Dio 2: Interakcije askorbinske kiseline, 5-kafeoilkininske kiseline i kvercetin-3-rutinozida u prisutnosti i odsutnosti željeza tijekom toplinske obrade i utjecaj na antioksidacijsku aktivnost

Za više informacija. kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Kliknite vezu da saznate pojedinosti o 1. dijelu:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Rasprava

3.1. Odnos strukture i aktivnosti askorbinske kiseline,5-kafeoilkininske kiseline i kvercetin-3-rutinozida

Prvi pokazatelj AOA, mjeren za različite tvari ovisno o odnosu strukture i aktivnosti, proizašao je iz broja funkcionalnih skupina. Uspoređujući sve tri analizirane tvari, askorbinska kiselina je imala najniži AOA, zatim 5-kafeoilkininska kiselina, dokkvercetin-3-rutinoziddosegao najviši AOA. Csepregi i sur. [14] pronašli su isti poredak kada su uspoređivali AOA ova tri spoja. Ovaj se poredak može objasniti ukupnim brojem hidroksilnih skupina: kvercetin-3-rutinozid ima deset, 5-kafeoilkininska kiselina ima pet iaskorbinska kiselinaima četiri. Zaflavonoidi, ukupnu količinu hidroksilnih skupina i njihov utjecaj na mehanizme AOA prethodno su pokazali Burda i Oleszek[15]. Hidroksi skupine su posebno vrijedne u endiolnim strukturama, jer mogu lako oksidirati u diketone [8]. U analiziranim tvarima struktura endiola također je važna za sposobnost stvaranja kompleksa s metalnim ionima [16-18]. Struktura endiola javlja se u molekulama kvercetin-3-rutinozida i 5-kafeoilkinske kiseline u fenilnom prstenu, što također može utjecati na jači AOA ovih spojeva. Daljnje studije otkrile su da na AOA mogu utjecati i druge strukture molekula. Na fenolne kiseline vjerojatno utječu skupine karboksilnih kiselina, npr. hidroksifenil octena kiselina (R-CH=CH-COOH) je slabija skupina koja privlači elektrone, u usporedbi s hidroksicimetnom kiselinom (R-CH,-COOH) kao kao kafeinska kiselina u 5-kafeoilkininskoj kiselini [19]. U flavonoidima, aglikoni su imali viši AOA od odgovarajućih glikozida [20,21], u slučaju kvercetin-3-rutinozida, glikozida, AOA aglikonakvercetinje posljedično veća [14]. Postoji mnogo različitih funkcionalnih skupina koje mogu utjecati na AOA i, prema tome, važno je koristiti različite testove s različitim mehanizmima, kao što je prijenos jednog elektrona (SET), prijenos atoma vodika (HAT) i sekvencijalni gubitak elektrona protona prijenos (SPLET) za detekciju. Svaki mehanizam, pa čak i korišteni reagens za ispitivanje, može otkriti različite strukture bioaktivnih spojeva [22].

3.2. Utjecaj toplinske obrade i interakcije strukturno različitih antioksidansa na antioksidacijsku aktivnost u odsutnosti minerala željeza

