Dio Ⅰ Nedostatak Smad3 poboljšava terapiju dijabetesa i dijabetičke ozljede bubrega koja se temelji na otočićima promicanjem proliferacije stanica putem mehanizma ovisnog o E2F3-

Sažetak

1. Obrazloženje

Slaba stanična proliferacija jedan je od štetnih čimbenika koji ometaju nadomjesnu terapiju stanica otočića za pacijente s dijabetesom. Smad3 je važan transkripcijski čimbenik TGF-signalizacije i pokazalo se da potiče dijabetes inhibicijom stanične proliferacije. Stoga pretpostavljamo da bi otočići s nedostatkom Smad3- mogli biti nova stanična nadomjesna terapija za dijabetes.

2. Metode

Ispitali smo ovu hipotezu kod miševa s dijabetesom tipa -1 izazvanih streptozocinom i miševa s dijabetesom tipa -2 db/db presađivanjem Smad3 knockout (KO) odnosno divljeg tipa (WT) otočića ispod bubrežne kapsule. Ispitivani su učinci Smad3KO u odnosu na nadomjesnu terapiju otočićima WT na dijabetes i dijabetičku ozljedu bubrega. Osim toga, RNA-seq je primijenjen za identifikaciju nizvodnog ciljnog gena koji je u osnovi Smad3-regulirane stanične proliferacije u Smad3KO-db/db naspram Smad3WT-db/db mišjih otočića.

3. Rezultati

U usporedbi s terapijom otočićima Smad3WT, liječenje otočićima Smad3KO ima mnogo bolji terapeutski učinak na dijabetes tipa-1 i tip-2 značajno snižavajući razine glukoze u krvi i HbA1c u serumu i štiteći od dijabetičkih ozljeda bubrega sprječavanjem povećanje serumskog kreatinina i razvoj proteinurije, širenje mezangijalnog matriksa i fibroza. Oni su bili povezani sa značajnim povećanjem proliferacije presađenih stanica i razine inzulina u krvi, što je rezultiralo poboljšanom intolerancijom glukoze. Mehanički gledano, RNA-seq je otkrio da je u usporedbi s Smad3WT-db/db mišjim otočićima, brisanje Smad3 iz db/db mišjih otočića značajno povećalo E2F3, ključni regulator ulaska G1/S u stanični ciklus. Daljnje studije su otkrile da se Smad3 može vezati na promotor E2F3 i tako inhibirati proliferaciju stanica putem mehanizma ovisnog o E2F3- budući da je utišavanje E2F3 ukinulo proliferativni učinak na stanice Smad3KO.

4. Zaključak

Nadomjesna terapija s nedostatkom Smad{0}} otočića može značajno poboljšati dijabetes tip-1 i tip-2 i zaštititi od dijabetičke ozljede bubrega, koja je posredovana novim mehanizmom ovisnosti o E2F3- proliferacija stanica.

Ključne riječi

Smad3, transplantacija otočića, dijabetes, E2F3, stanični ciklus.

Kliknite ovdje za preuzimanjeCistanche koristi

Uvod

tip-1 i dijabetes melitus 2 (DM1 i T2DM). transplantacija stanica ili otočića atraktivna je terapija i uspješno se primjenjuje u bolesnika s T1DM. Otočići ili stanice koje se koriste za transplantaciju obično su od kadaveričnih darivatelja ili induciranih pluripotentnih matičnih stanica (iPSC) [1, 2]. Više od 1500 slučajeva kliničke transplantacije otočića dovršeno je u bolesnika s T1DM prema dobro uspostavljenom Edmontonskom protokolu [1]. Iako je oko 50 posto pacijenata neovisno o inzulinu 5 godina nakon transplantacije, neuspjeh presađivanja čest je klinički problem. Jedan od čimbenika koji ometa transplantaciju otočića je izuzetno niska proliferativna stopa presađenih stanica otočića [3]. Osim toga, opasni podražaji iz mikrookruženja presatka kao što su upala, imunološko odbacivanje alografta i metabolički stres mogu uzrokovati apoptozu i nekrozu presađenih stanica, što rezultira progresivnim gubitkom presatka [1]. Stoga je poboljšanje proliferacije transplantiranih stanica ključno za uspjeh liječenja dijabetesa temeljenog na transplantaciji otočića.

