Dio Ⅱ Nedostatak Smad3 poboljšava terapiju dijabetesa i dijabetičke ozljede bubrega koja se temelji na otočićima promicanjem proliferacije stanica putem mehanizma ovisnog o E2F3-
May 25, 2023
Metode
1. Životinje
Smad3-null (Smad3KO) miševi ljubazan su dar prof. Chuxia Denga i održavaju se u heterozigotima (Smad3 plus /- ) u pozadini C57BL/6 [20]. Smad3KO miševi stvoreni su međusobnim križanjem Smad3 plus /- miševa. Db/db miševi s mutacijom Lepra (leptinski receptor) u pozadini C57BLKS kupljeni su od Eksperimentalnog centra za životinje Kineskog sveučilišta u Hong Kongu (CUHK). Sve su životinje držane u posebnom objektu bez patogena (SPF) sa slobodnim pristupom hrani i vodi u ciklusu dan/noć od 12/12 sati. Sve manipulacije životinjama u ovoj studiji izvedene su u skladu s propisima i odobrene od strane Etičkog odbora za pokuse na životinjama CUHK-a s Ref. Ne. 18-177-MIS.
2. Streptozocinom (STZ)-induciran dijabetički mišji model
Mužjaci miševa C57BL/6 u dobi od 8-10 tjedana intraperitonealno su ubrizgavani s 50 mg/kg/dan STZ dnevno tijekom 5 neprekidnih dana. 5 dana nakon posljednje injekcije STZ, miševi sa stabilnom nasumičnom glukozom u krvi od više od 16 mM tijekom 2 uzastopna dana smatrani su uspješnim uspostavljanjem dijabetesa i korišteni su kao miševi primatelji za transplantaciju otočića.
3. Izolacija otočića, transplantacija i procjena dijabetičkog fenotipa
Otočići su izolirani iz muških ili ženki Smad3 knockout (KO) ili divljeg tipa (WT) miševa u dobi od 8-10 tjedana kako je prethodno opisano [21]. Kako bi se izvršila transplantacija otočića, naznačeno je da je nekoliko otočića transplantirano ispod bubrežne kapsule mužjaka db/db miševa u dobi od 4 tjedna ili miševa s dijabetesom izazvanim STZ-om 7. dana nakon posljednje injekcije STZ-a prema protokolu koji su opisali Szot i sur. 22]. Ukratko, miš primatelj anesteziran je anestezijom Combo (1,5 posto ketamina i 0.15 posto ksilazina, 6 μL/g tjelesne težine). Nakon gubitka svijesti učinjen je rez od 1 cm na koži na lijevom bubregu. Nježno izvucite bubreg i održavajte ga vlažnim sterilnom fiziološkom otopinom tijekom operacije. Iglom od 25G napravite malu ogrebotinu na kapsuli kako biste napravili zarez. Navedeni broj otočića isporučen je u bubrežnu kapsulu PE50 cijevi. Uostalom, otočići su transplantirani, zapečatite zarez kauterizacijom na laganoj vatri. Zamijenite bubreg i zatvorite peritoneum šavovima. Zatvorite kožu spajalicama. 100 µL otopine penicilina i streptomicina (Gibco, kat. br. 15140122, SAD) injicirano je intraperitonealno kako bi se spriječila infekcija. 100 μL Tegmica ubrizgano je intramuskularno za ublažavanje boli. Životinja je stavljena u toplo okruženje do potpunog oporavka. Isti operativni postupak također je proveden u lažno kontrolnim miševima, ali bez infuzije otočića. I nasumične razine i razine glukoze u krvi natašte (RBG i FBG) u krvi vrha repa provjeravane su svaki tjedan prijenosnim mjeračem glukoze (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Test inzulinske rezistencije (IPITT), test tolerancije glukoze (IPGTT), razine HbA1c i inzulin u serumu mjereni su kao što je prethodno opisano [9].
Kliknite ovdje za preuzimanjekoristi Cistanche
4. Ukupni proteini u mokraći i kreatinin u serumu
24-satni urin je sakupljen u metabolički kavez. 24-satni ukupni urinarni protein izračunat je množenjem volumena urina i koncentracije urinarnog proteina koji je kvantificiran Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, kat. br. 5000201, SAD). Kreatinin u serumu određen je kitom za kvantificiranje kreatinina (Stanbio Laboratory, cat# 0430-120, USA).
5. Histopatologija
Bubrežne histopatološke promjene ispitane su u rezovima fiksiranim paraformaldehidom, u parafinu (4 µm) sa Schiffovim (PAS) reagensom kao što je prethodno opisano [23]. Proširenje mezangijskog matriksa ocijenjeno je korištenjem kvantitativnog slikovnog programa (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics) kako je prethodno opisano [23].