Stabilna AOA tijekom duljeg vremena od 40 minuta toplinske obrade ukazuje na to da je toplinska degradacija manje važna nego što se prvobitno pretpostavljalo. Nadalje, HPLC podaci pokazali su da su čista 5-kafeoilkininska kiselina i kvercetin-3-rutinozid stabilni, s maksimalnom razgradnjom od 20 posto, tijekom toplinske obrade. Prethodne studije dokazale su stabilnost 5-kafeoilkininske kiseline do normalne točke vrenja vode [23], dok su Dawidowicz i Typek[24] pronašli devet derivata spojeva, nakon zagrijavanja 5-kafeoilkininske kiseline 5 sati pod refluks. Za koncentraciju askorbinske kiseline utvrđena je degradacija nakon 40 minuta kuhanja. Čimbenici koji utječu na razgradnju askorbinske kiseline bez željeza u vodenoj otopini mogu biti pH vrijednosti, izloženost svjetlu, oksidacija, temperatura i različite koncentracije [25,26]. U ovom istraživanju najvjerojatnije su glavnu ulogu imali čimbenici temperatura i koncentracija, jer su oksidacijski procesi svedeni na minimum zbog minimalnog plinskog prostora u mikroepruvetama. Moguće je da je preostala plinovita faza još uvijek dovoljna za razgradnju u aerobnim uvjetima. Različiti uvjeti rezultiraju različitim proizvodima [27,28], tako da su se u ovoj studiji nakon 40 minuta kuhanja mogli naći proizvodi obaju uvjeta. Yuan i Chen [28] objavili su da su furfural, 2-furoična kiselina, 3-hidroksi-2-piron i nepoznata tvar glavni produkti razgradnje askorbinske kiseline u vodenoj otopini ovisno o pH vrijednosti . Shinoda i sur. [29,30] pronašli su u soku od naranče produkte razgradnje furfural, 2-furoičnu kiselinu, 5-hidroksimaltol, 3-hidroksi-2-piron i 5-(hidroksimetil )furfural. Hsu i sur. [31] analizirali su askorbinsku kiselinu u etanolnim otopinama i otkrili 2-furoičnu kiselinu i 3-hidroksi-2-piron. Ovisno o aerobnim ili anaerobnim uvjetima, otkriveni derivati ​​askorbinske kiseline (vrhovi 3 i 4) mogu biti furfural, 2-furoična kiselina ili 3-hidroksi-2-piron ili intermedijeri. Askorbinska kiselina se smanjila u odnosu doza-odgovor, a više koncentracije askorbinske kiseline pokazale su niže omjere razgradnje tijekom kuhanja. Čini se da se askorbinska kiselina sama stabilizira u višim koncentracijama, vjerojatno zbog vodikovih veza i van de Waalsove energije [32].

U binarnim i ternarnim smjesama pronađeni su uglavnom dodatni učinci na AOA. U binarnim smjesama, ako se povećala koncentracija tvari s višim AOA, povećao se i AOA njihove kombinacije. Druge su studije također otkrile aditivnu učinkovitost između (plus)-katehina (200 um) s askorbinskom kiselinom (50-200 mg/L)[33], te između binarnih smjesa različitih monoterpena[34]. Samo u DPPH testu, antagonistički učinci pronađeni su u 5-kafeoilkininskoj kiselini u kombinaciji s kvercetin-3-rutinozidom i u ternarnim smjesama s udvostručenim koncentracijama kvercetin-3-rutinozida. To bi moglo biti uzrokovano orijentacijom molekula u prostoru, posebice kvercetin-3-rutinozida, kao prilično velike molekule, te prostornom dostupnošću molekule DPPH radikala [35]. U TPC testu, kombinacija askorbinske kiseline i 5-kafeoilkininske kiseline rezultirala je jakim antagonističkim učincima u omjeru 1:2, dok su obrnute mješavine s omjerom 2:1 rezultirale snažnim sinergističkim učincima, koji premašuju zbroj odgovarajuće AOA. Dvostruka koncentracija askorbinske kiseline može dati, pod ovim uvjetima, dodatni poticaj AOA, zbog samostabilizacije praćene stabilizacijom drugih molekula, što je dokazano 5-kafeoilkininskom kiselinom u ovom eksperimentu. U soku od nara i nektarine, između prirodnih fenola i askorbinske kiseline, utvrđena je ista interakcija, dok su u soku od grožđa primijećeni pojačani antagonistički učinci povećanjem koncentracije askorbinske kiseline [36]. Ovi rezultati sugeriraju da mješavine askorbinske kiseline, 5-kafeoilkinske kiseline i kvercetin-3-rutinozida postižu najveći potencijal AOA kada su najjačeantioksidansisu u izobilju dostupni.

Kliknite kako biste saznali više o proizvodima

3.3. Utjecaj minerala željeza

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>askorbinska kiselina. Međutim, dodavanje željeza u smjese imalo je utjecaja na rezultate testova TEAC i DPPH, dok su testovi TPC uglavnom ostali nepromijenjeni. Iz tog razloga, važno je koristiti različite testove s različitim mehanizmima rada kada radite s uzorcima bogatim željezom.

