorea (Caryophyllaceae) u Španjolskoj, gdje su veći sadržaji flavonoida utvrđeni u južnim populacijama, budući da je geografska širina negativno korelirala s UV-B zračenjem i temperaturom, a pozitivno s oborinama. Globalno zračenje pokazuje jasan latitudinalni gradijent s većom učestalošću na jugu i istoku Pirenejskog poluotoka, a postoji i značajan orografski učinak budući da postojanost oblaka modulira učestalost ovog zračenja na većim visinama. Karta UV zračenja Španjolske [45] upućuje na visoku korelaciju (r > 0.9) između podataka o UV-B i globalnom zračenju. Prema ovoj referenci, populacije medvjeđeg grožđa koje su pokazale viši prosjekarbutinsadržaji u našoj studiji uglavnom se nalaze u područjima pod UV-B zračenjem od 2403–2451 J/m2.

Naši rezultati za varijaciju katehina u medvjetci pokazali su geografski obrazac (Slika 5) i slažu se sa studijama provedenim na drugim biljnim vrstama iz sjevernih zemalja Europe. Veći sadržaji specijaliziranih metabolita, kao što su flavonoidi i antocijanini, prijavljeni su u biljkama koje rastu na višim geografskim širinama, vjerojatno zbog duljih razdoblja dnevnog svjetla i nižih noćnih temperatura [46]. Prema tome, sadržaj topivih fenola u iglicama Juniperus communis povećavao se sa zemljopisnom širinom i nadmorskom visinom u finskim populacijama [47], a također je 10-19 posto veći sadržaj fenola pronađen na višoj zemljopisnoj širini u plodovima tri Ribes spp. kultivari analizirani na dvije finske lokacije [48]. Ovi autori povezuju niži sadržaj fenola s višim razinama zračenja i temperature. Sadržaj flavonoida u plodovima dviju vrsta Vaccinium (također iz obitelji Ericaceae) pokazao je geografski gradijent, s većim količinama flavonoida u sjevernim geografskim širinama [49,50].

U odnosu na visinske varijacije, više razine flavonoida utvrđene su u populacijama drugih vrsta Ericaceae, Calluna vulgaris, koje rastu na većim nadmorskim visinama [51]. Visinski gradijenti također su utjecali na specijalizirani metabolizam španjolskih populacija Arnice montana [52] i Quercus robur [53]. Potonji rad je ukazao na značajnu pozitivnu povezanost između koncentracije ukupnih fenola u listu i visine, budući da je gradijent ovisan samo o flavonoidima, što sugerira da ovi spojevi su doveli do odnosa za ukupne fenole. Ovi se rezultati slažu s našim procjenama za obrazac sadržaja katehina. Konačno, gradijent padalina bio je povezan sa značajnim razlikama u sastavu polifenola u afričkom ljekovitom grmu (Myrothamnus flabellifolia) za koje su metabolomske razlike bile u skladu s genetskom strukturom populacija [54].

CISTANCHE MOŽE SPREČITI STARENJE

2.2. Analiza podataka o veličini genoma i sekvenci

Vrijednosti veličine genoma 2C biljaka medvjetke bile su u rasponu od 2,50 do 3,15 pg (Tablica 1). Male razlike u količini nuklearne DNK pronađene su među populacijama (Kruskal–Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). Dunnov test s Bonferronijevom korekcijom otkrio je statistički značajne razlike između: AL i SI populacije (Z=−3,972, p=0.024), LE i SI (Z=−4,196, p {{ 21}}.009), i SE i SI (Z=−4.236, p=0.008). Populacija Pontilsa (PO) je tipsko nalazište A. uva-ursi var.crassifolius, koja je naknadno spojena kao A. uva-ursi subsp. crassifolius, koji se trenutno ne razmatra taksonomski (vidi uvod), ima srednju vrijednost (2,88 pg), unutar raspona vrijednosti dobivenih u drugim populacijama vrste. Ovo je prvo opsežno populacijsko istraživanje količine nuklearne DNA u vrsti i cijelom rodu budući da jedine dostupne informacije do danas dolaze iz jedne balkanske populacije istog taksona [55]. Tamo navedena vrijednost 2C, 2,49 pg, nalazi se upravo na donjoj granici raspona varijacije ovdje istraženog skupa podataka. Nije pronađena korelacija između vrijednosti veličine genoma i nadmorske visine populacije. Količina DNK pojedinaca pokazala je slabu pozitivnu značajnu korelaciju sarbutinsadržaj kada su uspoređeni podaci za 158 biljaka medvjetke (rho=0.187, p=0.018), dok nije pronađena nikakva druga značajna korelacija između veličine genoma i drugih varijabli. Ovaj je rezultat u skladu s prijavljenim povećanjem proizvodnje specijaliziranih metabolita koji se općenito opažaju u ljekovitim i aromatičnim biljkama nakon poliploidizacije [29].

Novoproizvedene sekvence za rpl{0}}trnL i psbE-petN međugenske razmaknice poredane su u dvije matrice (koje sadrže 566 i 874 bp) koje su spojene u jednu matricu od 1440 bp. Umjereno otkrivene su razine varijacije u ovim plastidnim regijama (šest nukleotidnih supstitucija i četiri indela). Pronađeno je deset različitih haplotipova s ​​ukupnom raznolikošću haplotipova (Hd) od 0.468 (Tablica 1). Većina populacija (21) sadržavala je samo jedan haplotip, dok je njih pet pokazalo određenu raznolikost među pojedincima. Najzastupljeniji haplotip 1 pokazao je najveću učestalost (71,4 posto), zatim haplotip 2 (15,2 posto), dok su ostali pokazali znatno niže učestalosti (0,04–0,01 posto). Zemljopisna distribucija haplotipova prikazana je na slici 6. Haplotip 1 pronađen je u 32 populacije — fiksiran je u njih 18 — raspoređenih u svim uzorkovanim regijama osim u najjužnijim lokalitetima. Haplotip 2 pronađen je u deset populacija i bio je isključivi haplotip u dvije najjužnije populacije (HU i LV) kao i u PR-u. Haplotip 4 bio je privatan iz triju populacija s Pirineja, dok se haplotip 8 pojavio u dvije populacije s istočnog Pirenejskog poluotoka. Što se tiče evolucijskih odnosa prikazanih u mreži štedljivosti (Slika 6), većina haplotipova povezana je s jednim ili dva koraka mutacije. Haplotip 1 zauzima središnje mjesto, sa sedam haplotipova povezanih s njim.

