Dio 1: Homoarginin ublažava dijabetičku nefropatiju neovisno o sintazi dušikovog oksida-3

Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Sažetak

Nedavno smo pokazali da nadomjestak homoarginina daje zaštitu bubrega u modelima dijabetičkih miševa. U ovoj smo studiji testirali je li zaštitni učinak homoarginina neovisan o sintazi dušikovog oksida-3 (NOS3) kod dijabetičke nefropatije (DN). Eksperimenti su provedeni na miševima s nedostatkom NOS3 (NOS3-7) i njihovom divljem tipu srodnika iz legla korištenjem više niskih doza nosača ili streptozotocina i tretiranih homoargininom putem vode za piće tijekom 24 tjedna. Dodatak homoarginina tijekom 24 tjedna u dijabetičkih NOS3-/ miševa značajno je oslabio albuminuriju, povećani dušik uree u krvi, histopatološke promjene i fibrozu bubrega, fibrotične markere bubrega i regrutiranje bubrežnih makrofaga u usporedbi s dijabetičkim NOS-om liječenim nosačem3- / miševi. Nadalje, dodatak homoarginina obnovio je mitohondrijsku funkciju bubrega nakon dijabetesa. Važno je da nije bilo značajnih promjena u ekspresiji mRNA NOS1 ili NOS2 u svim skupinama. Osim toga, dodatak homoarginina poboljšao je srčanu funkciju i smanjio srčanu fibrozu nakon dijabetesa. Ovi podaci pokazuju da je zaštitni učinak homoarginina neovisan o NOS3, što će u konačnici promijeniti naše razumijevanje mehanizma(a) kojim homoarginin inducira renalnu i srčanu zaštitu kod DN. Zaštitni učinak homoarginina u DN mogao bi biti posredovan poboljšanjem mitohondrijske funkcije.

Ključne riječi: srčana funkcija, dijabetička nefropatija, homoarginin, NOS3

Kliknite da saznate za što se koristi cistanche

1. UVOD

Dijabetesje ozbiljan i sve češći uzrok pobola i smrtnosti u Sjedinjenim Državama, s procijenjenim 12-14 posto odraslih osoba s dijabetesom, s čak višim stopama među etničkim manjinama (Gao et al, 2016; Menke et al, 2015) . Ekonomski gubici i gubici produktivnosti zbog dijabetičkih komplikacija iznose više od 245 milijardi USD i dovode do fizioloških i psiholoških učinaka uključujući sustavneupala, bubrežna i srčana disfunkcija, depresija i socijalna anksioznost (Jha i sur., 2018; Menke i sur., 2015; Moreno i sur., 2018; Tao i sur. 2015; Vanstone i sur., 2015). Dijabetička nefropatija (DN) je kronični progresivni poremećaj koji dovodi do brzog pada i završnog stadija zatajenja bubrega. Tijekom posljednjeg desetljeća učestalost zatajenja bubrega zbog dijabetesa udvostručila se. Tradicionalne terapije, uključujući kontrolu krvnog tlaka i glukoze te druge promjene načina života, bile su samo skromno uspješne u odgađanju napredovanja zatajenja bubrega. Stoga je važno identificirati mehanizme uključene u razvoj i progresiju dijabetesabolest bubrega. Cistanche deserticolapripada tradicionalnoj kineskoj medicini i lijek je za tonificiranje bubrega. Uglavnom se koristi za nedostatak yang-a, kao što su bolovi u leđima, bolovi u leđima, impotencija, itd. Međutim, većina dijabetičara ima nedostatak yina, a ako imaju nedostatak yang-a, mogu ga uzimati na odgovarajući način. Međutim, treba ga koristiti s oprezom kod manifestacija negativne topline kao što su strah od vrućine i noćno znojenje te suha usta. U svakom slučaju prvo se posavjetujte s liječnikom.

