Dio 3 Studije su pokazale da autofagija igra važnu ulogu u regulaciji staničnog taloženja LD

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

SAŽETAK

Novi dokazi pokazuju da neočekivano taloženje lipidnih kapljica (LD) i peroksidacija mogu ubrzati stres organela i igraju ključnu ulogu u patogenezi neurodegenerativnih bolesti (NDD). U našoj prethodnoj studiji potvrdili smo da je kempferol (Ka), mala molekula prirodnog flavonoida, pokazao neuroprotektivne učinke na miševe s Parkinsonovom bolešću (PD) izazvanom LPS-om. Osim toga, prethodne studije su pokazale da autofagija igra važnu ulogu u regulaciji staničnog taloženja LD. U trenutnoj studiji, pokazali smo da Ka štiti od TH plus gubitka neurona i poremećaja u ponašanju kod MPTP/p-induciranog PD miševa, popraćenog smanjenim lipidnim oksidativnim stresom u substantia nigra pars compacta (SNpc). U uzgojenim neuronskim stanicama, Ka je pokazao relativno siguran raspon koncentracija i značajno je potisnuo nakupljanje LD i staničnu apoptozu induciranu s MPP plus. Daljnje studije su pokazale da zaštitni učinak Ka ovisi o autofagiji, točnije lipofagiji. Kritično, Ka je poticao autofagiju da posreduje u razgradnji LD u lizosomima, što je zatim ublažilo taloženje lipida i peroksidaciju i rezultirajuće oštećenje mitohondrija, posljedično smanjujući neuronsku smrt. Nadalje, AAV-shAtg5-posredovano obaranje Atg5 ukinulo je neuroprotektivne učinke Ka protiv oksidacije lipida u PD miševa.Cistanche za poboljšanje pamćenjaOvaj rad pokazuje da Ka sprječava dopaminergičku neuronalnu degeneraciju kod PD-a putem inhibicije oštećenja mitohondrija posredovanog lipidnom peroksidacijom promicanjem autofagije usana i pruža potencijalnu novu terapijsku strategiju za PD i srodne NDD-ove.

Kliknite ovdje da saznate više

Uvod

Parkinsonova bolest (PD) je česta neurodegenerativna bolest (NDD) koja je patološki karakterizirana progresivnim gubitkom dopaminergičkih (DA) neurona u substantia nigra pars compacta (SNpc)[1]. Iako točna etiologija i prirodni tijek ove bolesti još nisu u potpunosti razjašnjeni, brojni procesi i disfunkcije na razini sustava, uključujući mitohondrijske funkcije, homeostazu dopamina, neuroupalu i autofagiju, uključeni su u patogenezu PD [1, 2]. Nedavna izvješća otkrila su da bi lipotoksičnost povezana s kapljicama lipida (LD) mogla sudjelovati u patologiji PD [3,4]. LD su visoko dinamične organele koje izlaze iz membrane endoplazmatskog retikuluma (ER) i normalno služe kao unutarstanična mjesta skladištenja neutralnih lipida [5]. ]. Nedavno je pokazano da LD imaju mnogo širu ulogu od skladištenja masnih kiselina (FA) i da sudjeluju u mnogim bolestima. (cistanche para que serve) Na primjer, mijeloidne stanice, uključujući makrofage, leukocite i eozinofile, stvaraju LD kao odgovor na upalu i stres,cistanche na kineskomi LD su mjesta proizvodnje i skladištenja upalnih citokina i dalje su uključeni u prezentaciju antigena i uklanjanje patogena [6]. Važno je napomenuti da je kod ateroskleroze dokazano da su pjenaste stanice bogate LD-om štetne u svim stadijima bolesti [7].

Cistanche može poboljšati imunitet

Međutim, LD nisu opsežno proučavani u središnjem živčanom sustavu (CNS), s nekoliko radova koji izvješćuju o histološkoj prisutnosti LD u tkivu ljudskog mozga [8,9]. Unatoč tome, LD mogu imati važne funkcije u mozgu, budući da su nedavne studije potvrdile da agregirani LD u gliji ubrzavaju neurodegeneraciju u modelu Drosophila [10]. Nedavno je objavljeno da kod miševa masne crvene O-pozitivne stanice pune lipida, uključujući neurone, glijalne fibrilarne kisele proteine ​​(GFAP)t astrocite i ioniziranu molekulu adaptera za vezanje kalcija-1 (IBA{{7} })t mikroglije, prisutne su u mnogim regijama mozga i pokazalo se da sudjeluju u procesima povezanim sa starenjem [11]. Naš prethodni rad također je pokazao povećano nakupljanje LD u mozgu u modelu PD miša [12]. Uzete zajedno, ove studije sugeriraju da bi LD-ovi mogli biti uključeni u patogenezu PD-a, kao i drugih NDD-ova.