Mantelov test između pDNA genetske i kemijske parne matrice udaljenosti pokazao je slabu, ali značajnu korelaciju (r=0.301; p=0.048) između genetske diferencijacije i koncentracije pet kemijskih komponenti izmjerenih za skup podataka za 2016. Mantelov test nije otkrio nikakvu značajnu korelaciju između genetske i geografske udaljenosti među 25 populacija uzorkovanih 2016. (r=0.103, p=0.207) ili između kemijskih i geografskih parova udaljenosti između ovih 25 populacija (r=0.191, p=0.050). Ovdje prijavljena fitokemijska varijabilnost za divlje populacije medvjetke diljem Španjolske stoga je dopunjena umjerenim razinama varijacije haplotipa pDNA, budući da je genetska diferencijacija sjever-jug pronađena u populacijama medvjetke usporediva s filogeografskim uzorcima pronađenim u drugim biljkama (npr. [56-58]. Sva se ta homogenost očekuje u biljkama s niskom reproduktivnom sposobnošću [59], kao što je A. uva-ursi, koja pokazuje slabu stopu klijanja i visoku stopu smrtnosti mladih klijanaca [4]. Ipak, skromna genetska diferencijacija koju pokazuje pDNA korelirala je s biokemijskim udaljenosti po paru procijenjene iz profila pet fenolnih Slika 6. Zemljopisna distribucija pDNA haplotipova na iberskim populacijama Arctostaphylos uva-ursi. Šifre populacije odgovaraju onima u tablici S1, a tortni grafikoni predstavljaju postotak pojedinaca koji prikazuju svaki haplotip u svakoj populaciji. pravokutnik, statistička škrta mreža koja prikazuje evolucijske odnose te Zastupljeni su haplotipovi plastida pronađeni u populaciji A. uva-ursi. Svaka pruga duž linija koje povezuju haplotipove označava jedan mutacijski korak u pDNA regijama sekvenciranim u ovoj studiji. Mantelov test između pDNA genetskih i kemijskih parnih matrica udaljenosti pokazao je slabu, ali značajnu korelaciju (r=0.301; p {{28 }}.048) između genetske diferencijacije i koncentracije pet kemijskih komponenti izmjerenih za skup podataka za 2016. Mantelov test nije otkrio nikakvu značajnu korelaciju između genetske i geografske udaljenosti među 25 populacija uzorkovanih 2016. (r=0.103, p=0.207) ili između kemijskih i geografskih parnih udaljenosti između ovih 25 populacija ( r=0.191, p=0.050). Ovdje prijavljena fitokemijska varijabilnost za populacije divlje medvjeđe bobice diljem Španjolske stoga je dopunjena umjerenim razinama varijacije haplotipa pDNA, budući da je genetska diferencijacija sjever-jug pronađena u populacijama medvjetke usporediva s filogeografskim obrascima pronađenim u drugim biljkama (npr. [56-58]. Sva ta homogenost očekuje se u biljkama s niskom reproduktivnom sposobnošću [59], kao što je A. uva-ursi, koja pokazuje slabe stope klijanja i visoke stope smrtnosti mladih sadnica [4]. Ipak, skromna genetska diferencijacija koju pokazuje pDNA u korelaciji s biokemijskim udaljenostima parova procijenjenim iz profila od pet fenolnih spojeva. Ovaj obrazac genetske i fitokemijske varijacije (koja, kao što je spomenuto, nije bila povezana sa zemljopisnim udaljenostima), kao i slaba, ali značajna korelacija između veličine genoma i sadržaja arbutina, može ukazivati ​​na to da prirodna genomska varijabilnost utječe na prinos fenolnih spojeva u A. uva-ursi Međutim, hipervarijabilna molekularna m arkeri u opsežnijem uzorkovanju populacije potrebni su kako bi se potvrdili ovi filogeografski obrasci i povezanost između genetske i biokemijske varijabilnosti.