Homoarginin, endogeni analog arginina, koji nije uključen u sintezu proteina, pojavio se kao novi igrač u zdravlju i bolesti (Pilz et al., 2015). Homoarginin se sintetizira mitohondrijskom arginin: glicin amidinotransferazom (AGAT) u bubrezima koristeći L-arginin i L-lizin kao supstrate (Choe et al., 2013; Ryan & Wells, 1964), a katabolizira pomoću alanina: glioksilat aminotransferaze 2 (AGXT2) (Rodionov i sur. 2016.). Koncentracije homoarginina u plazmi u obrnutoj su korelaciji s rizikom od kardiovaskularnih bolesti i ukupne smrtnosti (Jud et al., 2018; Marz et al, 2010), povećanim rizikom od smrtonosnih moždanih udara (Haghikia et al., 2017), kongestivnog zatajenja srca i hipertrofija lijeve klijetke (Atzler i sur., 2013., 2017.; Bahls i sur., 2018.; Pilz, Edelmann i sur., 2014.), starenje (Atzler, Schwedhelm i sur., 2014.; Marz i sur., 2010.) , pušenje (Atzler, Gore i sur., 2014.; Sobczaket sur., 2014.; Vogler sur., 2015.; Zwan i sur., 2013.), indeks tjelesne mase (Atzler, Gore i sur., 2014.; Marz i sur., 2010. ; Pilz, Teerlink i sur., 2014.) i trudnoća (Valtonen i sur., 2008.). Niske razine homoarginina djeluju kao pokazatelj srčane disfunkcije, s povezanim visokim razinama asimetričnog dimetilarginina (ADMA) (Atzler, Schwedhelm i sur., 2014.; Jud i sur., 2018.; Kayacelebiet sur., 2014.; Pilzet sur., 2015. ; Vogler al, 2015). Učinci niske razine homoarginina na proizvodnju/djelovanje dušikovog oksida (NO) povezani su s povećanim rizikom od moždanog udara i ateroskleroze (Haghikia et al, 2017). Endotelna sintaza dušikovog oksida (NOS3) konstitutivno se eksprimira u endotelnim stanicama i funkcionira tako da prilagodi unutarstanične razine NO kao odgovor na razine kalcija (Zanchi i sur., 2000.). Homoarginin može pridonijeti sintezi NO služeći kao supstrat za NOS jer se homoarginin, čak i sa svojim slabijim afinitetom prema NOS u usporedbi s argininom, može metabolizirati u NO i homocitrulin (Drechsler et al., 2011). U bubrezima, nizak homoarginin snažan je čimbenik rizika za iznenadnu srčanu smrt i smrt zbog zatajenja srca u bolesnika na hemodijalizi (Drechsler i sur., 2011.). Nadalje, niske razine homoarginina povezane su s povećanim kardiovaskularnim rizikom u pacijenata s transplantiranim bubregom (Kayacelebi et al., 2017). I kod životinja (Banchaabouchi et al., 2001; Tofuku et al., 1985) i ljudi (Drechsler et al. 2013) s kroničnim oštećenjima bubrega, razine homoarginina su smanjene, a niske razine homoarginina u plazmi bile su značajno povezane sa smanjenom brzinom glomerularne filtracije (GFR) i proteinurijom (Ravani et al., 2013). Iako su epidemiološki podaci pokazali da su smanjene razine homoarginina povezane s povećanom smrtnošću od bolesti bubrega i kardiovaskularnih bolesti (Drechsler i sur., 2015.; Jud i sur., 2018.; Marz i sur., 2010.; Ravani i sur., 2013.), izravni fiziološki mehanizmi homoarginina ostaju nejasni. Prethodno smo pokazali da je homoarginin učinkovit tretman za DN (Wetzel et al., 2019). Međutim, mehanizam djelovanja homoarginina kod bubrežne i srčane disfunkcije nije poznat.

U trenutnoj studiji testirali smo hipotezu da je zaštitni učinak homoarginina na bubrežne i srčane funkcije kod dijabetesa neovisan o NOS3. Naši rezultati pokazuju da homoarginin posreduje u zaštiti bubrega i srca u dijabetičkih NOS3-一 miševa, što će u konačnici promijeniti naše razumijevanje mehanizma(a) pomoću kojih homoarginin ublažava dijabetičku ozljedu bubrega. Zaštitni učinak homoarginina u DN mogao bi biti posredovan poboljšanjem mitohondrijske funkcije.