Obično se unutarstanični LD razgrađuju u lizosomima i isporučuju FA u mitohondrije za njihovu potrošnju kao alternativni izvor energije tijekom razdoblja iscrpljenosti hranjivih tvari [13]. Međutim, neuroni imaju nizak kapacitet mitohondrijske potrošnje FA za proizvodnju energije [14]. Ova karakteristika čini neurone posebno osjetljivima na nakupljanje i peroksidaciju LD. Nadalje, nakupljanje LD-a povećava brzinu oksidacije FA i nameće trajni pritisak na mitohondrijski transportni lanac elektrona, što povećava proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) pomoću kompleksa transportnog lanca elektrona I i III [15] kako bi se pojačao oksidativni stres. Preopterećenje lipidima također dovodi do proizvodnje ROS ekstramitohondrijskih izvora kao što su nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidaze i drugi oksidativni enzimi. U kombinaciji sa smanjenom ekspresijom antioksidativnih enzima i niskim kapacitetom za potrošnju FA u neuronima, nakupljanje LD posreduje u oksidativnom stresu i može dalje dovesti do oštećenja mitohondrija, lizosomske disfunkcije, neispravne autofagije i aktivacije upalnih odgovora [16,17]. Osim ako se akumulirani LD ne mogu inhibirati ili ukloniti, visoko aktivni neuroni prolaze kroz patofiziologiju, što dovodi do neurodegeneracije [17]. (cistanche penis) Dokazi pokazuju da katabolički proces posredovan lizosomima koji se zove autofagija igra ključnu ulogu u održavanju stanične homeostaze LD u više tkiva [17,18]. Detaljno,cistanche rast penisaLD se mogu selektivno odvojiti u autofagosomima i dostaviti lizosomima na razgradnju pomoću lizosomalnih kiselih lipaza, proces posebno poznat kao lipofagija [19]. Stoga bi ciljanje LD-a i njihovog autofagičnog puta uklanjanja moglo predstavljati novi pristup upravljanju neurodegeneracijom.

Proučavanje prirodnih proizvoda i prehrambenih agenasa kao izvora potencijalnih NDD tretmana i strategija je posljednjih godina steklo ogroman interes [20]. Kemferol (Ka) je prirodna polifenolna mala molekula koja se može naći u nizu kineskih ljekovitih biljaka i prehrambenih izvora [21]. Prijavljeno je da Ka djeluje antibakterijski, protiv starenja i imunomodulatorno, kao i antioksidativno i neuroprotektivno djelovanje [20,22,23]. Prethodno je objavljeno da Ka inhibira upalu u mikroglijalnim stanicama BV2 in vitro [24] i povećava otpornost DA neurona na neuroupalu in vivo [25]. Međutim, učinak Kaon LD-a na PD još nije istražen.

S obzirom na važnost LD-ova i blisku vezu između LD-ova, mitohondrija i autofagije [16], koji su svi uključeni u PD, pretpostavljamo da Ka inhibira peroksidaciju LD-a i sprječava neurodegeneraciju DA u PD-u. U ovoj studiji pokazali smo da Ka značajno štiti od neurodegeneracije u mišjem PD modelu inhibicijom nakupljanja LD. (cistanche prah) Daljnja studija otkrila je da je Ka pokrenuo autofagiju i smanjio nakupljanje oksidiranih LD-a kako bi se ublažila mitohondrijska disfunkcija i proizvodnja mitohondrijskih ROS (mtROS), čime se spriječila apoptotička smrt neurona.cistanche propiedadesNalazi dobiveni u ovoj studiji mogu pomoći u usmjeravanju kliničkih odluka u vezi s upotrebom prirodne molekule Ka u NDD-ovima kao što je PD.

