Dio 2: Renovaskularni učinci anorganskih nitrata nakon ishemije-reperfuzije bubrega

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

3. Rezultati

3.1. Dodavanje nitrata povećava markere bioaktivnosti NO i smanjuje bubrežnu disfunkciju nakon IR

Razine nitrata i nitrita bile su povećane, a cGMP se povećao u miševa nakon tretmana nitratima (Slika 1A-C). Bubrežna disfunkcija, što se odražava u promjenama BUN i GFR, također je poboljšana nitratom (Slika 1D i E).

3.2. Nitrat smanjuje odgovor krvnog tlaka i razine renalnog Ang II nakon IR

Nakon dva tjedna reperfuzije, krvni tlak bio je blago povišen u IR skupini u usporedbi s lažno operiranim kontrolnim skupinama. Liječenje nitratom spriječilo je ovo povišenje krvnog tlaka (Slika 2A-C). Kako bismo istražili vezu s promjenama u sustavu renin-angiotenzin, izmjerili smo razine Ang II u plazmi itkiva bubrega. Naši podaci pokazuju da je Ang II u plazmi bio sličan među skupinama, povećan u ishemijskom bubregu, ali nije značajno promijenjen u neishemičnom bubregu (Slika 2D-F). Nitrat je spriječio povećanje Ang Ⅱ u bubrežnom tkivu nakon IR, što može pridonijeti njegovim učincima na krvni tlak.

Kliknite za više informacija. o koristima cistanche

3.3. Nitrat ublažava bubrežne histopatološke promjene, upalu i apoptozu nakon IR

Zatim smo analizirali bubrežne histopatološke promjene nakon IR bojenjem H&E i PAS. IR skupina pokazala je duboko oštećenje glomerula u kombinaciji s tubularnom nekrozom u usporedbi s lažno operiranim kontrolama (Slika 3A-F i Tablica 1). IR miševi liječeni nitratom imali su znatno manje histopatoloških promjena, što je vidljivo iz manjeg formiranja kalupa, nekroze, rupture ektazije tubularne bazalne membrane i više tubularne regeneracije i nekrotičnih tubula u regeneraciji (Slika 3A-F i Tablica 1). Štoviše, imunološko bojenje F4/80 pokazalo je značajnu infiltraciju makrofaga u ishemijskom bubregu nakon IR, što je spriječeno tretmanom nitratima (Slika 4A i B). Bojenje TUNEL, za otkrivanje apoptoze, bilo je značajno povišeno nakon IR ozljede, što je opet značajno smanjeno nitratom (Slika 4C i D)[6].

3.4 Nitrat poboljšava oštećenje mitohondrija nakon bubrežne IR putem mehanizama koji oživljavaju obnovu razina proteina TFAM

Abnormalnosti i disfunkcija bubrežnih mitohondrija, zajedno s prekomjernom proizvodnjom ROS-a, uključeni su u patogenezu bubrežne doze. uključujući AN [27,28]. Naši podaci pokazuju da je mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM), koji je ključni regulator ekspresije mitohondrijskih gena [29], značajno smanjen u IR bubrega (Hg.5A-C). Liječenje nitratima nije bilo povezano s nikakvim značajnim promjenama u TFAM-u u IR bubregu, ali je povećalo njegovu ekspresiju u neishemičnom bubregu nakon IR (Slika 5A-C).