6. Imunohistokemija
Bubreg ili gušterača s otočićima fiksirani su u 4 posto paraformaldehida, uklopljeni u parafin i izrezani na 4 μm. Nakon rehidracije, rezovi su tretirani mikrovalnom rekreacijom antigena u 0.01 M citratu (pH 6.0) 10 minuta i blokirani u 5 posto BSA 1 sat . Primarna inkubacija antitijela izvedena je preko noći na 4 stupnja. Za fluorescentno bojenje, fluorescentno sekundarno protutijelo primijenjeno je na sobnoj temperaturi (RT) tijekom 1 sata. Za termogenezu posredovanu DAB-om, dodatni korak od 3 posto H2O2 blokiranja tijekom 15 minuta bio je uključen prije pronalaska antigena. Nakon primarne inkubacije antitijela, dodan je HRP-konjugirani polimer (Envision plus System, Dako, SAD). Za bojenje E2F3, pronalaženje antigena provedeno je u otopini EDTA-Tris (pH 9,0). Protutijela koja se koriste u imunohistokemiji detaljno su navedena u tablici S2. Područje pozitivno na bojenje kvantificirano je softverom Image J (v1.47, NIH, SAD).
Ekstrakt cistanče
7. Mjerenje presađene stanične mase u bubregu koji nosi otočiće
Indeks prosječne stanične površine po presjeku korišten je za polu-kvantitativno kvantitativno određivanje stanične mase u presađenoj otočiću. Ukratko, bubreg koji nosi otočiće (ugrađen u parafin) presječen je sukcesivno na 4 μm duž sagitalne osi. Kontinuirane sekcije u intervalima od 160 µm fluorescentno su imunološki obojene na inzulin. Najmanje 6 sekcija s inzulinom pozitivnim bojanjem korišteno je za izračunavanje stanične površine po sekciji kod svakog miša. Područje stanica pozitivnih na inzulin u svakom odjeljku kvantificirano je softverom Image J (v1.47, NIH, SAD). Indeks prosječne stanične površine po sekciji kod svakog miša izračunat je dijeljenjem ukupne inzulin-pozitivne površine u sve sekcije s brojem inzulin-pozitivnih sekcija.
8. Primarna kultura stanica otočića
Izolirani otočići su disocirani u pojedinačne stanice i nasađeni u 96-ploču s jažicama u 200 μL RPMI 1640 (Gibco, SAD) plus 10 posto FBS (Gibco, SAD) plus 1 posto penicilin-streptomicin (Gibco, SAD) dopunjen sa 20 mM glukoze. Stanice otočića uzgajane su navedeno vrijeme u inkubatoru postavljenom na 37 stupnjeva, 5 posto CO2 i 100 posto vlažnosti. Za obaranje E2F3 posredovano adenovirusom, disocirane stanice otočića uzgajane su u mediju koji je sadržavao adenovirus koji prekomjerno eksprimira RNK kratke ukosnice (shRNA) ciljajući mišji E2F3 (shE2F3) ili kontrolnu nespecifičnu shRNA (prikazano) u titru od 10 pfu po stanici tijekom 2 dana nakon čega slijedi srednja zamjena. Sekvenca stabljike shE2F3 duplexa bila je 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Raspršene stanice iz 50 otočića posađene su po jažici za imunološko bojenje i RT-PCR, i 100 otočića po jažici za Western blot, koji je proveden kako je prethodno opisano [9].
9. In vivo i in vitro BrdU označavanje
Za izvođenje in vivo obilježavanja BrdU, miševima je intraperitonealno ubrizgavano 50 mg/kg/dan BrdU (u PBS) tijekom 7 dana od 2. dana nakon transplantacije otočića i žrtvovani su 2 sata nakon posljednje injekcije. Za in vitro označavanje BrdU, dispergirane stanice otočića uzgajane su 48 sati, nakon čega je uslijedila zamjena sa svježim medijem koji je sadržavao 10 μM BrdU i kultivirana dodatna 24 sata. Fluorescentno imunološko bojenje protiv BrdU u tkivu i kultiviranim stanicama provedeno je kao što je prethodno opisano [9].