CISTANCHE IMA ANTIOKSIDACIJSKO DJELOVANJE

3. Materijali i metode

3.1. Biljni materijal

Za fitokemijsku analizu uzorkovano je ukupno 249 biljaka medvjeđeg grožđa koje rastu u 42 populacije u jesen 2014., 2015. i 2016., što je reprezentativno za prirodnu rasprostranjenost ove biljne vrste na Pirenejskom poluotoku (Slika 1 i Tablica S1). Prvo smo, u jesen 2014., prikupili terminalne izdanke s 80 biljaka u deset španjolskih populacija (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC i SE) smještenih na relativno malom području (približno 80 × 50 km) u sjevernoj Španjolskoj, ali u širokom rasponu nadmorske visine (424–1410 m nadmorske visine). Drugo, u jesen 2015. prikupili smo 48 biljaka iz šest od ovih populacija (AG, LI, LO, PA, SE i SR) i 46 biljaka medvjetke iz šest populacija smještenih na nižim geografskim širinama (AL, CH, ET, HU, LV , i PI). Za svaku populaciju uzorkovali smo osam biljaka udaljenih najmanje 5 m, osim u HU, gdje smo pronašli samo šest jedinki. Treće, u jesen 2016. uzorkovano je ukupno 140 biljaka na 29 različitih lokacija (1-6 jedinki sa svake) uključujući 26 novih španjolskih lokaliteta (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY, LN i ZU). Naše uzorkovanje obuhvaća raspon nadmorske visine od 534 do 1750 m. Sveukupno, 42 populacije predstavljaju širok raspon klimatskih uvjeta (Tablica S1): maksimalna srednja temperatura pokazala je 2-struku varijaciju (13–26 ◦C), a godišnja količina oborina oscilirala je od 399 (ZU) do 1589 mm (PT). Globalno zračenje kretalo se od 4,2 do 5,1 kWh/m2d. Za svaku biljku sakupljeno je šest do deset terminalnih izdanaka (15-20 cm dugih) kako bi se dobilo 6-15 g zdravih listova, koji su potom izrezani i sušeni na 60 ◦C do konstantne težine (3-4 dana). Nakon određivanja suhe težine, listovi su ručno homogenizirani u tarioniku i pohranjeni na 4 ◦C do analize. Ovaj biljni materijal korišten je za određivanje ukupnih fenola i HPLC.

Listni materijal za protočnu citometriju dobiven je iz svježeg lišća 178 jedinki koje pripadaju ukupno 37 populacija (Tablica 1). Uzorci su dobiveni iz 33 gore navedene populacije i iz četiri nove populacije (BE, JO i PR u Španjolskoj i EN u Andori) gdje je lišće prikupljeno u proljeće 2017., te stoga nisu uključeni u fitokemijsku analizu (Slika 1 i Tablica S1). Od jedne do šest jedinki po populaciji izmjereni su duplikati. Listni materijali za ekstrakciju DNA osušeni su na silika gelu i pohranjeni na sobnoj temperaturi. Analiza raznolikosti DNA provedena je na ukupno 105 biljaka s 35 lokacija (Tablica 1).

Biljni vaučeri 46 proučavanih populacija medvjetke pohranjeni su u herbariju BC, Instituta Botànic de Barcelona, ​​u herbariju BCN, Centre de Documentació de BiodiversitatVegetal, Universitat de Barcelona ili u herbariju JACA, Instituto Pirenaico de Ecología ( CSIC).

3.2. Priprema ekstrakata lišća i određivanje ukupnih fenola

Tri replika ekstrakta lista medvjetke pripremljena su korištenjem 50 mg osušenog uzorka i 10 mL 80 postotnog metanola. Epruvete su inkubirane 30 min u ultrazvučnoj kupki, a zatim su ekstrakti filtrirani (0,45 mm) i pohranjeni na 4 ◦C do analize. Ukupni sadržaj fenola određen je u ekstraktima pripremljenim iz uzoraka prikupljenih 2014. i 2015. Slijedili smo Folin–Ciocalteumetodu [60,61] uz male modifikacije: na 0,1 mL ekstrakta, 0,4 mL metanola (80 posto), 0,5 mL Folin– Dodani su Ciocalteu reagens i 8 mL ultračiste vode. Nakon 5 minuta u ultrazvučnoj kupki, dodan je 1 mL Na2CO3 20 posto (w/v). Uzorci su ostavljeni u mraku 30 minuta prije mjerenja apsorbancije na 760 nm pomoću UV-vidljivog spektrofotometra (CARY 50 BIO, Varian, AgilentTechnologies). Rezultati su izraženi u ekvivalentima galne kiseline (GAE); to jest, mg galne kiseline/g suhe težine, korištenjem standardne krivulje galne kiseline (40–340 µg/g).

3.3. Određivanje arbutina i drugih fenolnih metabolita

Sadržaj fenola u metanolnim ekstraktima lista medvjetke kvantificiran je pomoću RP-HPLC pomoću HPLC-UV/Vis sustava (LaChrom Merck Hitachi L-7400) s Kinetex 5 µm-EVO C18 (250 mm × 4,6 mm ) stupac i apsorbancija određena na 280 nm. Ekstrakti iz uzoraka prikupljenih 2014. i 2015. razrijeđeni su 1:10 (v/v) i ubrizgani s mobilnom fazom metanola i acetonitrila. Program gradijenta sastojao se od 0-5 min, 25 posto metanola; 5–6 min, 100 posto ; 6-10 minuta, 100 posto; i 10-20 minuta, ponovno 25 posto metanola. Brzina protoka bila je 1 mL/min, a volumen injekcije 20 µL. U tim uvjetima, vrijeme zadržavanja odarbutiniznosio je 2,6 min, što nam je omogućilo da odredimo koncentraciju ovog spoja pomoću kalibracijske krivulje utvrđene sa 6 razrjeđenja standarda, od 40 do 340 µg/g, s koeficijentom korelacije od r=0. 9997. Ekstrakti iz uzoraka prikupljenih 2016. analizirani su pomoću mobilne faze metanola i vode sa sljedećim programom gradijenta: 0–5 min, 10 posto metanola; 5–6 min, 20 posto ; 6–10 min, 20 posto ; 10–11 min, 30 posto ; 11–15 min, 30 posto ;15–16 min, 40 posto ; 16–20 min, 40 posto ; 20–21 min, 50 posto ; 21–25 min, 50 posto ; 25–26 min, 60 posto ; 26–30 min, 60 posto ;30–31 min, 10 posto ; i 31-36 min, opet 10 posto metanola. U tim uvjetima utvrdili smoarbutin iostala 4 fenolna spoja: kafeinska kiselina, katehin, miricetin i kvercetin-3-O-glukopiranozid korištenjem odgovarajućih kalibracijskih krivulja utvrđenih s 5 razrjeđenja standarda (25–500 µg/mL) , koji je pokazao koeficijente korelacije od {{10}}.9992 za katehin (vrijeme zadržavanja 12.0 min), 0,9924 za kavenu kiselinu (vrijeme zadržavanja 13,4 min), 0,9981 za kvercetin{{16} }O-glukozid (vrijeme zadržavanja 23,4 min), i 0,9997 za miricetin (vrijeme zadržavanja 25,1 min).