2. MATERIJALI I METODE

2.1 Model dijabetičkog miša

Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su na mužjacima 6-tjedno starih miševa (The Jackson Laboratory, Bar C57BL/6J ili NOS3-1-Harbor, ME). Miševi su držani na 23 stupnja C i ciklusu svjetlo-tama 12:12 sa slobodnim pristupom standardnoj hrani i vodi. Dijabetes je izazvan intraperitonealnom injekcijom 50 mg/kg streptozotocina (STZ) ili kontrolom fiziološke otopine nakon 6- h gladovanja tijekom 5 uzastopnih dana. Svi su postupci obavljeni ujutro tijekom cijelog ispitivanja. Razine glukoze u krvi mjerene su kod miševa koji nisu gladovali pomoću Contour Next EZ glukometra s Contour Next trakama iz mišje repne vene, pri čemu je miševima s dijabetesom definirana razina glukoze u krvi iznad 350 mg/dl. L-homoarginin (Sigma, St. Louis MO, br. kat.: H1007) dodan je u vodu za piće u koncentraciji od 50 mg/L kako je prethodno opisano (Wetzel et al., 2019.) i zamijenjen svaka 4 dana. Na kraju studije (24 tjedna),24-h uzorci urina su prikupljeni, miševi su eutanazirani pomoću intraperitonealne injekcije koktela ketamin/ksilazin; plazma je dobivena srčanom punkcijom, a bubrezi i srca su uklonjeni za daljnja istraživanja. Za prikupljanje urina, miševi su pojedinačno stavljeni u metaboličke kaveze na 16 sati sa slobodnim pristupom pitkoj vodi, a urin je skupljan u epruvete za prikupljanje koje sadrže 200 ul mineralnog ulja koje sprječava isparavanje urina. Krv je sakupljena srčanom punkcijom i centrifugirana na 3000 g tijekom 3 minute na 4 stupnja da se odvoji plazma. Nakon prikupljanja svi su uzorci pohranjeni na -80 stupnjeva C do analize. Broj miševa po skupini dan je u Tablici 1. Uzorci dobiveni od Ins2Aita miševa dobiveni su kako je prethodno opisano (You et al., 2015.). Sve pokuse na životinjama odobrio je Institucionalni odbor za brigu i korištenje životinja Sveučilišta Texas u San Antoniju.

2.2 Imunohistokemija

Tkiva mišjeg bubrega fiksirana su u 10-postotnom formalinu i uklopljena u parafin, a rezovi od 3- μm su izrezani. Imunohistokemija je provedena na rezovima ugrađenim u parafin s anti-mišjim Mac-2 antitijelima (klon M3/38; Cedarlane, Burlington, NC) kako je prethodno opisano (Youet al., 2013, 2014). Slike su snimljene mikroskopom Olympus BX60 i digitalnim fotoaparatom Olympus Q-Color3 pomoću softvera za slike Q-capture Pro 7. Broj glomerularnih makrofaga izbrojan je u 20 glomerula po presjeku (broj makrofaga u glomerulima podijeljen s brojem glomerula) na slijepi način pod povećanjem od 40x i prosječan kao što je prethodno opisano (Morris et al., 2011.; Wetzel i sur., 2019.; Vi i sur., 2013., 2014.).

2.3 Histopatologija bubrega i srca

Bubrezi i srca fiksirani su u 4-postotnom paraformaldehidu, uklopljeni u parafin i izrezani su 5-µum rezovi. Sekcije su obojene Massonovim trikromom ili Schiffovom periodičnom kiselinom (PAS), ispitane na slijepi način, a rezultati su prosječni. Za određivanje postotka površine fibroze, Massonove trikromne slike dobivene su pri 10x i analizirane u ImageJ za mjerenje postotka površine fibroze. Reprezentativne slike snimljene su mikroskopom Olympus BX60 i digitalnim fotoaparatom Olympus Q-Color3 pomoću softvera za slike Q-capture Pro 7. Karakteristike glomerula mjerene su pomoću softvera Bioquant Osteo (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN), a postotak indeksa ozljede izračunat je kako je prethodno opisano (Mohan et al., 2008.). Za svaki bubreg, dobili smo 12 slika i analizirali glomerul za svako polje da bismo izračunali prosjek za svaku životinju za statističku analizu.