Signalizacija transformirajućeg faktora rasta-beta (TGF-) ima pleiotropsku ulogu u mnogim biološkim procesima. Transdukcija signala započinje vezanjem TGF-liganda na njegov receptor tipa 2 TGFBR2. Potonji regrutira i aktivira receptor tipa 1 TGFBR1 fosforilacijom. Aktivirani TGFBR1 dalje fosforilira receptorom regulirane Smad proteine ​​(R-Smads), Smad2 i Smad3. R-Smad tvore kompleks sa Smad4, koji se translocira u jezgru kako bi transkripcijski regulirao ciljne gene [4, 5]. Zabilježeno je da otočić gušterače održava univerzalno aktiviranu TGF-signalizaciju što je otkriveno relativno visokom razinom fosforiliranog Smad2/3 u fiziološkim uvjetima. Međutim, kao odgovor na potrebu za inzulinom, TGF-signalna aktivnost je smanjena, praćena povećanom staničnom proliferacijom [6]. Uz to, farmakološka inhibicija TGF signalizacije potiče staničnu proliferaciju in vitro i in vivo [7, 8]. Još važnije, brisanje Smad3 rezultira snažnijom staničnom proliferacijom u usporedbi s brisanjem Smad2 u miševa s djelomičnom pankreatektomijom, što ukazuje da je Smad3, ali ne i Smad2, primarni efektor nizvodno od TGF-signalizacije za regulaciju stanične proliferacije [6]. Kasnije studije pokazuju da Smad3 potiskuje staničnu proliferaciju inducirajući ekspresiju inhibitora kinaze ovisnih o ciklinu (CDKI), uključujući p16, p21 i p57 [7, 8].

Naš nedavni rad također je otkrio da brisanje Smad3 u db/db miševa (Smad3KO-db/db) sprječava pojavu očitog dijabetesa bez pretilosti, hiperglikemije, inzulinske rezistencije i intolerancije na glukozu. Zanimljivo je da Smad3KO-db/db miševi pokazuju hiperplaziju otočića sa značajno povećanom staničnom proliferacijom i trajnom hiperinzulinemijom [9]. Ovo implicira da je Smad3 patogen u dijabetesu i ciljanje Smad3 u stanicama može predstavljati novu nadomjesnu terapiju stanica ili otočića za dijabetes. To je ispitano u ovoj studiji upotrebom transplantacije otočića s nokautom Smad3 (Smad3KO) kod miševa s dijabetesom tipa -1 izazvanih streptozocinom (STZ) i kod miševa s dijabetesom tipa -2 db/db.

Cistanche suplementi

Rezultati

1. Transplantacija otočića Smad3KO proizvela je bolji terapeutski učinak na STZ-induciran dijabetes tipa -1

Kako bismo usporedili terapijsku učinkovitost Smad3KO naspram Smad3WT otočića na dijabetes, prvo smo izveli transplantaciju singenih otočića ispod bubrežne kapsule dijabetičkih miševa izazvanih STZ-om kod kojih je hiperglikemija uzrokovana nedostatkom stanica. Miševima s dijabetesom 7. dan nakon injekcije STZ transplantirane su 3 doze otočića (50, 100 i 200 otočića po mišu) koji su svježe izolirani iz Smad3WT ili Smad3KO miševa. I nasumične razine glukoze u krvi (RBG) i razine glukoze u krvi natašte (FBG) praćene su tjedno tijekom 16 tjedana. Doze transplantacije odabrane su na temelju prethodnih otkrića da je transplantacija 300 otočića dovoljna za brzu obnovu euglikemije kod miševa s iscrpljenim stanicama [10]. Kao što je prikazano na slikama 1A do D, dijabetički miševi s lažnom operacijom razvili su postojanu hiperglikemiju tijekom 16 tjedana. Transplantacija s malom dozom (50 otočića) Smad3KO ili WT otočića nije uspjela smanjiti ni RBG ni FBG razine. Međutim, miševi s dijabetesom koji su primili 100 otočića Smad3KO, ali ne istu dozu otočića Smad3WT, postupno su vratili normalan RBG i FBG slično onima koji su primili 200 otočića Smad3KO ili WT. Također smo otkrili da se učinak snižavanja glukoze u krvi isključivo pripisuje transplantiranim otočićima jer se hiperglikemija ponovila odmah nakon što je bubreg koji nosi otočić uklonjen od 16 tjedana nadalje (strelica, slika 1A).

