Dio Ⅰ Razvoj imunološkog testa lateralnog protoka europijskih nanočestica za otkrivanje NGAL u urinu i dijagnozu akutne ozljede bubrega

Sažetak

1. Pozadina

AKI je povezan s teškim štetnim ishodima i smrtnošću kod pacijenata oboljelih od Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), stoga su rana dijagnoza i intervencija imperativ. Lipocalin povezan s neutrofilnom želatinazom (NGAL) jedan je od biomarkera koji najviše obećava za otkrivanje akutne ozljede bubrega (AKI), ali trenutne metode otkrivanja su neadekvatne, pa su potrebne brže, praktičnije i točnije metode za otkrivanje NGAL za ranu dijagnozu od AKI. Ovdje smo uspostavili brz, pouzdan i točan imunotest lateralnog protoka (LFIA) koji se temelji na nanočesticama europija (EU-NPS) za otkrivanje NGAL-a u uzorcima ljudskog urina.

2. Metode

Upotrijebljen je dvostruki sendvič imunofluorescentni test s dvostrukim antitijelima koji koristi nanočestice dopirane europijem, a konjugat monoklonskih antitijela NGAL (MAbs) kao oznake generiran je optimizacijom parametara električne fuzije. Za procjenu učinkovitosti kliničke primjene ove metode korištena su 83 uzorka urina.

3. Rezultati

Kvantitativni raspon detekcije NGAL-a u AKI bio je {{0}} ng/mL, a senzibilizacija detekcije bila je 0,36 ng/mL. Koeficijent varijacije (CV) intra-testiranja i inter-testiranja bio je 2.57-4.98 posto odnosno 4.11-7.83 posto. U međuvremenu, korelacijski koeficijent između imunoloških testova lateralne fluorescencije temeljenih na nanočesticama europija (EU-NPS-LFIA) i analizatora ARCHITECT bio je značajan (R2=0.9829, n=83, p < 0,01).

4. Zaključci

Stoga je uspostavljena brža i lakša operativna kvantitativna analiza NGAL za AKI, koja je vrlo važna i značajna za dijagnosticiranje rane AKI, što sugerira da analiza može pružiti rano upozorenje na ishod bolesti.

Ključne riječi

lipokalin povezan s neutrofilnom želatinazom (NGAL), monoklonsko protutijelo, imunološki test s bočnim protokom, akutna ozljeda bubrega (AKI),Cistancheovi učinci.

Kliknite ovdje da biste saznalikoje su prednosti Cistanche

Uvod

Koronavirusna bolest 2019 (COVID-19) široko se proširila u svjetskim razmjerima s ozbiljnim katastrofama [1]. Akutna ozljeda bubrega (AKI) ima veću stopu morbiditeta i smrtnosti u uobičajenim komplikacijama kritičnih bolesti i broji oko 5-7 posto hospitaliziranih pacijenata u svijetu[2]. - Nekoliko je studija procijenilo razvoj AKI kao više snažno povezan s lošijim ishodima i stopama smrtnosti od COVID-19, opisujući incidenciju AKI koja se kreće u širokom rasponu od 0,5 do 36,6 posto u pacijenata s COVID-19[3]. Rano otkrivanje i precizni tretmani AKI mogu implementirati bolje preventivne strategije i spriječiti pogoršanje bubrežne funkcije i zatajenje bubrega, učinkovito obuzdavajući napredovanje COVID-19 hospitaliziranih pacijenata[4]. Među njima, lipokalin povezan s neutrofilnom želatinazom (NGAL) prepoznat je kao jedan od obećavajućih kandidata za biomarkere za detekciju AKI. NGAL je glikoprotein od 25 kDa povezan s želatinazom iz neutrofila i obično postoji na nižoj razini u ljudskim tkivima kao što su želudac, debelo crijevo i bubrezi, ali njegova ekspresija je dramatično povećana u serumu i urinu kada je bubreg bio s ishemijskom ili nefrotoksičnom ozljedom [5].