Metanol i acetonitril bili su HPLC stupnja i kupljeni od Panreaca (Barcelona, ​​Španjolska). Standardi (čistoća veća ili jednaka 98 posto) odarbutin, kafeinska kiselina i galna kiselina, kao i Folin–Ciocalteuov reagens nabavljeni su od Sigma-Aldrich (Barcelona, ​​Španjolska). Standardi za katehin i kvercetin-3-O-glukopiranozid kupljeni su od Extrasynthese (Genay Cedex, Francuska), dok je miricetin kupljen od Alfa Aesara (Karlsruhe, Njemačka).

Rezultati kemijskih određivanja analizirani su pomoću softvera SPSS v. 25 i R 3.5.2. Nakon testiranja podataka za normalnost i homoskedastičnost, proveli smo analizu varijance različitih skupova podataka i testove razdvajanja srednjih vrijednosti (Tukey i Tamhane) ili neparametarske testove kao Kruskal–Wallisov i Dunnov test višestruke usporedbe s Bonferronijevom korekcijom. Također smo procijenili koeficijente korelacije (Pearson ili Spearman, ovisno jesu li podaci slijedili normalnu distribuciju) između varijabli, uključujući veličinu genoma.

CISTANCHE IMA ANTIOKSIDACIJSKO DJELOVANJE

3.4. Procjena veličine genoma i sekvenciranje DNA

Veličina genoma biljaka medvjetke procijenjena je protočnom citometrijom u Centres Científicsi Tecnològics, Universitat de Barcelona (CCiTUB) slijedeći postupke objašnjene u Pellicer et al. [62].Petunia hybrida Vilm. 'PxPc6' (2C=2.85 pg) korišten je kao interni standard. Sjeme standarda osigurao je Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS—I2BC (Gif-sur-Yvette, Francuska). Nuklearni sadržaj DNK (2C) izračunat je množenjem poznatog sadržaja DNK standarda s kvocijentom između položaje vrhova (način) ciljane vrste i standarda u histogramu intenziteta fluorescencije, uz pretpostavku linearne korelacije između fluorescentnih signala iz obojenih jezgri nepoznatog uzorka, poznatog internog standarda i količine DNA [63].

Približno 20 mg lisnog tkiva osušenog silicijevim dioksidom upotrijebljeno je za ekstrakciju DNA korištenjem CTAB protokola [64] uz manje modifikacije. Kvaliteta ukupne DNK provjerena je spektrofotometrom NanoDrop 1000 (ThermoScientific, Wilmington, DE, SAD). Intergene regije plastida rpl32-trnLand psbE-petN, kao i regija ribosomske DNA jezgre ITS, umnožene su i sekvencirane za tri jedinke po populaciji. Sekvence ITS-a nisu pokazale varijabilnost unutar 105 analiziranih pojedinaca, osim nekoliko položaja koji pokazuju polimorfizme intragenomskih nukleotida. Stoga je ovo područje ribosomske jezgre DNA isključeno iz daljnje analize. Druge plastidne DNA regije (tj. ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; i trnL-trnF) također su testirane, ali su odbačene zbog niske varijabilnosti ili problema sekvenciranja. Postupak amplifikacije je izveden kako je opisano u Vitales et al. [65]. Izravno sekvenciranje amplificiranih segmenata DNA provedeno je s Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD) u Unitatde Genòmica, CCiTUB, na ABI PRISM 3700 DNA analizatoru (PE Biosystems). Nizovi rpl32-trnL i psbE-petN sastavljeni su s BioEdit verzijom 7.1.3.0 [66], usklađeni s ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] i ručno podešeni. GenBank pristupni brojevi navedeni su u tablici S2.

3.5. Veličina genoma i genetička analiza

Proveden je neparametarski Kruskal-Wallisov test kako bi se provjerile statistički značajne razlike u vrijednostima 2C među populacijama. Dunnov test višestruke usporedbe također je proveden kako bi se utvrdilo koje populacije pokazuju značajne razlike među njima. Bonferronijeva korekcija primijenjena je kako bi se minimizirala pogreška tipa I (lažno pozitivno).

Parametri genetičke raznolikosti (polimorfna mjesta, informativna mjesta oskudnosti, broj haplotipova i ukupna raznolikost haplotipova) procijenjeni su pomoću DnaSP v6 [68]. Plastidni haplotipovi određeni su u kombiniranom skupu podataka koji uključuje i rpl32-trnL i psbE-petN regije. Indeli su kodificirani s FastGap v.1.2 [69] i tretirani kao događaji s jednom mutacijom. Evolucijski odnosi među haplotipovima izvedeni su na temelju štedljive mreže konstruirane pomoću TCS-a [70] kako je implementirano u PopArtu [71]. Maksimalni broj razlika proizašlih iz pojedinačnih zamjena među haplotipovima izračunat je s granicama pouzdanosti od 95 posto.

Za analizu odnosa između genetskih i kemijskih podataka proveden je Mantel test. Prvo smo procijenili fenotipsku udaljenost između 25 populacija koristeći podatke iz biljaka medvjetke prikupljene 2016., koji su izmjereni za pet fenolnih komponenti (tj.arbutin, katehin, kafeinska kiselina, kvercetin i miricetin). Koristili smo R Commander za standardizaciju ovih podataka [72], a potom i za izračunavanje kemijske udaljenosti izvedene iz standardizirane matrice s funkcijom "Dist" na R na temelju euklidskih udaljenosti. Drugo, Neijeva populacijska genetička matrica udaljenosti u parovima izračunata je između 25 populacija pomoću DnaSP v6. Konačno, izračunali smo uparene geografske udaljenosti među ovim populacijama koristeći paket "geodist" u R. Parne korelacije između matrica udaljenosti izračunate su pomoću Mantel testa s 10,000 permutacija s funkcijom mantel dostupnom u R paketu "vegan" [ 73].