Samo je u DPPH testu AOA čistog kvercetin-3-rutinozida iu kombinaciji s askorbinskom kiselinom, ekvimolarnom ili neekvimolarnom s udvostručenim koncentracijama kvercetin-3-rutinozida, imala niže vrijednosti u prisutnosti željeza. Boligon i sur. [351 objasnio je da DPPH test bolje detektira manje antioksidanse, zbog steričke dostupnosti ovih radikala. Pretpostavlja se da kvercetin-3-rutinozid s dvije vezne strane može izgraditi prilično velike komplekse sa željezom i stoga biti nedostupan za analizu. Kako spominju Kejić i sur. [8], to se može objasniti stvaranjem supramolekulskih kompleksa putem koordinacije metalnih iona. U kombinaciji s askorbinskom kiselinom, koja može graditi komplekse mješovite valencije u omjeru 1:2 [12], vjerojatno ti veći mješoviti kompleksi ne mogu djelovati s DPPH radikalom. Suprotno rezultatima u ovoj studiji, druge studije [18,37,38] su pomoću DPPH testa otkrile da su kompleksi kvercetin-3-rutinozida učinkovitiji antioksidansi od čistog kvercetin-3-rutinozida. Poznato je da kelatni kompleksi flavonoida i metalnih iona mogu poništiti radikalnu aktivnost kompleksiranih metalnih iona [39]. Jedina je razlika u tome što je u ovoj studiji korišten amonijev željezo (II) sulfat, umjesto željezovog (ⅡI) klorida ili sulfata, korištenog u radu Symonowicsa i Kolandeka [39].

Nađeni su sinergistički učinci između askorbinske kiseline i 5-kafeoilkininske kiseline u prisutnosti željeza u omjeru 2:1, te antagonistički učinci u omjeru 1:2. Kombinacija 5-kafeoilkininske kiseline sa željezom nije preporučena in vivo [6]. Međutim, ovo je istraživanje pokazalo da, in vitro, udvostručena količina askorbinske kiseline u usporedbi s 5-kafeoilkininskom kiselinom može čak imati sinergističke učinke na AOA. Daljnja istraživanja omjera mogla bi pokazati mogu li se pozitivni učinci postići i in vivo.

Prema podacima HPLC-a, dodavanje željeza uzorku imat će minimalan učinak na njegovu katalitičku aktivnost, jer se smanjila samo koncentracija askorbinske kiseline u 0 min kuhanim uzorcima. U uzorcima kuhane askorbinske kiseline, za razliku od uzoraka bez željeza, više koncentracije askorbinske kiseline dovele su do većeg omjera razgradnje.5-Kafeovlkininska kiselina i kvercetin-3-rutinozid trebaju dodatne čimbenike temperaturu i vrijeme, kao i interakcije u smjesama, kako bi djelovala katalitička aktivnost željeza. Kvercetin-3-rutinozid, u prisutnosti željeza, smanjio se tek u binarnim smjesama s askorbinskom kiselinom nakon termičke obrade. To bi moglo biti zbog činjenice da flavonoid djeluje kao primarni antioksidans, a zatim rezultirajući radikal spoja reagira s askorbinskom kiselinom, regenerirajući izvorni spoj [18]. 5-Čini se da je kafeoilkininska kiselina posebna jer štiti kvercetin-3-rutinozid, dok askorbinska kiselina ne može zaštititi kvercetin-3-rutinozid. Stoga 5-kafeoilkininska kiselina može biti ključna molekula za stabilizaciju sustava u kombinaciji sa željezom i toplinskom obradom. Ova hipoteza o 5-kafeoilkininskoj kiselini kao stabilizirajućoj molekuli dodatno je potvrđena u trokomponentnim smjesama. Ovdje je kvercetin-3-rutinozid uvijek stabiliziran 5-kafeoilkininskom kiselinom, tako da čak ni u prisutnosti askorbinske kiseline nije uočeno smanjenje koncentracije kvercetin-3-rutinozida. U drugoj studiji, 5-kafeoilkininska kiselina pokazala je zaštitna svojstva protiv razgradnje antocijana putem mehanizma ko-pigmentacije [40]. Novi produkti razgradnje, s vjerojatno većim AOA, pojavili su se iz sve tri tvari u prisutnosti željeza. Kafeinska kiselina (vrh 6) identificirana je kao 5-razgradni produkt kafeoilkininske kiseline (podaci nisu prikazani). To je dovelo do pretpostavke da bi druga tvar mogla biti kininska kiselina ili jedan od devet mogućih derivata koje su opisali Dawidowicz i Typek [24]: kininska kiselina;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-dihidroksifenil)-2-hidroksipropanoil]-1,4,5-trihidroksi-cikloheksan karboksilna kiselina;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-dihidroksifenil)-3-hidroksipropanoil]-1,4,5-trihidroksicikloheks-ankarboksilna kiselina; trans 3-O-kafeoilkininska kiselina; trans 5-O-kafeoilkininska kiselina; trans 4-O-kafeoilkininska kiselina; kafeinska kiselina; cis-5-O-kafeoilkininska kiselina; 4,5-dikafeoilkininska kiselina. Za kvercetin-3-rutinozid, produkt razgradnje se pojavljuje u kromatogramu, koji se nije mogao identificirati.