Poremećena tolerancija glukoze također se razvila u lažno operiranih dijabetičkih miševa, što je značajno olakšano presađivanjem visoke doze (200) Smad3KO ili WT otočića i 100 Smad3KO otočića, ali ne niskom dozom od 50 Smad3KO ili WT otočića i 100 Smad3WT otočići (Slika 1E i G). Kao što se očekivalo, STZ-inducirani dijabetički miševi nisu razvili inzulinsku rezistenciju.

Nasuprot tome, produljeni odgovor na inzulin primijećen je kod miševa s hiperglikemijom s lažnom operacijom ili neučinkovitom terapijom s 50 Smad3WT ili KO otočića i 100 Smad3WT otočića (Slika 1F i H). U skladu s oporavljenom euglikemijom i poboljšanom intolerancijom na glukozu, dijabetički miševi kojima je dano 200 Smad3KO ili WT otočića i 100 Smad3KO otočića, ali ne i 50 Smad3KO ili WT otočića i 100 Smad3WT otočića, pokazali su smanjenu razinu HbA1c u krvi popraćenu povećanom razinom inzulina (Slika 1 I i J). Nadalje, dijabetes izazvan STZ-om uzrokovao je zastoj u rastu, koji je djelomično oporavljen kod miševa kojima je transplantirano 200 Smad3KO ili WT otočića i 100 Smad3KO otočića (Slika S1). Osim toga, miševi s dijabetesom izazvanim STZ-om također su razvili dijabetičku nefropatiju nakon 16 tjedana, što je pokazano mezangijskom ekspanzijom, intersticijalnom fibrozom, proteinurijom i povećanim kreatininom u serumu (Slika 2). Intrigantno je da je tretman sa 100 Smad3KO otočića, ali ne i sa 100 Smad3WT otočića, rezultirao zaštitom od razvoja dijabetičke bolesti bubrega, iako je to također bilo vidljivo kod dijabetičkih miševa liječenih visokom dozom od 200 Smad3KO ili WT otočića (Slika 2). Ovi nalazi pokazuju bolju terapeutsku učinkovitost otočića Smad3KO na dijabetes izazvan STZ-om i upućuju na oko 50-postotno smanjenje otočića potrebno za postizanje kompetentne kontrole glikemije i zaštite od dijabetičkog oštećenja bubrega korištenjem Smad3-nadomjesne terapije s nedostatkom otočića za dijabetes.

2. Transplantacija otočića Smad3KO proizvela je bolji terapeutski učinak na dijabetes tipa -2 u db/db miševa

Zabilježeno je da transplantacija otočića poboljšava T2DM u modelu miša hranjenog visokom količinom masnoće koji je bio izazvan niskom dozom STZ [11]. Zatim smo istražili da li transplantacija Smad3KO otočića također proizvodi bolji terapeutski učinak na T2DM tretiranjem db/db miševa s 250 Smad3KO ili WT otočića od preddijabetičke dobi od 4. do 12. tjedna. Otkrili smo da transplantacija sa Smad3KO ili WT otočići nisu utjecali na rast db/db miševa primatelja (Slika S2). Iako su db/db miševi koji su primili transplantaciju otočića Smad3WT pokazali trend smanjenja RBG i FBG u usporedbi s lažno operiranim db/db miševima, db/db miševi kojima je transplantirana ekvivalentna doza otočića Smad3KO pokazali su značajno smanjenje RBG i FBG (Slika 3A i B). Intolerancija glukoze razvijena u db/db miševa značajno je poboljšana transplantacijom otočića Smad3KO, ali ne i Smad3WT, iako otpornost na inzulin nije promijenjena (Slika 3C-F). Dosljedno, u usporedbi s transplantacijom otočića Smad3WT ili lažnom operacijom, db/db miševi liječeni transplantacijom otočića Smad3KO također su pokazali značajno smanjenje razine HbA1c u krvi, što je bilo popraćeno primjetnim povećanjem razine inzulina u krvi (Slika 3G i H). Nadalje, liječenje s 250 otočića Smad3KO značajno je oslabilo glomerularno mezangijsko širenje (Slika 4). Međutim, budući da nisu zabilježene značajne promjene u serumskom kreatininu, proteinuriji i fibrozi bubrega u db/db miševa u dobi od 12 tjedana, nisu nađene očite promjene u ovim parametrima u db/db miševa liječenih Smad3KO ili WT otočićima (Slika 4). Zajedno, ovi podaci opet pokazuju da transplantacija otočića Smad3KO proizvodi bolji tretman u odnosu na otočiće Smad3WT kod db/db miševa s dijabetesom tipa -2.