Imunotestovi s bočnim protokom (LFIA) smatraju se poželjnim testovima probira zbog svoje jednostavnosti, analize na licu mjesta i lakoće rada [6]. LFIA s fluorescentnim mikročesticama već se koristi za detekciju različitih mikrobnih patogena i nekoliko markera upale [7, 8]. Općenito je primijenjeno nekoliko novih nanočestica za poboljšanje osjetljivosti LFIA, uključujući nanočestice ugljika, kvantne točke, fluorescentne boje, magnetske nano oznake i nanočestice europija (EU-NPS)[9]. EU-NPS kao nosači mogu poboljšati 100-kontrast osjetljivosti višestruko s nanočesticama koloidnog zlata označenim u LFIA[10]. EU-NPS ima dug životni vijek fluorescencije i također je dostupan s prosječnom veličinom čestica u rasponu od 75-100 nm, veliki Stokesov pomak koji je obično preko 200 nm pogodan je za izbjegavanje interferencije raspršenog svjetla uzrokovanog mjerenjem pobudnog svjetla. EU-NPS imaju širok pojas pobude pa je korisno povećati energiju pobude, oštar vrh emisije, nisku pozadinu i visoku rezoluciju, što se nedavno koristi u imunotestovima sendvič tipa u medicinskoj dijagnostici[11].

Ovdje smo uspostavili novu metodu s EU-NPS kao oznakama LFIA za brzo, osjetljivo i rano mjerenje NGAL u urinu na temelju dva monoklonska antitijela (MAbs) 1G1 i 2F4 koja je otkrio naš laboratorij. Metoda je sendvič imunofluorescentni test s dvostrukim antitijelima koji koristi EU-NPS i MAbs konjugat kao oznake. mAb 1G1 je konjugirano s EU-NPS, a mAb 2F4 korišteno je za hvatanje EU-NPS-1G1-antigenskog kompleksa u T-liniji. Naši rezultati pokazali su da se EU-NPS-LFIA može koristiti za rano otkrivanje NGAL u urinu i omogućiti poboljšanje u liječenju pacijenata s AKI.

Cistanche

Metode

1. Ekspresija i pročišćavanje NGAL

Slijed ljudskog NGAL gena iz Genbank (NP{{0}}.2) sintetizirao je Pekinški institut za genomiku (BGI) i dodao mu je restrikcijske enzime HindIII i XhoI na oba kraja. Plazmidi su obrađeni s HindIII i XhoI i zatim klonirani u vektor pSecTag2A. Konstruirani plazmidi su sekvencionirani kako bi se potvrdilo da nema mutacije i zatim transformirani u stanice jajnika kineskog hrčka (CHO) pomoću LipofectamineTM2000. Nakon 8 dana, stanični supernatant je sakupljen nakon filtriranja 0,45 µm filtera. Eksprimirani NGAL-6×His protein pročišćen je s nikl-nitrilotrioctenom kiselinom (Ni-NTA) kolonom, a različite frakcije su sakupljene i procijenjene elektroforezom na natrijevom dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE). Komplet za kvantificiranje proteina bicinhoninske kiseline (BCA) mjerio je koncentraciju proteina.

Pročišćeni rekombinantni protein podvrgnut je 12 postotnoj SDS-PAGE, zatim adsorbiran na membranu od poliviniliden fluorida (PVDF). Nakon što je membrana blokirana u tris puferu s 1 posto otopinom Tween-20 (TBST) koja sadrži 5 posto obranog mlijeka na sobnoj temperaturi (RT) tijekom 2 sata, inkubirana s HRP-konjugiranim anti-6×His oznakom antitijela (1:5000) u mraku 1 h na sobnoj temperaturi, vizualizirano s benzidinom nakon ispiranja s TBST i vizualizirano pomoću Bio-Rad Western blotting detekcijskog sustava (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Izrael).