3.4. Sposobnost stvaranja kelata s željezom (Fe3 plus) i željezom (Fe2 plus)

U svim uzorcima koji sadrže askorbinsku kiselinu, feri željezo je reducirano u feri željezo. U ovom procesu,askorbinska kiselinauzima elektron od feri željeza i reducira ga u fero željezo, te sam postaje radikal. Nestabilni radikal se brzo pretvara u dehidroaskorbinsku kiselinu i produkte daljnje razgradnje [12]. Zbog nedostatka hidroksi peroksida, povratna reakcija u feri željezo putem Fentonovog ciklusa nije moguća. U 0 min kuhanih binarnih smjesa, više od 20 posto željeza bilo je vezano u prisutnosti askorbinske kiseline. Poznato je da askorbinska kiselina stvara komplekse sa željeznim vrstama i drugim metalnim ionima keliranjem preko 3-O i 2-O jezgri nakon istiskivanja vodika iz 3-OH i 2- OH grupe [16,17,41. Također može formirati komplekse željezo-askorbat miješane valencije [42]. Međutim, askorbinska kiselina slabo je kelirajuće sredstvo i, nakon kuhanja, otkriveni su samo tragovi vezanog željeza u čistim i miješanim uzorcima kada je prisutna askorbinska kiselina. Nadalje, zbog procesa kuhanja, askorbinska kiselina se razgrađuje na proizvode razgradnje, koji izgleda ne mogu kelirati sa željezom.

5-Kafeoilkininska kiselina je relativno slab reducent. Feri-željezo reducira 5-kafeoilkininska kiselina, a s produljenim kuhanjem redukcija se povećava.5-Kafeoilkininska kiselina kelatira feri-željezo u prijenosu naboja liganda na metal [17].5-Kafeoilkininska kiselina nosi jednu moguću veznu stranu na 3,4 endiolnoj strukturi kavene kiseline. To bi mogao biti pokazatelj zašto je kafeinska kiselina bioaktivni dio 5-kafeoilkininske kiseline, dok kininska kiselina gotovo da nema AOA [43]. Endioli su inhibirali stvaranje OH zbog stvaranja kompleksa željeza [41] u omjeru jedan prema jedan [44,45]. Lamy i sur. [46] zaključuju da 5-kafeoilkininska kiselina tvori monomerne komplekse, dok Kiss i sur. [47] pronašli su oligomerne vrste. Suprotno prethodnim studijama [17,48], pronađeni su samo tragovi vezanog željeza u prisutnosti 5-kafeoilkininske kiseline prije i poslije termičke obrade. To se može objasniti neutralnim pH uvjetima u ovoj studiji, dok su druge studije radile u kiselom mediju, na temelju pH vrijednosti od 1-2.5 u ljudskom želucu [48]. U pohranjenim uzorcima nakon nekoliko sati nađen je crni talog, što je pokazatelj kompleksa 5-kafeolinska kiselina-feri željezo. Za analizu su korišteni nedavno miješani uzorci, tako da je za stvaranje ovih kompleksa pri neutralnom pH potrebno duže vrijeme. Kompleksi željeza s kavenom kiselinom pokazali su slabu aktivnost čišćenja [49]. Nadalje, nema spektrofotometrijskih dokaza za reakciju između kininske kiseline i feri željeza [48]. Za razliku od 5-kafeoilkininske kiseline, u uzorku kvercetin-3-rutinozida pronađeno je vezano željezo, čak i nakon termičke obrade.