4. Zaključci

Sve analizirane biljke medvjetke pokazale suarbutinsadržaj veći od 7 posto; stoga je ovaj biljni materijal prikladan za biljne pripravke. Naša analiza otkrila je veći sadržaj arbutina od onih (do 9 posto) koje navode Parejo i sur. [40], koji su analizirali četiri populacije smještene u sjeveroistočnim Pirinejima na 1580-2030 m i otkrili male razlike u sadržaju arbutina među populacijama. Nadalje, većina ovdje utvrđenih vrijednosti je u rasponu biljnog materijala odabranog za uzgoj u Poljskoj [74] iu skladu s visokimarbutinsadržaj uzoraka lišća španjolske medvjetke izvijestili su Sonnenschein i Tegtmeier [42] prilikom odabira biljaka za uzgoj u Njemačkoj. Elitni genotipovi A. uva-ursi mogli su se vegetativno razmnožavati, ali većina dobivenih klonova nije uspjela tijekom uspostave polja, što je ograničilo iskorištavanje ovih resursa. Također smo opisali postojeću varijaciju u sadržaju triju flavonoida (katehin, miricetin i kvercetinglukozid), kao i kafeinske kiseline, među populacijama španjolske medvjetke, te kako klimatski čimbenici (uglavnom globalno zračenje i padaline), koji su u korelaciji s geografskom širinom i nadmorskom visinom gradijenti, utječu na tu varijaciju. U isto vrijeme, unatoč niskim razinama varijabilnosti haplotipa i veličine genoma utvrđenih u iberskoj A. uva-ursi, genetička i citogenetička diferencijacija populacija bila je slabo, ali značajno povezana s fitokemijskom raznolikošću. Sve u svemu, ovi rezultati naglašavaju da se učinak genetskih i abiotskih čimbenika mora uzeti u obzir kako bi se objasnila intraspecifična fitokemijska varijabilnost koja se nalazi u biljkama iz divljih populacija.

CISTANCHE EFEKTI

Reference

1. Moore, BD; Andrija, RL; Külheim, C.; Foley, WJ Objašnjavanje intraspecifične raznolikosti u sekundarnim metabolitima biljaka u ekološkom kontekstu. Novi Phytol. 2014, 201, 733–750. [CrossRef] [PubMed]

2. Cheynier, V.; Comte, G.; Davies, KM; Lattanzio, V. Biljni fenoli: nedavni napredak u njihovoj biosintezi, genetici i ekofiziologiji. Plant Physiol. Biochem. 2013, 72, 1–20. [CrossRef]

3. Bernal, M.; Llorens, L.; Julkunen-Tiitto, R.; Badosa, J.; Verdaguer, D. Visinske i sezonske promjene fenolnih spojeva u lišću i kutikulama Buxus sempervirens. Plant Physiol. Biochem. 2013, 70, 471–482.[CrossRef] [PubMed]

4. Upton, R. (Ur.) List Uva-ursi. Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Standard analize, kontrole kvalitete i terapije; Američka biljna farmakopeja: Scotts Valley, CA, SAD, 2008.; 30p.

5. Europska agencija za lijekove. Izvješće o procjeni Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. folija. EMA/HMPC/750266/2016; Europska agencija za lijekove: Amsterdam, Nizozemska, 6. 2018. Kanlayavattanakul, M.; Lourith, N. Biljke i prirodni proizvodi za liječenje hiperpigmentacije kože—Pregled. Planta Med. 2018, 84, 988–1006. [CrossRef]

7. Migas, P.; Krauze-Baranowska, M. Značaj arbutina i njegovih derivata u terapiji i kozmetici.Phytochem. Lett. 2015, 13, 35–40. [CrossRef]

8. Seo, DH; Jung, JH; Lee, JE; Jeon, EJ; Kim, W.; Park, CS Biotehnološka proizvodnja arbutina (- i -arbutina), sredstava za posvjetljivanje kože i njihovih derivata. Appl. Microbiol. biotehnologija. 2012, 95, 1417-1425.[CrossRef]

9. Zhu, X.; Tian, ​​Y.; Zhang, W.; Zhang, T.; Guang, C.; Mu, W. Nedavni napredak u biološkoj proizvodnji -arbutina. Appl. Microbiol. biotehnologija. 2018, 102, 8145–8152. [CrossRef] [PubMed]

10. Davey, M. Sekundarni metabolizam u kulturama biljnih stanica. U Encyclopedia of Applied Plant Sciences, 2. izdanje; Thomas, B., Murphy, DJ, Murray, BG, ur.; Elsevier: London, UK, 2017.; Svezak 2, str. 462–467. [CrossRef]

11. Kurkin, VA; Ryazanova, TK; Daeva, ED; Kadentsev, VI Sastojci listova Arctostaphylos uva-ursi. Chem. Nat. Compd. 2018, 54, 278–280. [CrossRef]

12. Panda, A.; Petrucci, R.; Marrosu, G.; Multari, G.; Romana-Gallo, F. HPLC-PDAESI-TOF/MS metaboličko profiliranje Arctostaphylos pungens i Arctostaphylos uva-ursi: komparativna studija fenolnih spojeva iz metaboličkog ekstrakta lista. Fitokemija 2015, 115, 79–88. [CrossRef]

13. Olennikov, DN; Chekhirova, GV 60-Galloylpicein i drugi fenolni spojevi iz Arctostaphylos uva-ursi.Chem. Nat. Compd. 2013, 49, 1–7. [CrossRef]

14. Brewer, MS Prirodni antioksidansi: izvori, spojevi, mehanizmi djelovanja i potencijalne primjene. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2011, 10, 221–247. [CrossRef]

15. Amarowicz, R.; Pegg, RB; Rahimi-Moghaddam, P.; Bare, B.; Weil, JA Kapacitet hvatanja slobodnih radikala i antioksidativna aktivnost odabranih biljnih vrsta iz kanadskih prerija. Food Chem. 2004., 84, 551–562. [Usp. Ref.]