2. Materijali i metode

2.1. Pokusne životinje

C57BL/6J miševi (muški, 4-mjesečni) dobiveni su s Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing).cistanche tubulosa beneficiosMiševi su održavani i uzgajani u Centru za životinjske resurse Medicinskog fakulteta Medicinskog sveučilišta u Nanjingu iu objektu za životinje u bolnici Nanjing Drum Tower. Miševi imaju slobodan pristup hrani i vodi u prostoriji s temperaturom okoline od 22 stupnja ±2 stupnja i ciklusom svjetlo/tama od 12:12 h. Svi postupci na životinjama provedeni su u strogom skladu sa smjernicama Nacionalnog zdravstvenog vodiča za njegu i korištenje laboratorijskih životinja.

2.2.Reagensi

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 posto,96,353) za in vitro eksperimente dobiveno je od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) i DHE (D11347) kupljeni su od Thermo Fisher Scientific. Za pokuse na životinjama, Ka je otopljen u otopini od 10 posto DMSO u 16 posto SBE- -CD u sterilnoj fiziološkoj otopini. Za stanične eksperimente, Ka je pripremljen u DMSO (Sigma-Aldrich) i PBS (konačna koncentracija DMSO je 0,01 posto), pH 7,4.

2.3. Indukcija i liječenje metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)-induciranog PD mišjeg modela

Za procjenu učinaka Ka u PD modelu MPTP/p-toksičnosti, miševi (mužjaci, stari 4-5 mjeseci) nasumično su podijeljeni u skupinu tretiranu fiziološkom otopinom, skupinu tretiranu MPTP-om, skupinu tretiranu MPTP plus Ka , i samo Ka tretirana skupina. U skupini liječenoj MPTP-om, miševi su primali kroničnu primjenu MPTP-a s protokolom sličnim prethodno opisanom [26]: MPTP je otopljen u fiziološkoj otopini i ubrizgan supkutano u dozi od 25 mg/kg nakon čega je slijedilo 250 mg/kg probenecida (otopljenog u dimetil sulfoksidu) intraperitonealna (ip) injekcija u intervalima od 1 h svaka 3,5 dana tijekom razdoblja od 5 tjedana. (korijen cistanke) Kontrolni miševi primili su fiziološku otopinu i injekciju probenecida. U skupini koja je primala MPTP plus Ka, miševi su primali Ka (50 mg/kg, jedna injekcija/dan tijekom pokusa, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Kina) intraperitonealno (ip) dnevno 3 dana prije tretmana s MPTP i tijekom 5 MPTP tjedna injekcije. Tjedan dana nakon posljednje injekcije MPTP-a, miševi su podvrgnuti ispitivanju ponašanja zaslijepljenih skupina. Nakon toga, svi miševi su anestezirani s 40 mg/kg natrijevog pentobarbitala i žrtvovani za detekciju moždanih proteina i imunohistokemijsku ili qPCR analizu.

2.4. In vivo stereotaksična kirurgija i eksperimentalni tretmani

Stereotaksični kirurški zahvat pod anestezijom natrijevim pentobarbitalom (40 mg/kg, ip) izveden je kako je opisano [25]. Mišji Atg5 i kontrolna shRNA transficirani su vektorima za pakiranje (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP) kako bi se stvorio AAV. Za mikroinjekciju, anestezirani miševi se stavljaju u stereotaksički aparat. Ubrizgan im je 1 μL AV pomoću staklene elektrode usmjerene na DG (AP:-0.3 mm; ML: ±0.13 mm; DV: -0.45 mm） brzinom od 0,25 μL/min. Zatim je igla zadržana dodatnih 2- min. 2 tjedna nakon mikroinjektiranja virusa, miševi su podvrgnuti MPTP-induciranom PD modelu provođenja i (ili) Ka tretmanu.

Atg5 shRNA dobivena je od Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Za Atg5 tišinu, početnice su prikazane u Dodatnoj tablici 1.

2.5. Analiza ponašanja

Tjedan dana nakon završne injekcije MPTP-a ili slane otopine, obavljeni su rotarod test i pole test kao što je prethodno opisano [27]. Za rotacioni test, miševi su aklimatizirani na rotacioni štap u dva pokusa (6 minuta s ubrzanom brzinom od 12-20 okr/min) dnevno tijekom 2 uzastopna dana prije početka eksperimenta. Zatim su miševi testirani na 20 okretaja u minuti tijekom 300 s tijekom druga 3 uzastopna dana. Kašnjenje pada zabilježeno je pomoću Rotarod Analysis System (Jiliang, Šangaj, Kina). Za test na stupu, miševi su postavljeni glavom gore na vrh okomitog drvenog stupa (hrapave površine, visine 50 cm, promjera 1 cm). Svi miševi su naviknuti na aparat 2 dana prije testiranja, a zatim su testirani tri puta trećeg dana. Zabilježeno je ukupno vrijeme (T-ukupno, dok miš nije došao do poda sa svoje četiri šape) i vrijeme okretanja (T-okret, da se miš potpuno okrene glavom prema dolje). Eksperiment je bio slijep za skupine miševa za svaki test ponašanja i test je izveden tri puta.