Kvercetin-3-rutinozid reducira feri željezo u fero željezo uz minimalno povećanje produljenim vremenom kuhanja. Ovu umjerenu reducirajuću aktivnost kvercetin-3-rutinozida prethodno su opisali Mira et al. [50]. Aktivnost redukcije željeza kvercetin-3-rutinozida otkrivena je u 3-rutinozidu, 5,7,3',4'-OH [50]. Umjerena interakcija s feri željezom može se objasniti nižim brojem -OH skupina, što je rezultiralo manjom gustoćom negativnog naboja na strani kelacije [50]. Flavonoidi mogu kelirati s metalnim ionima na tri potencijalne koordinacijske strane: (i) između 5-hidroksi i 4-karbonilnih skupina, (ii) između 3-hidroksi i 4-karbonilnih skupina, i (ii) između 3', A'-hidroksi skupina u Bringu [39]. Kvercetin-3-rutinozid koristi vezne strane (i) i (i)[9], a na 3-hidroksi skupinu je vezan rutinozid. Spektralni podaci su čak pokazali da su metalni ioni vezani samo na 3', A'-hidroksi skupinu [18]. Kelati su učinkovitiji sa željezom u njegovom dvovalentnom obliku [50]. U binarnim smjesama, kvercetin-3-rutinozid nije u stanju formirati komplekse kada je prisutna askorbinska kiselina, za razliku od ternarnih smjesa. Ako je prisutna 5-kafeoilkininska kiselina, nalaze se male količine vezanog željeza. To ukazuje da 5-caffeoylquinic štiti molekule kvercetin-3-rutinozida u prisutnosti askorbinske kiseline, tako da kvercetin-3-rutinozid može tvoriti komplekse sa željezom.

4. Materijali i metode

4.1.Kemikalije

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 posto), željezo (III) amonij sulfat dodekahidrat i željezo (III) amonij sulfat heksahidrat kupljeni su od Carl Roth (Karlsruhe, Njemačka).

4.2.Uzorci

Vodene otopine i mješavine autentičnih standarda askorbinske kiseline, {{0}}kafeoilkininske kiseline i kvercetin-3-rutinozida pripremljene su kao čiste otopine i smjese u različitim omjerima. Sve moguće binarne smjese napravljene su u ekvimolarnim omjerima, a neekvimolarnim omjerima s jednim spojem udvostručenim. Ternarne smjese također su pripravljene u ekvimolarnim omjerima, kao iu neekvimolarnim omjerima s jednim odnosno dva spoja udvostručena. Konačne koncentracije antioksidansa bile su 0.3 mM za svaku ispitivanu otopinu. Dodatno, svi eksperimenti su ponovljeni nakon dodatka 0.3 mM željeza ({{10}}.15 mM fero željeza i 0.15 mM fero željeza) ukupno po smjesi. Odabrane količine antioksidansa i željeza ne temelje se na fiziološkim ili prehrambenim razinama, one se temelje na molarnim masama za proučavanje učinka molekularne interakcije. Posljedično, utvrđen je ekvimolarni omjer ukupnih antioksidansa i željeza. Sve su smjese kuhane 0, 10, 20 i 40 minuta u kipućoj vodi, a zatim ohlađene na ledu kako bi se zaustavio proces zagrijavanja. Ovo je učinjeno za tri neovisna ponavljanja.