2. Stvaranje i pročišćavanje MAbs

U prvoj imunizaciji, ženke BALB/c miševa (starosti 6 tjedana, ukupno 10) imunizirane su s 50 µg NGAL-6×His rekombinantnog proteina emulgiranog u jednakoj dozi potpunog Freundovog adjuvansa i akcesijsko imunizirani postignuti su s proteinom emulgiranim u nepotpunom Freundovom adjuvansu. Dvije hipodermalne injekcije na leđima miševa i naknadne intraperitonealne injekcije u razmaku od 21 dan. Uzorci seruma prikupljeni su tjedan dana nakon treće injekcije, a titar antiseruma određen je neizravnim enzimskim imunotestom (ELISA)[12]. Tri dana prije fuzije, miševi su proveli booster imunizaciju s 50 µg NGAL-6×His razrijeđenog s 0,9 posto NaCl.

Izolirane imunološke stanice slezene miševa i stanice mijeloma SP2/0 pomiješane su u omjeru 3:1 da se spoje u fuzijskoj komori LF498-3 platinske elektrode (BEX Co., Ltd, Japan) kako je opisano u literaturi[13]. Ukratko, miješana ćelija isprana je dva puta s 10 mL elektrofuzijskog pufera (0.3 M manitol, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, pH 7.2) i ponovno suspendiran u koncentraciji od 2 × 107 stanica/mL. Fuzija je dovršena korištenjem napona izmjenične struje od 50 V na 0,8 MHz tijekom 20 s, napona impulsa istosmjerne struje od 450 V od 2 ponavljanja tijekom 0,5 s, a postfuzija je bila 50 V na 0,8 MHz za 7 s. Konačno, suspenzija stanica tretirana električnom energijom premještena je iz fuzijske komore u 4,5 mL prethodno zagrijanog RPMI 1640 (20 posto fetalnog goveđeg seruma) tijekom 30 minuta na 37 stupnjeva, zatim uzgojena u 96-pločama s jažicama i inkubirana s 5 posto CO2 na 37 stupnjeva. Nakon 24 sata, hipoksantin-aminopterin-timidin (HAT) je dodan u svaku jažicu. Supernatanti stanične kulture pregledani su ELISA-om nakon 9 dana fuzije, a izračunati broj klonova hibridoma je bio. BALB/c miševi kojima je unaprijed ubrizgano parafinsko ulje inokulirani su s 1 × 106 NGAL hibridomskih stanica, ascites je pročišćen s Protein A kolonom.

3. Identifikacija MAbs

Podklase imunoglobulina antitijela analizirane su korištenjem pribora za identifikaciju podklase antitijela. Neizravna ELISA pregledala je specifična MAb korištenjem pročišćenog rekombinantnog NGAL{{0}}×His proteina i PCT- 6×His proteina. Interakcija između antigena i protutijela određena je sustavom BIAcore T200 (GE Healthcare, Stockholm, Švedska) u HBS-EP puferu (0,005 posto surfaktanta P20, 10 mM Hepes, pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl). NGAL antigen je adsorbiran na CM5 biosenzorskim čipovima dostižući 400-480 jedinica odgovora (RU) pomoću kompleta za spajanje amina. Protutijela (2F4 i 1G1) razrijeđena su u HBS-EP puferu i polako su prolazila preko čipa s 50 µL/min tijekom 5 minuta, a potom je HBS-EP pufer ubrizgan preko čipa za praćenje faze disocijacije tijekom 4 minute . Senzorski čipovi regenerirani su otopinom glicina (pH 3,0) nakon faze disocijacije. Za svaki analit koji je prošao kroz čip, specifični odgovori iz kanala protoka antigena mogu oduzeti nespecifične odgovore iz kanala kontrolnog protoka. Prilagođene krivulje vezanja zasićenja iscrtane su na temelju koncentracija analita za ravnotežne odgovore vezanja za izračunavanje KD.