3. Nedostatak Smad3 potiče proliferaciju stanica u presađenim otočićima i kod STZ-induciranih dijabetičkih miševa i db/db miševa.

Zatim smo istražili potencijalne mehanizme pomoću kojih transplantacija otočića Smad3KO proizvodi bolji terapeutski učinak na T1DM i T2DM. Prvo smo ispitali staničnu masu u presađenim otočićima imunološkim bojenjem inzulinom. Kod STZ-induciranog dijabetesa, nismo uspjeli otkriti postojanje inzulinski pozitivnih stanica ispod bubrežne kapsule kod miševa kojima je usađeno 50 Smad3KO ili WT otočića u 16. tjednu nakon transplantacije, što ukazuje na gubitak stanica. Neočekivano, dijabetički miševi koji su primili 100 Smad3WT otočića pokazali su samo nekoliko raspršenih klastera stanica koje proizvode inzulin, ali to je bilo uvelike povećano kod dijabetičkih miševa tretiranih sa 100 Smad3KO otočića, što je rezultiralo skoro 17-strukim povećanjem stanične mase (Slika 5A i B). Zanimljivo je da su dijabetični miševi kojima je dana visoka doza od 200 Smad3KO ili WT otočića pokazali sličnu staničnu masu (slike 5A i B). Ovi su nalazi bili u skladu s učinkom transplantacije otočića na hiperglikemiju ovisnim o dozi, kao što je prikazano na slikama 1A i B.

Zatim smo istražili je li povećana stanična masa u presacima Smad3KO otočića povezana s pojačanom staničnom proliferacijom. Dvobojna imunofluorescencija pokazala je da su u 16. tjednu nakon transplantacije otočića, miševi tretirani sa 100 Smad3WT otočića pokazali nemjerljive ili rijetke PCNA plus inzulin plus stanice, što je prvenstveno bilo povećano kod onih koji su primili 100 Smad3KO otočića ili visoku dozu od 200 Smad3KO ili WT otočići (Slika 5C i D). Zatim smo istražili kontrolira li Smad3 ranu staničnu proliferaciju u presađenim otočićima u progresivnim dijabetičkim stanjima označavanjem BrdU 7. dana nakon transplantacije otočića kada su razine glukoze u krvi ostale visoke. Označavanje BrdU otkrilo je 3-struko povećanje BrdU plus inzulin plus stanice u 100 presadaka otočića Smad3KO u usporedbi s istom dozom presadaka otočića Smad3WT (Slika 5E i F). Ovo otkriće ukazuje da nedostatak Smad3 uvelike potiče staničnu proliferaciju kroz S-fazu staničnog ciklusa u hiperglikemijskim uvjetima, pridonoseći 17-strukom povećanju stanične mase kao što se vidi u 16. tjednu nakon transplantacije otočića (Slika 5A i B) . Uzeti zajedno, svi ovi nalazi upućuju na to da nedostatak Smad3 u velikoj mjeri potiče proliferaciju stanica, čime se obnavlja euglikemija kod STZ-induciranog dijabetesa tipa -1.

Slično tome, visoke stanične proliferativne aktivnosti također su otkrivene u presacima otočića Smad3KO kod miševa s dijabetesom tipa -2 db/db, što je prikazano 5-struko povećanjem stanične mase u usporedbi s onima s presadcima otočića Smad3WT na dobi od 12 tjedana nakon transplantacije otočića (Slika 6A i B), što je bilo povezano s 25-strukim povećanjem inzulina plus PCNA plus stanica (Slika 6C i D). Korištenjem BrdU-obilježavanja, također smo otkrili 3-struko povećanje inzulina plus BrdU plus stanica u presacima otočića Smad3KO 7. dan nakon transplantacije u 12-tjedno starih db/db miševa (Slika 6E i F). Ovo otkriće ponovno potvrđuje da su stanice bez Smad3 otporne na hiperglikemiju i ostaju visoko proliferativne kako bi održale staničnu masu za poboljšanje T2DM.