4.3. Fotometrijska mjerenja

Antioksidansi(čisto ili miješano) u odsutnosti i prisutnosti željeza mjerena je njihova ukupna redukcijska aktivnost i antioksidacijska aktivnost u tri neovisna tehnička ponavljanja pomoću metode visoke propusnosti u 96-pločama s jažicama (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, SAD). Korišteni su različiti testovi zbog različitih reakcijskih mehanizama: prijenos jednog elektrona (SET) i prijenos atoma vodika (HAT). Dok se test TEAC i TPC temelji na SET [17,18], za test DPPH testa literatura nije sasvim jasna temelji li se na SET, HAT ili čak na kombinaciji ova dva mehanizma [{{6} }]. Nedavna studija koju je proveo Foti [51] otkrila je da fenoli mogu reagirati s DPPH putem sekvencijalnog prijenosa elektrona s gubitkom protona (SPLET), kombinacijom dvaju mehanizama. Čimbenici, poput srednjeg polariteta i potencijala ionizacije, utječu na prevladavajući mehanizam.

4.3.1. Ukupni sadržaj fenola (TPC)

Ukupni sadržaj fenola (TPC) određen je Folin-Ciocalteu metodom u 96-ploči s jažicama, koju su prethodno opisali Bobo-Garcia et al.[52] uz neke izmjene.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Uobičajeni naziv ovog testa dovodi u zabludu jer Folin-Ciocalteuov reagens također reagira na nefenolne spojeve, kao što su vitamini i minerali [22]. On bolje opisuje "ukupnu reducirajuću aktivnost" bioaktivnih spojeva.

4.3.2. Trolox ekvivalentni antioksidativni kapacitet (TEAC)

Antioksidacijska aktivnost određena je pomoću TEAC testa u 96-ploči s jažicama uz neke modifikacije. Pripremljena je osnovna otopina s 9,6 mg ABTS i 1,66 mg kalijevog persulfata napunjena s H2O do 25 mL i inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi 12-16 h. Iz ove osnovne otopine, pripremljena je radna otopina TEAC, koja sadrži 5 mL osnovne otopine napunjene do 25 mL sa 100 posto MeOH.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Uklanjanje radikala

Theantioksidansactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Sinergizam i antagonizam

Za analizu sinergističkih i antagonističkih učinaka antioksidativnog djelovanja napravljena je usporedba eksperimentalno dobivenih rezultata s teorijskim vrijednostima izračunatim zbrojem učinaka pojedinih komponenti pri odgovarajućoj koncentraciji [53]. Sinergizam opisuje interakciju dviju ili više tvari tako da je kombinirano djelovanje veće od zbroja djelovanja svake zasebno. Suprotno tome, antagonizam je fenomen gdje interakcija dviju ili više tvari u kombinaciji ima ukupni učinak koji je manji od zbroja njihovih pojedinačnih učinaka.

4.5. Određivanje ionskog željeza

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Razlika između ukupnog željeza i ionskog željeza, zbroj fero i feri željeza, jest vezano željezo.

4.6.HPLC-DAD

Za kvantificiranje antioksidansa askorbinske kiseline, 5-kafeoilkininske kiseline i kvercetin-3-rutinozida i njihovih produkata razgradnje u istim ekstraktima koji se koriste za fotometrijsku

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） su pripremljeni. Izvedeni spojevi provizorno su identificirani analizom čistih standarda u prisutnosti i odsutnosti željeza prije i poslije toplinske obrade. Stoga novi maksimum mora proizaći iz umetnutog standarda. Nadalje, odabrane smjese izmjerene su pomoću HPLC-MS kako bi se potvrdila predložena struktura.

4.7. Statistička analiza

Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, SAD) i R Statistics (verzija 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020.) korišteni su za biostatističke testove te predstavljanje i crtanje rezultata podataka. Inferencijalna statistika za procjenu i povezivanje tretmana provedena je korištenjem trosmjerne analize varijance (ANOVA), post hoc Tukeyjevog HSD testa i Pearsonove korelacije. Korišteni R paketi bili su ggplot2 [55], mean [56] i multcomp [57].