16. Carpenter, R.; O'Grady, MN; O'Callaghan, YC; O'Brien, NM; Kerry, JP Procjena antioksidativnog potencijala ekstrakata sjemenki grožđa i medvjetke u sirovoj i kuhanoj svinjetini. Meat Sci. 2007., 76, 604–610. [CrossRef][PubMed]

17. Mekinić, IG; Skroza, D.; Ljubenkov, I.; Katalinić, V.; Šimat, V. Antioksidativni i antimikrobni potencijal fenolnih metabolita iz tradicionalno korištenog mediteranskog bilja i začina. Foods 2019, 8, 579. [CrossRef]

18. Mohd Azman, NA; Gallego, MG; Segovia, F.; Abdullah, S.; Shaarani, SM; Almajano, MP Studija svojstava ekstrakta lišća medvjeđeg grožđa kao prirodnog antioksidansa u modelnoj hrani. Antioksidansi 2016, 5, 11.[CrossRef] [PubMed]

20. Pegg, RB; Amarowicz, R.; Naczk, M. Antioksidativna aktivnost polifenola iz ekstrakta lišća medvjetke (Arctostaphylos uva-ursi L. Sprengel) u mesnim sustavima. U Fenolni spojevi u hrani i prirodnim zdravstvenim proizvodima; Shahidi, F., Ho, CT, ur.; Američko kemijsko društvo: Washington, DC, SAD, 2005.; str. 67–82.[CrossRef]

20. Wrona, M.; Blasco, S.; Becerril, R.; Nerin, C.; Sales, E.; Asensio, E. Antioksidativni i antimikrobni markeri UPLC®–ESI-Q-TOF-MSE novog višeslojnog aktivnog pakiranja temeljenog na Arctostaphylos uva-ursi. Talanta 2019, 196, 498–509. [CrossRef]

22. Maier, M.; Olbermann, AL; Renner, M.; Weidner, E. Provjera europskog ljekovitog bilja na njihov sadržaj tanina - Nova potencijalna sredstva za štavljenje za industriju kože. Ind. proizvod 2017, 99, 19–26. [CrossRef]

23. Boroš, B.; Jakabová, S.; Madarász, T.; Molnár, R.; Galambos, B.; Kilár, F.; Fellinger, A.; Farkas, A. Validirana HPLC metoda za simultanu kvantifikaciju bergenina, arbutina i galne kiseline u lišću različitih vrsta Bergenia. Chromatographia 2014, 77, 1129–1135. [CrossRef]

23. Miaw-Ling, C.; Chur-Min, C. Simultano HPLC određivanje hidrofilnog sredstva za izbjeljivanje u kozmetičkom proizvodu. J. Pharm. Biomed. analno 2003, 33, 617–626. [CrossRef]

25. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Jedan korak ekstrakcije u kvantitativnoj analizi listova arbutinina medvjetke (Arctostaphylos uva-ursi) tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti. Phytochem. Anal.2001, 12, 336–339. [CrossRef]

25. SNAGA. Biljke svijeta na mreži. Dostupno na internetu: http://www.plantsoftheworldonline.org/ (pristupljeno 29. travnja 2020.).

26. Saleem, A.; Harris, CS; Asim, M.; Cuerrier, A.; Martineau, L.; Haddad, PS; Arnason, JTRP-HPLC-DAD-APCI/MSD metoda za karakterizaciju ljekovitih Ericaceae koju koriste prvi narodi Eeyou IstcheeCree. Phytochem. analno 2010, 21, 328–339. [CrossRef] [PubMed]

27. Stefanescu, BE; Szabo, K.; Močan, A.; Crisan, G. Fenolni spojevi iz lišća pet vrsta Ericaceae i njihova povezana bioraspoloživost i zdravstvene dobrobiti. Molecules 2019, 24, 2046. [CrossRef] [PubMed]

28. Onda, Y.; Mochida, K. Istraživanje genetske raznolikosti u biljkama korištenjem visokoučinkovitih tehnika sekvenciranja.Curr. Genom. 2016, 17, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

29. Iannicelli, J.; Guariniello, J.; Tossib, VE; Regalado, JJ; Di Ciaccioa, L.; van Barene, CM; Pitta Álvarez, SI; Escandón, AS "Poliploidni učinak" u uzgoju aromatičnih i ljekovitih vrsta. Sci. Hortic. 2020,260, 108854. [CrossRef]

30. Leitch, IJ; Leitch, AR Raznolikost veličine genoma i evolucija u kopnenim biljkama. Raznolikost biljnih genoma, Svezak 2, Fizička struktura, ponašanje i evolucija biljnih genoma; Leitch, IJ, Greilhuber, J., Doležel, J., Wendel, JF, ur.; Springer: Beč, Austrija, 2013.; str 307–322. [CrossRef]

31. Bennett, MD; Leitch, IJ. Količine jezgre DNA u angiospermama – napredak, problemi i izgledi. Ann. Bot. 2005, 95, 45–90. [CrossRef]

32. Gregory, TR (Ed.) Evolucija genoma; Elsevier: San Diego, CA, SAD, 2005.

33. Hoang, PN; Schubert, V.; Meister, A.; Fuchs, J.; Shubert, I. Varijacije u veličini genoma, volumenu stanica i jezgri, broju kromosoma i rDNA lokusima među duckweeds. Sci. Rep. 2019, 9, 3234. [CrossRef]