4. Nedostatak Smad3 potiče proliferaciju stanica in vitro

Zabilježeno je da farmakološka inhibicija TGFBR1 potiče staničnu proliferaciju in vitro [7, 8]. Stoga smo istražili potiče li genetska delecija Smad3 staničnu proliferaciju uzgojem stanica otočića Smad3KO i WT nakon čega slijedi označavanje BrdU. Dvostruka imunofluorescencija pokazala je da stanice otočića bez Smad3 pokazuju značajno višu razinu BrdU-pozitivnih stanica (5,7 posto) u usporedbi sa stanicama otočića Smad3WT (2,4 posto) (Slika 7A i B). Povećana proliferacija Smad3KO stanica također je dokazana povećanom ekspresijom PCNA kao što je otkriveno Western blot analizom (Slika 7C), potvrđujući ključnu regulatornu ulogu Smad3 u staničnoj proliferaciji.

5. RNA-seq identificira E2F3 kao Smad3 ciljni gen koji regulira staničnu proliferaciju

Kako bismo otkrili nizvodni mehanizam Smad3 u regulaciji stanične proliferacije, izveli smo RNA-seq u otočićima izoliranim iz db/m ili db/db miševa sa ili bez brisanja gena Smad3 uključujući Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m i Smad3KO-db/m miševi kako je prethodno opisano [9]. Analiza obogaćenja puta provedena je između različito izraženih gena (DEG) između Smad3WT i Smad3KO otočića u db/m ili db/db pozadini. U genetskoj pozadini db/db, Smad3KO je rezultirao značajnim promjenama u genima ili putovima povezanim sa staničnim ciklusom, što je otkriveno analizom GO i KEGG (Slika 8A i Slika S3). S obzirom na pojedinačne gene, analiza RNA-seq otkrila je povećanje ekspresije gena koji uključuju obitelj proteina ciklina, kinaza ovisnih o ciklinu (CDK) i ciklusa stanične diobe (CDC) u otočićima Smad3KO-db/db u usporedbi sa Smad3WT-db /db otočića, što je dodatno potvrđeno u uzgojenim stanicama otočića Smad3KO pomoću RT-PCR (Slika S4 A i C). Nasuprot tome, u genetskoj pozadini db/m, Smad3KO nije izazvao značajan utjecaj na gene ili putove povezane sa staničnim ciklusom (Slika S3B i C). Zabilježeno je da TGF-/Smad3 signalizacija negativno regulira stanični ciklus induciranjem gena inhibitora ciklin-ovisne kinaze (CDKI) [7, 8, 12]. Iznenađujuće, ekspresija niti jednog od ovih CDKI gena nije bila potisnuta u otočićima Smad3KO-db/db in vivo i kultiviranim stanicama otočića Smad3KO kao što je otkriveno pomoću RNA-seq odnosno RT-PCR (Slika S4B i C). Nasuprot tome, razine ekspresije nekoliko gena CDKI kao što su p16, p18 i p57 bile su čak pojačane u uzgojenim stanicama otočića Smad3KO (Slika S4C). To implicira da postoji alternativni mehanizam u Smad3-reguliranoj staničnoj proliferaciji.

Stoga smo analizirali potencijal vezivanja Smad3 za sekvence promotora od 224 DEG u GO terminu staničnog ciklusa sa softverom preglednika ECR (Slika 8A). Među njima, jedan gen nazvan E2F3 privukao je našu pozornost jer je ključni i terminalni izvršitelj koji regulira ulazak G1/S u stanični ciklus [13, 14]. Pronašli smo potencijalno mjesto vezivanja Smad3 u promotoru mišjeg E2F3 lokusa koji je također sačuvan kod ljudi (Slika 8B).

Cistanche tubulosa

Kako bismo istražili je li E2F3 bitan za Smad3-reguliranu staničnu proliferaciju, ispitali smo povezanost između E2F3 i Smad3 u otočićima. U skladu s RNA-seq, imunohistokemija je otkrila da je ekspresija E2F3 uvelike smanjena u otočićima Smad3WT-db/db miševa, ali znatno povećana u Smad3KO-db/db miševa (Slika 8C). Nadalje, povećana ekspresija E2F3 također je primijećena u uzgojenim stanicama otočića Smad3KO na razini RNA i proteina (Slika 8 DF). Nasuprot tome, šutnja E2F3 posredovana adenovirusom ukinula je proliferativnu aktivnost stanica (inzulin^plusBrdU^plus) u stanicama otočića Smad3KO (Slika 9), otkrivajući bitnu ulogu E2F3 u Smad3-reguliranoj staničnoj proliferaciji.