3.5. Liječenje nitratima smanjuje Ang II induciranu kontraktilnost interlobarnih arterija i aferentnih arterija nakon bubrežne R

Zatim smo upotrijebili tehniku ​​miografije za procjenu učinaka IR na vaskularnu funkciju u velikim intrarenalnim žilama lijevog bubrega nakon reperfuzije. Kontraktilnost na fenilefrin nije se značajno razlikovala između eksperimentalnih skupina (Slika 6A). Međutim, Ang I-inducirana kontraktilnost bila je značajno povećana u IR bubrega (Hg.6B), što je spriječeno liječenjem nitratima. U izoliranim i prokrvljenim aferentnim arteriolama (Slika 6C), osjetljivost i maksimalni kontraktilni odgovori na Ang II također su bili povećani u IR bubrega, što je uvelike spriječeno liječenjem nitratima (1. 6D)

3.6. Apoptoza stanica osigurana fipoksijom-treoksigenacijom i mi chandndl abnormalnosti u glomerularnim endotelnim stanicama ublažavaju se niti

U daljnjim proučavanjima vaskularnog mehanizma. s ciljem oponašanja in vivo IR modela, koristili smo GEC. U ovoj studiji stanica koristili smo nitrit umjesto nitrata za premošćivanje, prvi korak u putu nitrat-nitrit-NO koji zahtijeva komenzalne bakterije in vivo. Hipoksija praćena reoksigenacijom u GEC-ima smanjila je vitalnost stanica/povećala smrtnost (Slika 7A i B).

To je bilo povezano s povećanim razinama cijepane kaspaze-3, smanjenom ekspresijom mitohondrijskog kompleksa IⅡ i TFAM (Slika 7C-G) i mitohondrijskom proizvodnjom ROS-a, kao što pokazuje MitoSox (Slika 7H). Sve te abnormalnosti povezane s hipoksijom i reoksigenacijom poboljšane su istodobnim liječenjem nitritom.

Naši in vivo podaci pokazali su da su vaskularne ozljede i disfunkcija izazvane IR-om povezane s povećanim razinama i osjetljivošću renalnog Ang II (Slike 2E i 6B i D). U prisutnosti Ang I, hipoksija-reoksigenacija smanjuje vitalnost stanica i dodatno povećava mitohondrijske Proizvodnja ROS (Slika S1 i Slika 8), koja je opet smanjena tretmanom nitritima.

3.7. Zaštitni učinci nitrita nakon hipoksije-reoksigenacije u endotelnim stanicama glomerula poništeni su inhibicijom ksantin oksidoreduktaze

XOR se smatra jednim od ključnih enzima uključenih u redukciju nitrita u NO i druge vrste bioaktivnih dušikovih oksida. Ovdje pokazujemo da su, u prisutnosti selektivnog inhibitora XOR febuksostata, poništeni korisni učinci nitrita na vitalnost stanica, ekspresiju TFAM-a i mitohondrijski ROS (Slika 9A-D) nakon hipoksije-reoksigenacije u kombinaciji s Ang I u GEC-ima. Podaci o vitalnosti stanica u odsutnosti Ang II u skupini koja je nosila prikazani su na slici S2.

4. Rasprava

U ovoj studiji pokazujemo da je tretman anorganskim nitratom neposredno prijebubrežna ishemijaznačajno smanjuje oštećenja glomerula i tubula kao i gubitak bubrežne funkcije nakon 2 tjedna reperfuzije. Ovi povoljni učinci nitrata povezani su s prigušenim upalnim odgovorom i odgovorom angiotenzina II, zajedno s modulacijom mitohondrijskihoksidativni stresi vitalnost stanica.

Ovo je prvi opis kako poticanje puta nitrat-nitrit-NO prije ishemijskog događaja može zaštititi bubreg od naknadne bubrežne i endotelne disfunkcije i ozljeda povezanih s reperfuzijom.