2.6. Prikupljanje uzoraka mozga

Nakon završnih testova ponašanja, miševi su anestezirani natrijevim pentobarbitalom (40 mg/kg, ip). Za qPCR, western blotting i analizu tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC), cijeli mozgovi su brzo ekstrahirani iz životinja, zatim su tkiva srednjeg mozga i strijatuma brzo secirana, prethodno zamrznuta tekućim dušikom. Svi su uzorci pohranjeni na -80 stupnjeva do analize.

Za imunohistokemijsku analizu, miševi su perfundirani transkardijalno s 4 posto paraformaldehida (PFA). Mozgovi su ekstrahirani, naknadno fiksirani, dehidrirani, ugrađeni u OCT (Tissue-Tek), a serijski presjeci mozga su kriosekcionirani (30 μm po rezu) kroz svaki cijeli stratum i međumozak korištenjem mikrotoma za zamrzavanje (Leica CM1950, Nussloch, Njemačka ). Svi su dijelovi sakupljeni u šest odvojenih serija, a rezovi mozga pohranjeni su u 50-postotnom glicerinu i zamrznuti na -20 stupnjeva do analize.

Za TEM, miševi su perfundirani s 2,5 posto glutaraldehida i 2 posto paraformaldehida kao što je opisano 【12】. Mala porcija (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Imunohistokemijska analiza

Kriške mozga su isprane u PBS-u, a zatim 3 posto H2O2 tijekom 10 minute, zatim su inkubirane s 0.3 posto Triton X-100 u PBS-u dopunjenom s 5 posto BSA tijekom 1 sata. Nakon toga stakalca su inkubirana s primarnim protutijelima na 4 stupnja preko noći u PBS-u koji sadrži 5 posto BSA na 4 stupnja preko noći, zatim su isprana i inkubirana u sekundarnim protutijelima 1 h na sobnoj temperaturi, nakon čega je uslijedila inkubacija s diaminobenzidinom (DAB) ili stavljanje u DAPI (Life Technologies, Cat P36931) kao imunofluorescentno bojenje tijekom 5 min. Za bojenje po Nisslu stakalca su spojena u otopini krezil violeta (CV) (0,1 g krezil violeta, 99 ml H20 i 1 posto octene kiseline 1 ml) 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim dehidrirana alkoholom i ksilenom. Slike su promatrane i fotografije su snimljene pod mikroskopom Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Sjedinjene Države). Ukupan broj TH-pozitivnih i Nissl-pozitivnih neurona u SNpc dobiven je serološki metodom optičkog frakcionatora sa softverom MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, SAD).

2.7. Analiza tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC).

Uzorci strijatuma miševa homogenizirani su s {{0}}.1 M perklornom kiselinom （1 mg tkiva u 100μL perklorne kiseline） i 0,1 mM EDTA, tretirano ultrazvukom, i centrifugirano na 20,000 okretaja u minuti tijekom 30 minuta kako je objavljeno [27]. Zatim su tekućine supernatanta sakupljene za mjerenje. Mobilna faza je miješana otopina koja se sastoji od 90 mM monobazičnog natrijevog fosfata, 1,7 mM 1-oktan sulfonske kiseline, 50 mM citrata, 50 uM EDTA, 10 posto acetonitrila s brzinom protoka od 0,2 ml/min. Paralelno, za izračun kvantitativne standardne krivulje, pripremljene su osnovne standardne otopine za dopamin i dihidroksi-fenil octenu kiselinu (DOPAC) (Sigma-Aldrich, SAD) u 0,1 M HClO4. Ubrizgana je količina od 10 ul pripremljenog supernatanta ili standardne otopine u mobilnu fazu i testiran elektrokemijskim detektorom ESA Coulochem III (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Uzorci su izmjereni i pikovi su kvantificirani. Koncentracije monoamina su kvantificirane usporedbom sa standardom pomoću softvera ClarityChrom (Knauer, Njemačka) i zatim sadržaji u stratumu pretvoreni su prema omjeru razrjeđenja. Standardna krivulja DA i DOPAC prikazana je na Dodatnoj slici 1a i b.