Pročišćena anti-NGAL MAb analizirana su u 12 postotnoj SDS-PAGE pod nereducirajućim uvjetima i redukcijskim uvjetima. Ukratko, uzorak je pomiješan s 5 x nereducirajućim puferom ili 5 x puferom za punjenje proteina i napunjen na 12 posto SDS-PAGE. Specifičnost anti-NGAL MAbs određena je Western Blotom. NGAL proteini su obrađeni na 12 posto SDS-PAGE, zatim su adsorbirani na PVDF membranu koja je aktivirana namakanjem u metanolu tijekom 15 sekundi, a zatim podvrgnuti uvjetima elektroforeze na 100 V tijekom 2 sata. Nakon blokiranja u Tris-HCl puferu s 1 posto otopine Tween-20 (TBST) koja sadrži 5 posto obranog mlijeka na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata, membrana je inkubirana s mišjim anti-NGAL MAbs kao primarnim protutijelima na 4 stupnja. Sljedeći dan, membrana je isprana s TBST i inkubirana s anti-mišjim konjugiranim HRP IgG u mraku 1,5 h na sobnoj temperaturi. Konačno, membrana je vizualizirana Western blot detekcijskim sustavom pojačane kemiluminiscencije (ECL).

4. Kompetitivni imunoenzimski testovi (ELISA)

Dva MAb-a testirana su na sposobnost prepoznavanja jedinstvenih epitopa na NGAL pomoću cELISA. MAb je konjugiran s HRP korištenjem kompleta za označavanje antitijela HRP (Shanghai YSRIBIO industrial co., LTD), čija je radna koncentracija testirana putem izravne ELISA. {{0}}Mikrotitarske ploče su obložene s 2 µg/mL NGAL antigena preko noći na 4 stupnja, zatim je neobilježeno MAb (0,2 µg/jažici, 2 µg/jažici) kompetitivno vezano s optimalnim omjerom razrjeđenja HRP obilježen MAb i inkubiran 1 sat na 37 stupnjeva. Enzimska reakcija se pojavila s vodikovim peroksidom pomoću supstrata 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) i zaustavljena 2 M sumpornom kiselinom u sve jažice. Apsorbancija (OD450 nm) određena je Bio-Rad čitačem mikropločica (Bio-Rad Laboratories, Inc). Učinci blokiranja MAbs izračunati su pomoću sljedeće jednadžbe: 100×[1-OD_{450 nm}(HRP-MAb plus MAb)/OD450 nm HRP-MAb]. Dva MAbs prepoznala su različite epitope ako su učinci blokiranja primijećeni u više od 40 posto.

Ekstrakt cistanče

5. Konjugacija EU-NPS

Anti-NGAL monoklonska antitijela 1G1 i 2F4 kovalentno su konjugirana na EU-NPS standardnim postupkom Bangs Laboratories. Ukratko, 100 µL EUNPS dodano je u 900 µL 0.05 M MES (pH 7.{{ 32}}) i raspršena ultrazvukom, vibrirana 15 minuta na sobnoj temperaturi u prisutnosti {{40}}.08 M N-hidroksisulfosukcinimida (NHS) i 0,05 M 1-({{19 }}Dimetilaminopropil)-3-etil karbodiimid hidroklorid (EDC). Aktivirani EUNPS je ispran s puferom za spajanje (0,05 mM H3BO3, 0,04 mM Na2B4O7, pH 7,5) i reagirao je s 0,3 mg protutijela 2,5 h na sobnoj temperaturi. Spoj s europijem konjugiran je u 1000 µL pufera za blokiranje (10 posto BSA, 20 posto tween-20, 0,05 M Tris-HCl) tijekom 1 sata, dodan u 1000 µL osnovne otopine (10 posto BSA, 20 posto trehaloza, 20 postotak tween-20, 0,05 M Tris-HCl) za pohranu na 4 stupnja.

6. Razvoj LFIA

LFIA trake sastojale su se od nitrocelulozne membrane, jastučića konjugata, jastučića za uzorke i upijajućeg jastučića. Membrane od staklenih vlakana natopljene su puferom za blokiranje (20 posto trehaloza, 10 posto BSA, 20 posto tween-20, 0,05 M Tris, 3,2 mM EDTA.Na2, pH 8,6) tijekom 1,5 h. Koncentracija od 1 mg/mL MAbs (2F4 ili 1G1) nanesena je na testnu liniju (TL) nitrocelulzne membrane, a kozji anti-mišji IgG 1 mg/mL nanesen je na istu NC membranu na udaljenosti od 4 mm do iz linije za kontrolu kvalitete (CL), volumen spreja instrumenta za doziranje postavljen je na 1 µL/cm. Membrana i podloga od staklenih vlakana sušeni su 48 h na 45 stupnjeva prije testiranja. Različite čestice konjugata EU-NPS-1G1 i EU-NPS-2F4 presvučene su na podlogu konjugata, a fluorescentni signal mjeren je imunofluorescentnim analizatorom (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd).