Cistanche prah
10. RNA-Seq
Otočići su izolirani iz miševa Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m i Smad3KO-db/m. Za svaki genotip, otočići iz više od 5 miševa su skupljeni za izolaciju RNA. RNA je pripremljena s miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Njemačka). RNA-seq i nizvodna analiza podataka opisani su ranije [9]. Razina ekspresije danog gena predstavljena je kao fragmenti po kilobazi transkripta po milijunu mapiranih čitanja (FPKM). Diferencijalno eksprimirani gen (DEG) definiran je kao veća ili jednaka dvostrukoj varijanci FPKM između dvije skupine. Povećani i smanjeni DEG kombinirani su i korišteni za analizu puta obogaćivanja genske ontologije (GO) i Kyoto enciklopedije gena i genoma (KEGG) s online DAVID bioinformatičkim resursima (v6.8) sa zadanim postavkama. Potkategorija GOTERM_BP_DIRECT korištena je za GO analizu.
11. Imunoprecipitacija
Za izvođenje imunoprecipitacije u mišjim otočićima, oko 500 svježe izoliranih otočića je lizirano u 500 mL RIPA pufera. Dodano je zečje anti-Smad3 antitijelo (2 ug) ili zečji IgG izotip i inkubirano na 4 stupnja preko noći uz laganu rotaciju. Zatim je dodano 20 µL zrna agaroze proteina A (Beyotime, cat# P2051, Kina) i inkubirano 2 sata na 4 stupnja. Nakon snažnog ispiranja sa svježim RIPA puferom, vezani protein je oslobođen denaturacijom u 1xSDS puferu za punjenje i podvrgnut Western blot analizi. Kako bi se izbjegao utjecaj teškog lanca IgG, korišten je mišji anti-zečji IgG specifičan za laki lanac (HRP konjugiran, Abmart, kat. br. M21006, Kina) za prepoznavanje istaloženog proteina Smad3.
12. Imunoprecipitacija kromatina-ChIP
Za izvođenje ChIP-a u mišjim otočićima, oko 2000 otočića prikupljeno je od 8-10 tjedana starih C57BL/6 miševa i korišteno kao jedan ChIP pripravak. Svježe izolirani otočići stimulirani su s 10 ng/mL TGF- 1 (Gibco, SAD) 15 minuta u RPMI 1640 plus 1 posto FBS plus 1 posto penicilin-streptomicin. ChIP je izveden s SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (CST, SAD) prema preporučenim uputama. Protutijela i početnice korištene u ChIP testu detaljno su prikazane u tablici S1 i S2.
Standardizirani Cistanche
13. Dvostruki luciferazni reporter test
Mišji E2F3 promotor (-1000 do plus 451 bp) kloniran je u pGL3-bazični vektor (pGL3-E2F3.Pro). Istodobno je provedena točkasta mutacija veznog mjesta Smad3 kako bi se generirao pGL3- E2F3.Pro. Mut. Kako bi se izvršio dvostruki luciferazni reporter test, HEK293T stanice su nasađene u 24-ploču s jažicom u gustoći od 5 x 104 stanica/jažici. Sljedeći dan, stanice su transficirane s 500 ng pGL3-Basic ili pGL3-E2F3.pro ili pGL3-E2F3.pro.mut u kombinaciji s pcDNA3.1-Smad3, koji prekomjerno eksprimira mišji Smad3, ili ne (kako je prikazano na slici 10F) metodom fosfatnog kalcija. Vektor pEGFP-C1 je dopunjen kako bi se uravnotežila transfekcijska doza u svakom tretmanu. 10 ng pGL4.73.huc/SV40 vektora koji eksprimira renilla luciferazu uključeno je u svaki tretman da se normalizira učinkovitost transfekcije. 6 h nakon transfekcije, medij je promijenjen nakon čega je uslijedila inkubacija dodatnih 48 h. Stanice su lizirane, a aktivnost luciferaze određena je Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, SAD) i kvantificirana u luminometru (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, SAD). Transkripcijska aktivnost kloniranog promotora E2F3 predstavljena je kao omjer vrijednosti luciferaze krijesnice prema renilla luciferazi. Svaki tretman je izveden u tri primjerka.
14. Statistika
Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD i analizirani SPSS softverom (16.0). Normalnost podataka provjerena je Kolmogorov-Smirnovljevim testom jednog uzorka. Homogenost varijanci među skupinama testirana je Leveneovom statistikom. Za usporedbu dviju skupina korišten je Studentov t-test. Za usporedbu među više skupina, korištena je jednosmjerna ANOVA s LSD testom ako se pretpostavila jednaka varijanca. Za jednaku varijancu koja nije pretpostavljena, korištena je alternativna statistika Welchovog testa praćena višestrukim usporedbama s Tamhaneovim T2 testom. P < 0.05 smatra se statistički značajnim.
Cistanche suplementi
Zaključci
Nedostatak Smad3 uvelike poboljšava nadomjesnu terapiju otočića za T1DM i T2DM i štiti od dijabetičke ozljede bubrega. Poboljšana proliferacija stanica ovisna o E2F3- može biti ključni mehanizam terapije otočićima Smad3KO i kod T1DM i T2DM. Stoga bi nadomjesna terapija stanica Smad3KO mogla biti klinički bolja terapijska strategija za dijabetes.