34. Knight, CA; Molinari, N.; Petrov, DA Hipoteza ograničenja velikog genoma: evolucija, ekologija i fenotip. Ann. Bot. 2005., 95, 177–190. [CrossRef]

35. Pellicer, J.; Hidalgo, O.; Dodsworth, S.; Leitch, IJ Raznolikost veličine genoma i njezin utjecaj na evoluciju kopnenih biljaka. Genes 2018, 9, 88. [CrossRef]

37. Carev, I.; Rušˇci´c, M.; Skoˇcibuši´c, M.; Maravi´c, A.; Šiljak-Jakovljev, S.; Politico, O. Fitokemijska i citogenetička karakterizacija Centaurea solstitialis (Asteraceae) iz Hrvatske. Chem. Bioronioci. 2017, 14, e1600213.[CrossRef]

37. Cole, IB; Cao, J.; Alan, RA; Saxena, PK; Murch, SJ Usporedbe Scutellaria baicalensis, Scutellarialateriflora i Scutellaria racemosa: Veličina genoma, antioksidativni potencijal i fitokemija. Planta Med. 2008, 74, 474–481. [CrossRef]

38. Carvalho, YGS; Vitorino, LC; de Souza, UJB; Bessa, LA Nedavni trendovi u istraživanju genetske raznolikosti biljaka: Implikacije za očuvanje. Raznolikost 2019, 11, 62. [CrossRef]

39. Wei, S.; Yang, W.; Wang, X.; Hou, Y. Visoka genetička raznolikost u ugroženoj ljekovitoj biljci, Saussureainvolucrata (Saussurea, Asteraceae), u zapadnim planinama Tianshan, Kina. Očuvati Genet. 2017, 18, 1435–1447. [CrossRef]

40. Chang, YJ; Cao, YF; Zhang, JM; Tian, ​​LM; Dong, XG; Zhang, Y.; Qi, D.; Zhang, XS Studija o raznolikosti kloroplast DNA kultiviranih i divljih krušaka (Pyrus L.) u sjevernoj Kini. Drvo Genet. Genomi 2017, 13, 44.[CrossRef]

42. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Varijacija sadržaja arbutina u različitim divljim populacijama Arctostaphylos uva-ursi u Kataloniji, Španjolska. J. Bilje Začini Med. Biljke 2002, 9, 329–333. [CrossRef]

42. Sonnenschein, M.; Tegtmeier, M. Pokusi pripitomljavanja medvjetke (Arctostaphylos uva-ursi (L.)Spreng.). J. Med. Začinsko bilje 2012, 17, 124–128.

43. Chen, HY; Lin, YC; Hsieh, CL Procjena antioksidativne aktivnosti vodenog ekstrakta nekih odabranih nutraceutskih biljaka. Food Chem. 2008., 104, 1418–1424. [CrossRef]

44. Del Valle, JC; Buide, ML; Casimiro-Soriguer, I.; Whittall, JB; Narbona, E. O akumulaciji flavonoida u različitim dijelovima biljaka: obrasci varijacija među pojedincima i populacijama u obalnom kampionu (Silene littorea). Ispred. Plant Sci. 2015, 6, 939. [CrossRef]

45. Martínez-Cadenas, C.; López, S.; Ribas, G.; Flores, C.; García, O.; Sevilla, A.; Smith-Zubiaga, I.; Ibarrola-Villaba, M.; Pino-Yanes, MM; Gardeazabal, J.; et al. Istovremena pročišćavajuća selekcija na alelu predaka MC1R i pozitivna selekcija na alel v60l rizika od melanoma u južnih Europljana. Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 2654–2665. [CrossRef]

47. Jakaoola, L.; Hohtola, A. Učinak geografske širine na biosintezu flavonoida u biljkama. Okruženje biljnih stanica. 2010, 33, 1239–1247. [CrossRef]47. Martz, F.; Peltola, R.; Fontana, S.; Duval, RE; Julkunen-Tiitto, R.; Stark, S. Učinak zemljopisne širine i nadmorske visine na terpenoidni i topljivi fenolni sastav iglica smreke (Juniperus communis) i procjena njihove antibakterijske aktivnosti u borealnoj zoni. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 9575–9584. [CrossRef]

48. Yang, B.; Zheng, J.; Laaksonen, O.; Tahvonen, R.; Kallio, H. Učinci geografske širine i vremenskih uvjeta na fenolne spojeve u kultivarima ribiza (Ribes spp.). J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3517–3532. [CrossRef][PubMed]

50. Lätti, AK; Jaakola, L.; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Varijacije antocijana i flavonola u bogbil bobicama (Vaccinium uliginosum L.) u Finskoj. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 427–433. [CrossRef] [PubMed]

50. Lätti, AK; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Analiza varijacije antocijana u divljim populacijama borovnice (Vaccinium myrtillus L.) u Finskoj. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 190–196. [CrossRef]

52. Monschein, M.; Iglesias, J.; Kunert, O.; Bučar, F. Fitokemija vrijeska (Calluna vulgaris (L.) Hull) i njegova visinska alteracija. Phytochem. Rev. 2010, 9, 205–215. [CrossRef]

52. Perry, NB; Burgess, EJ; Rodríguez Guitián, MA; Romero Franco, R.; López Mosquera, E.; Smallfield, BM; Joyce, NI; Littlejohn, RP Seskviterpenski laktoni u Arnici montana: Helenalin i dihidrohelenalinkemotipovi u Španjolskoj. Planta Med. 2009, 75, 660–666. [CrossRef] [PubMed]

53. Abdala-Roberts, L.; Assmann, S.; Berny-Mier, Y.; Terán, JC; Covelo, F.; Glauser, G.; Moreira, X. Biotički i abiotski čimbenici povezani s visinskim varijacijama u svojstvima biljaka i biljojeda u dominantnoj vrsti hrasta. Am. J. Bot. 2016, 103, 2070–2078. [CrossRef] [PubMed]