Generacija NO dobivena iz NOS-a vitalna je za mnoge kardiovaskularne ibubrežne funkcije, uključujući modulaciju krvnog tlaka i autoregulaciju bubrega kao i upravljanje tubularnim elektrolitima [30-32]. Međutim, u uvjetima s niskom napetosti kisika i niskim pH, ovaj enzimski sustav je ugrožen što dovodi do nedostatka NO ili čak odvajanja NOS, što povećava proizvodnju reaktivnih vrsta kisika [6,30]. Alternativni put nitrat-nitrit-NO neovisan je o NOS sustavu i može se potaknuti našom svakodnevnom prehranom. Važno je da je učinkovitost puta nitrat-nitrit-NO znatno poboljšana u stanjima s ishemijom ili hipoksijom kada je NOS sustav ugrožen [9,33]. Eksperimentalne i kliničke studije pokazale su povoljne kardiovaskularne učinke dodavanja nitrata, uključujući poboljšanu endotelnu funkciju i smanjenje krvnog tlaka u normotenzivnih i hipertenzivnih osoba [1]. Prethodno smo pokazali da bubrežna mikrovaskulatura izvrsno reagira na vazodilataciju posredovanu nitritima [23], posebno tijekom kiselih uvjeta i uvjeta niske razine kisika koji oponašaju in vivo ishemijska okruženja [20]. Uzeti zajedno, ovi nalazi sugeriraju da liječenje nitratima može biti povezano sa zaštitom organa nakon IR.

Prethodne studije koje su koristile intervencije s nitritima dale su donekle proturječne rezultate u pogledu njegove terapijske vrijednosti u modelima IR ozljeda kod glodavaca [16,17,34,35]. Triptatara i sur. pokazalo je da akutna lokalna bubrežna primjena nitrita (30 nmol) štiti bubrege štakora od 60 min bilateralne ishemije i 6h reperfuzijom induciranih ozljeda i disfunkcije in vivo, barem djelomično, putem XOR- ovisna proizvodnja NO [16]. Korištenjem mišjeg transgenog pristupa, nalazi Milsom et al. sugerirali su da je eNOS ključan igrač, pridonoseći smanjenju nitrita tijekom IR-a, čime posreduje u zaštiti [35]. U skladu s tim, Cantor i kolege pokazali su da akutna sustavna primjena nitrita (0.172 nakon čega slijedi 0,057 mg/h/kg) značajno poboljšava bubrežnu reoksigenaciju i reperfuziju nakon unilateralne ishemije (45 min) i 60 min reperfuzije u štakora [ 34]. Nasuprot tome, Basireddy et al. nisu uočili nikakve zaštitne učinke akutne sustavne primjene nitrita (0.12-12 nmol/g/kg) kod štakora podvrgnutih jednostranoj nefrektomiji nakon koje je uslijedila 45 minuta ishemije preostalog bubrega i 24-48 h reperfuzija [17]. Moguća objašnjenja ovih odstupanja mogu biti različiti eksperimentalni pristupi (tj. IR model, trajanje IR razdoblja), režim doziranja, način primjene i razlike u vrstama. Trenutno postoji manje znanja o terapeutskoj vrijednosti korištenja anorganskog nitrata umjesto nitrita. Nitrat se može sigurno primjenjivati ​​u većim dozama od nitrita i ima puno dulje vrijeme poluraspada (6 h u odnosu na 30 min), što omogućuje kontinuirano stvaranje nitrita, NO i drugih bioaktivnih dušikovih oksida tijekom puno duljeg razdoblja. U tom kontekstu, nitrat se može smatrati predlijekom za kontinuiranije stvaranje nitrita.