Reference
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinička transplantacija otočića gušterače. Nat Rev Endocrinol. 2017.; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diferencijacija ljudskih pluripotentnih matičnih stanica u funkcionalne stanice gušterače za terapiju dijabetesa: inovacije, izazovi i budući smjerovi. J Biol Eng. 2017.; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histološka procjena presatka nakon kliničke transplantacije otočića. Transplantacija. 2009.; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Različite uloge TGF-beta/Smads u fibrozi i upali bubrega. Int J Biol Sci. 2011.; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad signalizacija kod fibroze bubrega. Front Physiol. 2015.; 6: 82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Smad signalna mreža regulira proliferaciju stanica otočića. Dijabetes. 2014.; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibicija TGF-beta signalizacije potiče replikaciju humanih beta-stanica gušterače. Dijabetes. 2016.; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanić V, et al. Kombinirana inhibicija puteva DYRK1A, SMAD i tritoraksa djeluje sinergistički na induciranje snažne replikacije u beta stanicama odraslih ljudi. Cell Metab. 2019.; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Nedostatak Smad3 potiče proliferaciju i funkciju beta stanica u db/db miševa obnavljanjem ekspresije Pax6. Teranostika. 2021.; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Metoda za izolaciju mišjih otočića i subkapsularnu transplantaciju bubrega. J Vis Exp. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Transplantacija izografta otočića poboljšava osjetljivost na inzulin u mišjem modelu dijabetesa tipa 2. Endokrini. 2021.; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Indukcija p16ink4a i p19ARF pomoću TGFbeta1 doprinosi zaustavljanju rasta i odgovoru na starenje u mišjim keratinocitima. Mol Carcinog. 2009.; 48: 181-6.
13. Dyer MA, Cepko CL. Regulacija proliferacije tijekom razvoja retine. Nat Rev Neurosci. 2001.; 2: 333-42.
14. Dyson N. The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Prolazna supresija signalizacije TGFbeta receptora olakšava transplantaciju ljudskih otočića. Endokrinologija. 2016.; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Poremećaj SMAD2 u mišjim beta stanicama pankreasa dovodi do hiperplazije otočića i oslabljenog izlučivanja inzulina zbog slabljenja aktivnosti K plus kanala osjetljivog na ATP. Diabetologia. 2014.; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Prekomjerna ekspresija E2F3 potiče proliferaciju funkcionalnih ljudskih beta stanica bez indukcije apoptoze. Stanični ciklus. 2013.; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-beta obiteljska signalizacija u kontroli stanične proliferacije i preživljavanja. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017.; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Dijabetes melitus--napredak i izazovi u ljudskoj proliferaciji beta-stanica. Nat Rev Endocrinol. 2015.; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Ciljani poremećaj SMAD3 dovodi do oslabljenog imuniteta sluznice i smanjenog odgovora T-stanica na TGF-beta. EMBO J. 1999.; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokol za izolaciju otočića iz pankreasa miša. Nat Protoc. 2009.; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantacija pankreasnih otočića u bubrežnu kapsulu dijabetičkih miševa. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Brisanje Smad3 sprječava fibrozu bubrega i upalu kod dijabetičke nefropatije tipa 2. Metabolizam. 2020.; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 i Hui-Yao Lan2,7
1 Istraživački centar za integriranu medicinu i Odjel za nefrologiju, pridružena bolnica tradicionalne kineske medicine Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.
2. Odjel za medicinu i terapiju i Institut zdravstvenih znanosti Li Ka Shing, Kinesko sveučilište u Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kina.
3. Zajednički laboratorij Guangdong-Hong Kong za imunološke i genetske bolesti bubrega, Narodna bolnica provincije Guangdong, Akademija medicinskih znanosti Guangdong, Guangzhou, Guangdong, 510080, Kina.
4. Državni ključni laboratorij za bioelektroniku, Jiangsu ključni laboratorij za biomaterijale i uređaje, Škola bioloških znanosti i medicinskog inženjerstva, Jugoistočno sveučilište, Nanjing, Kina.
5. Ključni laboratorij za prevenciju i liječenje kronične bubrežne bolesti grada Zhanjiang, Institut za nefrologiju, pridružena bolnica Medicinskog sveučilišta Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kina.
6. Nacionalna klinička istraživačka baza tradicionalne kineske medicine, pridružena bolnica tradicionalne kineske medicine Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.
7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Zajednički istraživački laboratorij za imunološke i genetske bolesti bubrega, Kinesko sveučilište u Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kina.