Da dodatno potvrdimo predviđeno vezanje Smad3 u E2F3 promotoru, izveli smo imunoprecipitaciju kromatina (ChIP) u izoliranim mišjim otočićima (Slika 10A). Specifičnost Smad3 antitijela korištenog za ChIP prvotno je potvrđena imunoprecipitacijom u mišjim otočićima (Slika 10B). ChIP PCR potvrdio je vezanje Smad3 na E2F3 promotor kao anti-Smad3 antitijela, ali niti jedan nespecifični IgG izotip nije uspješno istaložio fragment kromatina koji odgovara E2F3 promotoru (Slika 10C). Kvantitativni RT-PCR otkrio je 6-struko obogaćivanje E2F3 promotorske sekvence u ChIP testu sa Smad3 antitijelom u usporedbi s IgG izotipom (Slika 10D), pokazujući da se Smad3 može vezati na promotorsku regiju genomskog lokusa E2F3 .

Kako bismo potvrdili funkcionalnu važnost vezanja Smad3 na E2F3 promotor, konstruirali smo reporterski vektor luciferaze kojeg pokreće mišji E2F3 promotor koji sadrži mjesto vezivanja Smad3 ili njegov mutantni oblik (Slika 10E). Dvostruko ispitivanje luciferaze u stanicama HEK293T otkrilo je snažnu transkripciju luciferaze koju pokreće klonirani promotor E2F3, a koja je značajno inhibirana prekomjernom ekspresijom Smad3. Međutim, mutacija veznog mjesta Smad3 poništila je inhibitorni učinak Smad3 (Slika 10F). Ova otkrića pružila su izravne dokaze za supresivnu ulogu Smad3 u transkripciji E2F3 vezanjem na njegov promotor.

U ovoj smo studiji pokazali da transplantacija otočića s nedostatkom Smad3- proizvodi bolji terapeutski učinak na dijabetes i dijabetičku ozljedu bubrega kod STZ-induciranih dijabetičkih miševa i db/db miševa. Kod dijabetesa izazvanog STZ-om, transplantacija 100 Smad3KO, ali ne i 100 Smad3WT otočića rezultirala je 17-struko povećanjem stanične mase, što je bilo povezano sa značajnim povećanjem razine inzulina u krvi i time poboljšalo intoleranciju glukoze i oporavilo euglikemiju, što je rezultiralo u zaštiti od dijabetičkog oštećenja bubrega.

Slični rezultati također su pronađeni u T2DM kod db/db miševa kod kojih je transplantacija s 250 otočića Smad3KO, ali ne istom dozom otočića Smad3WT, također povećala 5-struku staničnu masu i proizvela bolju kontrolu glikemije. Ovi nalazi sugeriraju da je nedostatak Smad3 otporan na dijabetičko mikrookruženje i u velikoj mjeri potiče širenje stanica cijepljenih otočića i proizvodnju inzulina kako bi se pokazala bolja kontrola glikemije. Zanimljivo, također smo otkrili da liječenje sa 100 otočića Smad3KO može proizvesti jednaku kontrolu glikemije kao i korištenje 200 otočića Smad3WT ili KO u dijabetesu izazvanom STZ-om. Ovo opažanje sugerira da nedostatak Smad3 može uvelike smanjiti (barem 50 posto) broj otočića potrebnih za uspješnu uspostavu neovisnosti o inzulinu u nadomjesnoj terapiji stanica otočića za T1DM. Ovi su nalazi u skladu s prethodnim izvješćem da prethodna obrada otočića SB-431542, inhibitorom TGFBR1, potiče proliferaciju i funkciju stanica nakon transplantacije [15]. Međutim, budući da Smad2 također igra bitnu ulogu u glukozom stimuliranom oslobađanju inzulina u stanicama [16], ciljanje na Smad3, ali ne uzvodno na TGFBR1 u otočićima (stanicama), može biti povoljnije za nadomjesno liječenje dijabetesa stanicama. Stoga transplantacija otočića s nedostatkom Smad3- može klinički predstavljati novu terapiju i za T1DM i za T2DM. Osim toga, liječenje otočićima Smad3KO također može zaštititi od dijabetičke ozljede bubrega u 16 tjedana T1DM, iako to nije duboko u T2DM zbog minimalne dijabetičke ozljede bubrega koja se javlja kod db/db miševa u dobi od 12 tjedana.