54. Bentley, J.; Moore, JP; Farrant, JM. Metabolomika kao dopuna filogenetici za procjenu intraspecifičnih granica u ljekovitom grmu Myrothamnus flabellifolia (Myrothamnaceae) otpornom na isušivanje. Phytochemistry 2019, 159, 127–136. [CrossRef] [PubMed]

56. Šiljak-Jakovlev, S.; Pustahija, F.; Šoli´c, EM; Bogunić, F.; Muratović, E.; Baši´c, N.; Catrice, O.; Brown, CS Prema bazi podataka o veličini genoma i broju kromosoma balkanske flore: C-vrijednosti u 343 taksona s novim vrijednostima za 252. Adv. Sci. Lett. 2010., 3, 190–213. [CrossRef]

56. Garrido, JL; Alcántara, JM; Rey, PJ; Medrano, M.; Guitián, J.; Castellanos, MC; Bastida, JM; Jaime, R.; Herrera, CM Zemljopisna genetska struktura iberskih kolumni (gen. Aquilegia). Plant Syst. Evol. 2017, 303, 1145-1160. [Usp

58. Listl, D.; Poschlod, P.; Reisch, C. Phylogeography of a tough rock survivor in European dry grasslands.PLoS ONE 2017, 12, e0179961. [CrossRef]

59. Olalde, M.; Herrán, A.; Espinel, S.; Goicoechea, P. Filogeografija bijelih hrastova na Iberijskom poluotoku.Ecol. Upravitelj 2002., 156, 89–102. [CrossRef]

59. Barrett, SCH Utjecaji klonalnosti na spolno razmnožavanje biljaka. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2015, 112, 8859–8866. [CrossRef] [PubMed]

60. Skowyra, M.; Falguera, V.; Gallego, G.; Peiro, S.; Almajano, MP Učinak ekstrakata Perilla frutescens na oksidativnu stabilnost modelnih emulzija hrane. Antioksidansi 2014, 3, 38–54. [CrossRef] [PubMed]

61. Pascoal, A.; Quirantes-Piné, R.; Fernando, AL; Alexopoulou, E.; Segura-Carretero, A. Fenolni sastav i antioksidativna aktivnost lišća kenafa. Ind. proizvod 2015., 78, 116–123. [CrossRef]

62. Pellicer, J.; Garnatje, T.; Molero, J.; Pustahija, F.; Šiljak-Jakovljev, S.; Vallès, J. Podrijetlo i evolucija južnoameričkih vrsta Artemisia (Asteraceae); dokazi iz molekularne filogenije, ribosomske DNK i podaci o veličini genoma. Aust. J. Bot. 2010, 58, 605–616. [CrossRef]

63. Doležel, J. Protočna citometrijska analiza sadržaja jezgrene DNA u višim biljkama. Phytochem. analno 1991, 2, 143–154. [CrossRef]

64. Doyle, JJ; Doyle, JL Brzi postupak izolacije DNA za male količine svježeg lisnog tkiva. Phytochem. Bull.Bot. Soc. Am. 1987, 19, 11–15.

66. Vitales, D.; Feliner, GN; Vallès, J.; Garnatje, T.; Firat, M.; Álvarez, I. Novi opis mediteranskog roda Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae) na temelju markera DNA plastida i jezgre. Phytotaxa 2018, 349, 1–17. [CrossRef]

66. Hall, TA BioEdit: Uređivač i program za analizu bioloških sekvenci prilagođen korisniku za Windows95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

67. Thompson, JD; Higgins, DG; Gibson, TJ CLUSTAL W: Poboljšanje osjetljivosti progresivnog usklađivanja višestrukih sekvenci putem ponderiranja sekvenci, penala praznina specifičnih za položaj i izbora matrice težine. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 4673–4680. [CrossRef]

69. Rozas, J.; Ferrer-Mata, A.; Sánchez-DelBarrio, JC; Guirao-Rico, S.; Librado, P.; Ramos-Onsins, SE; Sánchez-Gracia, A. DnaSP 6: Analiza polimorfizma sekvence DNA velikih skupova podataka. Mol. Biol. Evol. 2017, 34, 3299–3302. [CrossRef] [PubMed]

69. Borchsenius, F. FastGap, verzija 1.2; Odjel za bioznanosti, Sveučilište Aarhus: Aarhus, Danska, 2009.; dostupno na internetu: http://www.aubot.dk/FastGap_home.htm (pristupljeno 1. srpnja 2019.).

71. Klement, M.; Posada, DCKA; Crandall, KA TCS: Računalni program za procjenu genskih genealogija. Mol. Ecol. 2000, 9, 1657–1659. [CrossRef] [PubMed]

71. Leigh, JW; Bryant, D. Popart: Softver s punim značajkama za izgradnju mreže haplotipova. Metode Ecol. Evol.2015, 6, 1110–1116. [CrossRef]

72. Fox, J. Početak rada s R Commanderom: Grafičko korisničko sučelje s osnovnom statistikom za RJ Stat. Softw.2005, 14, 1–42. [CrossRef]

74. Oksanen, J.; Blanchet, FG; Kindt, R.; Legendre, P.; O'Hara, RB; Simpson, GL; Solymos, P.; Stevens, M.; Wagner, H. Vegan: Ekološki paket zajednice. R paket verzija 1.17-4. 2010. Dostupno na internetu: http://CRAN.R-project.org/package=vegan (pristupljeno 19. rujna 2010.).74. Malinowska, H. Izbor medvjetke (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) iz prirodnih populacija u Poljskoj. Acta Soc. Bot. pol. 1995, 64, 91–96. [CrossRef]