7. Prikupljanje uzoraka urina i pacijenti

Ukupno 83 uzorka ljudskog urina pacijenata s AKI-om prikupljena su iz pridružene bolnice Medicinskog sveučilišta Jilin. Etičke smjernice strogo su poštovane u eksperimentu, a osigurala ih je pridružena bolnica medicinskog sveučilišta Jilin (br.2018-LW029). Svi ispitanici dobili su usmeni i pismeni informirani pristanak na kineskom jeziku za proučavanje uzoraka urina. Svi eksperimenti izvedeni su prema Helsinškoj deklaraciji etičkih načela. Prosječna dob pacijenata od 62 godine kretala se od 20 do 80 godina koji nisu bili zaraženi COVID-om-19, a AKI stadija 1-3 klasificirani su prema kriterijima AKI-a za poboljšanje globalnih ishoda bolesti bubrega[14]. Uzorci urina prikupljani su za analizu NGAL do 12 sati prije dijagnosticiranja AKI i u čestim intervalima nakon operacije u različitim vremenskim točkama (12, 24, 48 sati). Kako bi se smanjili potencijalni zbunjujući čimbenici, uzorci urina brzo su analizirani u kliničkom kemijskom laboratoriju uključujući biokemiju urina (ukupne koncentracije proteina < 1 g/dL, urea < 12 g/dL, glukoza < 1 g/dL, kreatinin u mokraći < 1 g/dL , albumin < 2,5 g/dL, pH 4.5-9.0) i provedeno u duplikatima. Unutar 30 minuta od prikupljanja uzorka, centrifugirani su na 3000 okretaja u minuti na 4 stupnja tijekom 15 minuta. Najmanje 100 µL supernatanta raspodijeljeno je u sterilne spremnike i pohranjeno na -80 stupnjeva za daljnje analize, kako bi se izbjegli ponovljeni ciklusi smrzavanja-odmrzavanja.

Mjerenje razina NGAL provedeno je upotrebom ARCHITECT kita NGAL reagensa u urinu (Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Irska) korištenjem nekonkurentnog, sendvič formata s detekcijom kemiluminiscentnog signala. Urinarni NGAL je prepoznat pomoću antifungalnog antitijela koje je bilo kovalentno vezano za paramagnetske čestice u reagensu za mikročestice i konjugata drugog anti-NGAL antitijela povezanog s akridinijem. Slijedeći upute proizvođača, kalibracijski test je proveden u rasponu od 0- 1500 ng/mL i izmjerena je koncentracija NGAL.

8. Ispitivanje i analiza kliničkih uzoraka

Serijske koncentracije NGAL standardnog antigena (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000 i 3000 ng/mL) pripremljene su korištenjem FBS-a za jačanje specifičnih reakcija biokonjugata, svaka koncentracija radila je tri ponavljanja. Nakon što su klinički uzorci dodani na jastučiće za uzorke, čitač je zabilježio rezultate intenziteta fluorescencije na liniji T (HT) i liniji C (HC). Kvantitativna detekcija dovršena je omjerom HT/HC kako bi se učinkovito eliminirale razlike u trakama (T i C) i učinci standardne matrice matematičkog uzorka[15]. Standardna krivulja nacrtana je u odnosu na svaku koncentraciju NGAL i omjer HT/HC.

9. Statistička analiza

Passing-Bablok regresijska analiza i BlandAltmanov dijagram izvedeni su analizom varijance (ANOVA) softvera MedCalc i SPSS 17.0. Svi podaci prikazani su kao srednje vrijednosti sa standardnom devijacijom (srednja vrijednost ± SD).