5. Zaključci

Na temelju gore opisanih otkrića, na AOA askorbinske kiseline, 5-kafeoilkininske kiseline i kvercetin-3-rutinozida utjecala je njihova struktura molekule, koncentracija, omjer i interakcije s drugim antioksidansima i željezom. Čini se da interakcija posebno igra ulogu u AOA kada se kombinira askorbinska kiselina i 5-kafeoilkininska kiselina. Ovdje su otkriveni sinergistički i antagonistički učinci. Temperatura je minimalno utjecala na AOA, dok je istovremeno temperatura utjecala na stabilnost svih antioksidansa u pojedinim smjesama, posebice u prisutnosti željeza. Samo se koncentracija askorbinske kiseline smanjila u nedostatku željeza s produljenim vremenom kuhanja, a koncentracija 5-kafeoilkininske kiseline smanjila se samo u prisutnosti željeza, dok se koncentracija kvercetin-3-rutinozida smanjila samo u kombinaciji s askorbinskom kiselinom u prisustvo željeza. U kombinaciji sa željezom, 5-kafeoilkininska kiselina je mogla zaštititi druge molekule od smanjenja njihove koncentracije termičkom obradom.

U biljkama su kombinacije askorbinske kiseline, 5-kafeoilkininske kiseline i kvercetin-3-rutinozida ne samo moguće nego i uobičajene. Dakle, ovi rezultati daju osnovna znanja o procesima koji se odvijaju tijekom kuhanja povrća. Matrice hrane su složenije i sadrže bezbrojne bioaktivne spojeve, uključujući enzime, druge minerale ili kiseline, koji mijenjaju uvjete reakcije ili su sami reaktanti. Te složene interakcije daleko su izvan opsega ove studije, a korisne koncentracije i interakcijeantioksidansiu kuhanom povrću treba se pozabaviti u budućnosti.

Reference

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Učinak kakaa u dijabetesu: potencijal gušterače i jetre kao ključnih ciljnih organa, više od antioksidativnog učinka? Int. J. Food Sci. Technol. 2016, 51, 829–841. [CrossRef]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenoli, polifenoli i tanini: pregled. Sekundarni metaboliti u biljkama: pojava, struktura i uloga u ljudskoj prehrani; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., ur.; Blackwell Publishing: Hoboken, NJ, SAD, 2006.; str. 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Prijelazni metali kao katalizatori reakcija "autooksidacije". Slobodan Radić. Biol. Med. 1990, 8, 95–108. [CrossRef]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW Učinak toplinske obrade na flavonole rutin i kvercetin. Rapid Commun. Maseni spektar. 2006, 20, 3229–3235. [CrossRef]

5. Layrisse, M.; García-Casal, MN; Solano, L.; Barón, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramírez, J.; Leets, I.; Tropper, E. Bioraspoloživost željeza kod ljudi iz doručka obogaćenog željeznim bis-glicin kelatom, fitatima i polifenolima. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Cook, JD Inhibicija nehemičke apsorpcije željeza kod čovjeka pićima koja sadrže polifenol. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostjuk, VA; Potapovich, AI Antiradikalni i kelirajući učinci u zaštiti flavonoida od ozljeda stanica izazvanih silicijevim dioksidom. Arh. Biochem. Biophys. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

9. Kejík, Z.; Kaplánek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipenský, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Sýkora, D.; Martásek, P.; et al. Kompleksi željeza s flavonoidima - antioksidativni kapacitet i više od toga. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Analiza odnosa strukture i aktivnosti monomernih i polimernih polifenola (kvercetin, rutin i katehin) dobivenih različitim metodama polimerizacije. Chem. Bioronioci. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lú-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: Pregled metoda ekstrakcije, identifikacije i pročišćavanja, bioloških aktivnosti i pristupa za povećanje njegove bioraspoloživosti. Trends Food Sci. Technol. 2017, 67, 220–235. [CrossRef]