Mehanički gledano, otkrili smo da Smad3 funkcionira tako što potiskuje E2F3 kako bi inhibirao proliferaciju stanica. Ovo je potkrijepljeno dokazima da E2F3 promotor sadrži funkcionalno mjesto vezivanja Smad3 što je potvrđeno ChIP-om i testom reportera luciferaze. Stanice otočića kojima nedostaje Smad3 pokazale su pojačanu proliferaciju u mehanizmu ovisnom o E2F3- budući da je nokdaun E2F3 ukinuo ovu pro-proliferativnu aktivnost. E2F3 pripada obitelji E2F i kritična je komponenta Rb-E2F mehanizma koji upravlja ulaskom G1/S staničnog ciklusa [13]. E2F su čimbenici transkripcije i konačni izvršitelji za regulaciju gena koji upravljaju napredovanjem staničnog ciklusa [14]. Dokazano je da prekomjerna ekspresija E2F3 potiče proliferaciju stanica u otočićima glodavaca i ljudi [17]. Otkrića da Smad3 transkripcijski cilja na E2F3 kako bi potisnuo stanični ciklus u stanicama daju novi regulatorni mehanizam za staničnu proliferaciju. Prema tome, poremećaj Smad3 u stanicama otočića potiče E2F3-ovisnu staničnu proliferaciju kao što je prikazano izrazitim povećanjem PCNA plus ili BrdU plus stanica koje proizvode inzulin, što sugerira da je liječenje subterapijskom dozom Smad3KO otočića dovoljno za širenje stanica mase i inhibira i T1DM u STZ-induciranim miševima i T2DM u db/db miševima.

Herba CistancheiEkstrakt cistanče

Zabilježeno je da TGF-signalizacija igra ključnu ulogu u razvoju i funkciji stanica otočića gušterače, zaustavlja staničnu ciklus i uzrokuje apoptozu stanice inducirajući CDKI [7, 8, 18]. Na naše iznenađenje, i in vivo i in vitro eksperimenti otkrili su da transkripcija CDKI nije promijenjena ili čak pojačana u Smad3KO otočićima (Slika S4). Ova se razlika može pripisati različitim eksperimentalnim uvjetima. Rezultati u trenutnoj studiji izvedeni su iz Smad3KO miševa (otočića). Međutim, prethodne studije temelje se na farmakološkoj inhibiciji TGFBR1, što će utjecati na cjelokupnu TGF-signalizaciju [7, 8]. Nadalje, koristili smo uzorke otočića iz mladih odraslih miševa (starosti od 8-10 tjedana), dok su otočići iz relativno starih životinja ili kadaveričnih donora starijih ljudi korišteni u prethodnim studijama [7, 8]. Budući da stanice otočića pokazuju nakupljanje CDKI povezano sa starenjem [19], CDKI u ostarjelim stanicama mogu biti osjetljiviji na inhibiciju TGF signala.

U ovoj studiji bilo je nekoliko ograničenja. Prvo, istražuje se učinkovitost transplantacije otočića na STZ-induciranom dijabetičkom mišjem modelu bez autoimune reakcije. Stoga bi prednost Smad3KO nad terapijom otočićima Smad3WT za dijabetes također trebala biti potvrđena u autentičnom T1DM modelu u budućnosti. Drugo, nalazi iz ove studije temelje se na Smad3KO staničnoj terapiji za cijeli otočić, ali ne i za stanicu. Nije jasno hoće li tipovi stanica osim stanica u otočiću izvršiti ulogu ovisnu o Smad3-da moduliraju proliferaciju stanica međustaničnim putevima preslušavanja. Stoga su daljnja istraživanja sa Smad3KO specifičnim za stanice opravdana. Nadalje, nalaze iz ove studije potrebno je provjeriti u uzorcima ljudskih otočića kako bi se dokazala njihova klinička važnost.

Reference

1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinička transplantacija otočića gušterače. Nat Rev Endocrinol. 2017.; 13: 268-77.

2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diferencijacija ljudskih pluripotentnih matičnih stanica u funkcionalne stanice gušterače za terapiju dijabetesa: inovacije, izazovi i budući smjerovi. J Biol Eng. 2017.; 11:21.

3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histološka procjena presatka nakon kliničke transplantacije otočića. Transplantacija. 2009.; 88: 1286-93.