Cistanche pilule

Reference

1. Zheng X, Zhao Y, Yang L: Akutna ozljeda bubrega kod COVID-a-19: Kinesko iskustvo. Seminari iz nefrologije 2020, 40(5):430–442.

2. Mandelbaum T, Scott D, Lee J, Mark R, Malhotra A, Waikar S, Howell M, Talmor D: Ishod kritično bolesnih pacijenata s akutnom bubrežnom ozljedom pomoću kriterija Acute Kidney Injury Network. Critical care medicine 2011, 39(12): 2659–2664.

3. Al-Hwiesh A, Mohammed A, Elnokeety M, Al-Hwiesh A, Al-Audah N, Esam S, Abdul-Rahman I: Uspješno liječenje tri pacijenta s akutnom ozljedom bubrega izazvanom COVID-19 peritonealnom dijalizom : Prikaz slučaja i pregled literature. Peritonealna dijaliza međunarodna 2020, 40(5):496–498.

4. Shabaka A, Rovirosa-Bigot S, Guerrero Márquez C, Alonso Riaño M, Fernández-Juárez G: Akutna ozljeda bubrega i nefrotski sindrom sekundarni zbog fokalne segmentalne glomeruloskleroze povezane s COVID{3}}. Nefrologija 2021.

5. Gabbard W, Milbrandt E, Kellum J: NGAL: alat u nastajanju za predviđanje ozbiljnosti AKI lako se otkriva kliničkim testom. Intenzivna njega 2010, 14(4): 318.

6. Zuk R, Ginsberg V, Houts T, Rabbie J, Merrick H, Ullman E, Fischer M, Sizto C, Stiso S, Litman D: Enzimska imunokromatografija – kvantitativni imunotest koji ne zahtijeva instrumente. Clinical chemistry 1985, 31(7): 1144–1150.

7. Juntunen E, Myyryläinen T, Salminen T, Soukka T, Pettersson K: Učinkovitost fluorescentnih nanočestica europija(III) i reportera koloidnog zlata u ispitivanju bioafiniteta bočnog protoka. Analitička biokemija 2012, 428(1):31–38.

8. Swanson C, D'Andrea A: Ispitivanje bočnog protoka s bojom bliskom infracrvenom za detekciju multipleksa. Klinička kemija 2013, 59(4):641–648.

9. Chen Y, Fu Q, Xie J, Wang H, Tang Y: Razvoj visokoosjetljivog testa bočnog protoka fluorescentnog gašenja na bazi kvantne točke za detekciju zearalenona. Analitička bioanalitička kemija 2019, 411(10): 2169–2175.

10. Zhang F, Zou M, Chen Y, Li J, Wang Y, Qi X, Xue Q: Imunokromatografske trake obilježene lantanidom za brzo otkrivanje Pantoea stewartii subsp. Stewart. Biosenzori bioelektronika 2014, 51:29–35.

11. Nankoberanyi S, Mbogo G, LeClair N, Conrad M, Tumwebaze P, Tukwasibwe S, Kamya M, Tappero J, Nsobya S, Rosenthal P: Validacija testa fluorescentne mikrosfere reakcije otkrivanja ligaze za detekciju polimorfizama koji posreduju otpornost na Plasmodium falciparum u Ugandi. Malaria Journal 2014, 13:95.

12. Xu H, Dong Y, Guo J, Jiang X, Liu J, Xu S, Wang H: Proizvodnja monoklonskih antitijela i razvoj neizravnog kompetitivnog enzimski vezanog imunosorbentnog testa za probir T-2 toksina u mlijeku. Toxicon 2018, 156:1–6.

Moli Yin1, Yuanwang Nie2, Hao Liu2, Lei Liu1, Lu Tang1, Yuan Dong2, Chuanmin Hu1 i Huiyan Wang1

1 Jilin Collaborative Innovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, NR Kina.

2 Academy of Laboratory, Jilin Medical University, 132013 Jilin, NR Kina.