2.4 Analitička metodologija

Koncentracija albumina u urinu mjerena je ELISA-om pomoću kompleta Albuwell M (Excell, Philadelphia, PA) kako je prethodno opisano (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al., 2015.). Kreatinin u mokraći mjeren je Diazyme kreatininskim testom (Diazyme Laboratories, Poway, CA) (Awad i sur., 2011.; Awad, You, Gao, Cooper i sur., 2015.). Dušik iz uree u krvi (BUN) određen je pomoću QuantiChrom pribora za analizu uree (BioAssay Systems, Hayward, CA) kako je prethodno opisano (You et al., 2017). Sistolički tlak kod miševa mjeren je pomoću CODA sustava neinvazivnog krvnog tlaka (Kent Scientific Corporation, Torrington CT) kako je prethodno opisano (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al., 2015.). Miševi su aklimatizirani 10 minuta na 26 stupnjeva prije početka očitanja. Očitavanja su uzeta u isto doba dana za sve skupine kako bi se spriječile bilo kakve dnevne varijacije.

2.5 Mjerenja srčane funkcije

Serijska ehokardiografija B-moda i M-moda provedena je pomoću Vevo 2100 Imaging Platform (VisualSonics, Toronto, Kanada) pomoću 30-MHz linearne sonde za precizno praćenje srčanih hemodinamskih parametara i procjenu strukture srca miševa nakon 22 tjedna liječenja homoargininom. Ejekcijska frakcija lijeve klijetke (EF) i frakcijsko smanjenje lijeve klijetke (FS) kvantificirani su korištenjem M-moda kao što je prethodno opisano (lorga et al., 2016, 2018).

2.6 Izolacija RNA i PCR u stvarnom vremenu

RNA je izolirana Trizol ekstrakcijom iz cijelih dijelova bubrega i obrnuto transkribirana u cDNA korištenjem Bio-Rad (Hercules, CA)script kompleta za sintezu DNA. PCR u stvarnom vremenu proveden je na CFX384 sustavu u stvarnom vremenu (Bio-Rad, Hercules, CA) upotrebom Tagman početnica za mišje MCU (Mm0116873_m1), fibronektin (Mm01256744_m1), rast tumora faktor (TGF, Mm01178820_m1), NOS1(Mm00435175_m1), NOS2(Mm00440502_m1) i Rn18S (Mm03928990_gl)(Thermo Fisher, Waltham, MA). Vrijednosti Ct normalizirane su na 18S i uspoređene s uzorcima NOS3. Primeri za aktin glatkih mišića (FW:5'-CTGCCGTTTTCCCCCTTCCTG-3', RV:5'-TTGCTTCCTCCTCCTTTG-3'),E-kadherin (FW: 5'-TGAGTGTGTGGGTGCTGA-3',RV:5'-CGGTTTC AATGGCTTACCTTTTCC-3') i -aktin (FW:5'-GC TGGTTGTGTAAGGTAAGGTGTGC-3',RV: 5'-GAGG GGGTTGAGGTGTTGAGG-3) dobiveni su od Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Uzorci cDNA analizirani su pomoću SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, Rockford IL), kao što je prethodno opisano (Morris et al., 2011.), i normalizirani na -aktin za usporedbu s uzorcima NOS3-/-.

2.7 Western blotting

Bubrežno tkivo homogenizirano je u RIPA puferu koji sadrži {{0}}.1 posto Tritona X-100 s dodatkom inhibitora proteaze (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) i očišćeno centrifugiranjem na 10,{{4} } g 10 minuta na 4 stupnja, a supernatant je sakupljen. Koncentracija proteina određena je testom bicinhonske kiseline (BCA) (Thermo Scientific, Waltham, MA). Uzorak od 50 ug bubrežnog lizata odvojen je na 4-12 postotnom Bis-Tris gelu (Life Technologies, Carlsbad, CA) i prenesen na PVDF membrane prije blokiranja s 5 postotnim suhim mlijekom. Western blotovi su izvedeni korištenjem sljedećih antitijela: MiCU1 (0,4 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) i -aktin (1:1000; Cell Signaling, Danvers, MA) antitijela. Western blotovi su kvantificirani pomoću softvera ImageJ (NIH, Bethesda, MD) i normalizirani na ekspresiju proteina -aktina.

2.8 Statistička analiza

Usporedbe između svih grupa provedene su pomoću softvera GraphPad Prism (verzija 7.04, San Diego, CA). Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. Jednosmjerna ANOVA praćena Fisherovim testom razlike najmanje značajnosti korištena je za usporedbu značajnosti između skupina. Vrijednost p<0.05 represented="" a="" significant="">