4. Lan HY. Različite uloge TGF-beta/Smads u fibrozi i upali bubrega. Int J Biol Sci. 2011.; 7: 1056-67.

5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad signalizacija kod fibroze bubrega. Front Physiol. 2015.; 6: 82.

6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Smad signalna mreža regulira proliferaciju stanica otočića. Dijabetes. 2014.; 63: 224-36.

7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibicija TGF-beta signalizacije potiče replikaciju humanih beta-stanica gušterače. Dijabetes. 2016.; 65: 1208-18.

8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanić V, et al. Kombinirana inhibicija puteva DYRK1A, SMAD i tritoraksa djeluje sinergistički na induciranje snažne replikacije u beta stanicama odraslih ljudi. Cell Metab. 2019.; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Nedostatak Smad3 potiče proliferaciju i funkciju beta stanica u db/db miševa obnavljanjem ekspresije Pax6. Teranostika. 2021.; 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Metoda za izolaciju mišjih otočića i subkapsularnu transplantaciju bubrega. J Vis Exp. 2011.

11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Transplantacija izografta otočića poboljšava osjetljivost na inzulin u mišjem modelu dijabetesa tipa 2. Endokrini. 2021.; 72: 660-71.

12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Indukcija p16ink4a i p19ARF pomoću TGFbeta1 doprinosi zaustavljanju rasta i odgovoru na starenje u mišjim keratinocitima. Mol Carcinog. 2009.; 48: 181-6.

13. Dyer MA, Cepko CL. Regulacija proliferacije tijekom razvoja retine. Nat Rev Neurosci. 2001.; 2: 333-42.

14. Dyson N. Regulacija E2F proteinima pRB-obitelji. Genes Dev. 1998.; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Prolazna supresija signalizacije TGFbeta receptora olakšava transplantaciju ljudskih otočića. Endokrinologija. 2016.; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Poremećaj SMAD2 u mišjim beta stanicama pankreasa dovodi do hiperplazije otočića i oslabljenog izlučivanja inzulina zbog slabljenja aktivnosti K plus kanala osjetljivog na ATP. Diabetologia. 2014.; 57: 157-66.

17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Prekomjerna ekspresija E2F3 potiče proliferaciju funkcionalnih ljudskih beta stanica bez indukcije apoptoze. Stanični ciklus. 2013.; 12: 2691-702.

18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-beta obiteljska signalizacija u kontroli stanične proliferacije i preživljavanja. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017.; 9.

19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Dijabetes melitus--napredak i izazovi u ljudskoj proliferaciji beta-stanica. Nat Rev Endocrinol. 2015.; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Ciljani poremećaj SMAD3 dovodi do oslabljenog imuniteta sluznice i smanjenog odgovora T-stanica na TGF-beta. EMBO J. 1999.; 18: 1280-91.

21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokol za izolaciju otočića iz pankreasa miša. Nat Protoc. 2009.; 4: 1649-52.

22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantacija pankreasnih otočića u bubrežnu kapsulu dijabetičkih miševa. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Brisanje Smad3 sprječava fibrozu bubrega i upalu kod dijabetičke nefropatije tipa 2. Metabolizam. 2020.; 103: 154013.

Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 i Hui-Yao Lan2,7

1 Istraživački centar za integriranu medicinu i Odjel za nefrologiju, pridružena bolnica tradicionalne kineske medicine Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

2. Odjel za medicinu i terapiju i Institut zdravstvenih znanosti Li Ka Shing, Kinesko sveučilište u Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kina.

3. Zajednički laboratorij Guangdong-Hong Kong za imunološke i genetske bolesti bubrega, Narodna bolnica provincije Guangdong, Akademija medicinskih znanosti Guangdong, Guangzhou, Guangdong, 510080, Kina.

4. Državni ključni laboratorij za bioelektroniku, Jiangsu ključni laboratorij za biomaterijale i uređaje, Škola bioloških znanosti i medicinskog inženjerstva, Jugoistočno sveučilište, Nanjing, Kina.

5. Ključni laboratorij za prevenciju i liječenje kronične bubrežne bolesti grada Zhanjiang, Institut za nefrologiju, pridružena bolnica Medicinskog sveučilišta Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kina.

6. Nacionalna klinička istraživačka baza tradicionalne kineske medicine, pridružena bolnica tradicionalne kineske medicine Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Zajednički istraživački laboratorij za imunološke i genetske bolesti bubrega, Kinesko sveučilište u Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kina.