U prethodnoj studiji na miševima, pokazali smo da predtretman nitratima kroz 2 tjedna štiti bubreg od IR ozljede putem mehanizama koji uključuju modulaciju fenotipa imunoloških stanica i antioksidativnih svojstava [18]. Umjesto oponašanja scenarija kroničnog visokog unosa nitrata, trenutna studija testirala je učinke akutne primjene prije ishemijskog inzulta. Ovaj je pristup privlačniji iz kliničke i terapijske perspektive, budući da može nalikovati akutnoj intervenciji prije ishemije kod bolesnika s rizikom od razvoja AKI. Naše trenutno istraživanje pokazalo je da je akutno liječenje nitratima praćeno stalnim unosom nitrata u ishranu tijekom 2 tjedna značajno povećalo razine nitrata, nitrita i cGMP-a u cirkulaciji. Morfološka analiza je pokazala da je tretman nitratima ublažio ozljede izazvane IR u usporedbi s netretiranim IR kontrolama. Uz smanjenje oštećenja strukture bubrega, liječenje nitratima očuvalo je funkciju bubrega nakon ozljede IR. Budući da se kreatinin u plazmi obično vraća na normalne razine tjedan dana nakon reperfuzije [36,37, izmjerili smo BUN i GFR kako bismo procijenili funkciju bubrega nakon 2 tjedna reperfuzije. GFR i BUN nisu značajno promijenjeni nakon IR u usporedbi s lažno operiranim kontrolama, što se vjerojatno objašnjava kontralateralnim kompenzacijskim bubregom. Međutim, naši podaci pokazuju da su oba ova parametra značajno poboljšana nitratom u usporedbi s netretiranom IR skupinom.

Upalne reakcijei stanična apoptoza ključni su biološki procesi tijekom IR ozljede, koji doprinose čišćenju staničnih ostataka i odgovarajućem popravku tkiva [18,24]. Međutim, dugotrajna i neriješena upala može dodatno pogoršati ozljedu tkiva [7,38,39].Upala bubrega, kako je otkriveno F4/80 bojanjem infiltracije makrofaga, značajno je smanjen nitratom nakon IR. To je u skladu s nedavno objavljenim studijama Yanga i sur. [18] i Khambata et al. [40] Štoviše, TUNEL test za apoptozu razjasnio je da IR ozljeda povećava apoptozu stanica u mišjem ishemijskom bubregu, što je djelomično spriječeno liječenjem nitratima. Uzeti zajedno, ovi rezultati jasno sugeriraju da liječenje nitratima može inhibirati bubrežnu upalu i apoptozu stanica koje se javljaju nakon IR.

Prikupljeni dokazi pokazuju da mitohondrijska disfunkcija značajno pridonosi razvoju AKI nakon IR, a novi pristupi koji moduliraju funkciju mitohondrija stoga mogu imati terapijsku vrijednost [41-45]. Na primjer, u ishemijskom bubregu, mitohondriji u endotelnim stanicama značajno su promijenjeni i funkcionalno i morfološki, te postaju izuzetno reaktivni i oštećuju sebe i okolne mitohondrije [44]. Ranije smo pokazali da nitrat iz hrane poboljšava učinkovitost mitohondrija kod ljudi [46]. Stimulacija puta nitrat-nitrit-NO je u nekoliko nedavnih eksperimentalnih studija povezana s povoljnim učincima na funkciju mitohondrija tijekom metaboličkih poremećaja, uključujući dijabetes tipa 2, putem mehanizama koji uključuju prigušivanje oksidativnog stresa [47]. Štoviše, Shiva i kolege su pokazali da i prije i akutni tretman anorganskim nitritom ima citoprotektivne učinke i potencijalno ograničava srčanu i jetrenu reperfuzijsku ozljedu putem modulacije lanca prijenosa elektrona u mitohondrijima i smanjenja ROS [48]. U našem in vivo IR modelu, TFAM je bio povećan u neishemičnom bubregu, ali nije značajno promijenjen u ishemijskom bubregu. Uzimajući u obzir da je nitrit obnovio ekspresiju TFAM in vitro nakon hipoksije-reoksigenacije, nagađamo da bi to moglo biti povezano s vremenski ovisnim razlikama u ekspresiji. U modelu in vivo, analiza TFAM-a napravljena je tek nakon 2 tjedna i moguće je da bi to bilo drugačije u ranijoj vremenskoj točki nakon reperfuzije.

Opće je poznato da pojačano Ang I signaliziranje stimulira NADPH oksidazu i proizvodnju ROS-a izvedenog iz mitohondrija, što dovodi do oksidativnog stresa [49-51]. Cao i kolege pokazali su da reno-cerebralni refleks aktivira sustav renin-angiotenzin nakon IR, što potiče oksidativni stres i progresiju bubrežnih ozljeda [52]. Prethodno smo pokazali da liječenje nitratima smanjuje kontraktilnost posredovanu Ang I u aferentnim arteriolama bubrega i hipertenziju putem mehanizama koji uključuju smanjenje simpatičke hiperaktivnosti i prigušivanje oksidativnog stresa, kao i smanjenu ekspresiju receptora Ang tipa 1 [{{7} }]. U skladu s prethodnim nalazima, naši podaci pokazuju da liječenje nitratima smanjuje krvni tlak koji je bio povezan s nižim razinama Ang II u bubrezima nakon IR i prigušene kontraktilnosti posredovane Ang IⅡ u interlobarnim arterijama i aferentnim arteriolama.

Budući da su abnormalnosti endotelnih stanica nakon IRis-a usko povezane s ozljedama bubrega i kompromitiranom funkcijom bubrega, zatim smo upotrijebili glomerularne endotelne stanice (GEC) za mehaničke studije. In vitro model hipoksije-reoksigenacije, sa i bez istovremenog tretmana nitratima, korišten je za oponašanje in vivo IR scenarija. Naši in vitro rezultati pokazuju da je hipoksija-reoksigenacija povećala smrtnost stanica, proizvodnju mitohondrijskih ROS-a i cijepanu kaspazu-3, smanjila vitalnost stanica i ekspresiju proteina OXPHOS kompleksa I i TFAM-a. Sve te abnormalne promjene značajno su ublažene nitritom.

Kako su naši in vivo podaci pokazali da su razine Ang I povećane u bubrezima nakon IR, također smo proučavali učinke tretmana nitritima u GEC nakon hipoksije-reoksigenacije u prisutnosti Ang. Naši podaci pokazuju da je hipoksija-reoksigenacija u kombinaciji s Ang I dodatno smanjila vitalnost stanica i povećala proizvodnju mitohondrijskih ROS, što je opet spriječeno istodobnim tretmanom nitratima.

Tijekom normoksije i normalnog pH, NO dobiven iz NOS-a se oksidira u nitrit i nitrat, ali tijekom hipoksije i kiselih uvjeta, nitrit se može reducirati natrag u NO djelovanjem nitrit reduktaze XOR-a. Koinkubacija sa selektivnim inhibitorom XOR febuksostatom ukinula je zaštitne učinke nitrita nakon hipoksije-reoksigenacije u GEC-ima. Ovi podaci sugeriraju da XOR katalizira redukciju nitrita u NO, što zauzvrat posreduje u zaštiti stanica od ozljeda izazvanih hipoksijom-reoksigenacijom.

Neka ograničenja trenutne studije uključuju da nije bila uključena skupina koja je bila tretirana samo nitratima kod lažno operiranih životinja. Glavni razlog za to bio je taj što prethodne studije na normalnim štakorima i miševima nisu primijetile nikakve duboke učinke, korištenjem sličnih doza nitrata, na krvni tlak, funkciju bubrega ili vaskularnu reaktivnost. Još jedno ograničenje je da su sve in vivo karakterizacije napravljene tek nakon dva tjedna reperfuzije. Dodatne vremenske točke potencijalno su mogle generirati više mehaničkog uvida.

Zaključno, akutno liječenje anorganskim nitratom prije ishemije bubrega, praćeno kontinuiranim liječenjem nitratima tijekom dva tjedna reperfuzije, zaštitilo je od bubrežne disfunkcije i ozljeda putem mehanizama koji uključuju smanjenje infiltrirajućih upalnih stanica i razine angiotenzina I u ishemiji bubrega kao i modulacija mitohondrijske funkcije. Buduća klinička ispitivanja mogu razjasniti mogu li intervencije s anorganskim nitratom pružiti korisne učinke kod pacijenata s visokim rizikom od oštećenja IR bubrega.