2.8. Kulture stanica i tretmani

Kulture mezencefaličnih primarnih neurona provedene su kako je prethodno opisano [12]. Ukratko, mezencefalna tkiva C57BL/6 miševa na embrionalni dan 14/15 (E14/15) pažljivo su uklonjena, mehanički disocirana kako bi se uklonile membrane i velike krvne žile, a zatim secirao. Zatim su digestirani s tripsin-EDTA (Amresco, Solon, OH, SAD) i zatim filtrirani kroz 100-um filtar da se dobije jednostanična suspenzija. Nakon toga, stanice su nasađene na 12-/24-jažične ploče prethodno obložene poli-L-lizinom pri 2,5 × 10 stupnjeva stanica/ml koje sadrže Neurobasal medij (Cat 21103049, GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Rockford, SAD) s dodatkom B27 (2 posto v:v, Cat 1750404, GibcoTM) i penicilin/streptomicin (0,5 posto v:v). Kulture su držane u vlažnoj komori (37 stupnjeva, 5 posto CO2 inkubator). Medij kulture mijenjan je svaka 3 dana, a stanice se mogu koristiti nakon 7-10 dana.

Stanične linije: SH-SY5Y stanične linije uzgajane su u 10 posto FBS-a i 1 posto penicilina/streptomicina u vlažnom inkubatoru na 37 stupnjeva i 5 posto CO2. U pokusima, stanice SH-SY5Y tretirane su s MPP plus (200 μM) ili različitim dozama Ka (0,3,30,60,100,300,600uM) tijekom 24 sata. Ka(3,10, 30,60 μM, 3h)primed-SH- SY5Y stanice su stimulirane s MPPt（400 μM） tijekom 24 h. Ka（30 μM, 3h）sa （ili bez）3-MA（3mM,1h）ili -tokoferolom（50μM,1h, Sigma-Aldrich,47783 ）primirane-SH-SH5Y stanice stimulirane su s MPPT（200 μM） tijekom 24 h.

2.9. Preživljavanje stanica CCK8 test

Promijenjena održivost stanica tretmanom Ka otkrivena je kompletom za brojanje stanica-8 (CCK-8 komplet, Selleck, Houston, TX, SAD). Ukratko, stanice SHSY5Y posađene su u 96- ploča s jažicom i zatim tretirana različitim koncentracijama Ka（3,30,60,100,300,600,600 uM） tijekom 24 sata. Zatim je 10 ul reagensa CCK-8 dodano u svaku jažicu tijekom 4 h. Konačno, apsorbancija je detektirana Multiskan Spectrumom (Thermo Fisher Scientific) na 450 nm.

2.10. ATP analiza

Stanične razine ATP-a detektirane su ATP Bioluminescence Assay Kitom (Beyotime Biotechnology Co., Kina) prema uputama proizvođača. Nakon tretmana, stanice su lizirane i centrifugirane na 12,000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta na 4 stupnja, a supernatanti su sakupljeni. Radna otopina （100 μL） dodana je u 20 μL uzorka u 96-ploči s jažicama, a luminiscencija je odmah izmjerena na automatiziranom čitaču mikropločica. Mjerenja svih uzoraka normalizirana su na koncentraciju proteina.

2.11.Na plus -K plus -ATPaza analiza

Za mjerenje Nat-K plus -ATPaze (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Kina), stanice su sonikirane i centrifugirane na 600 okretaja u minuti 10 minuta da se dobije supernatant. Dodane su reakcijske otopine detekcije Nat-Kt-ATPaze i inkubirane prema uputama proizvođača. Zatim je detektirana apsorbancija na 660 nm. Mjerenja svih uzoraka normalizirana su na koncentraciju proteina.

2.12. Western blotting analiza

Stanice ili moždana tkiva su lizirana u RIPA puferu (50 mM Tris (pH 7,4),cistanche คือ150 mM NaCl, 1 posto NP-40 (FNN0021, Thermo), 0,5 posto natrijevog deoksikolata (D6750, Sigma), 0,1 posto SDS (74255, Sigma) s dodatkom proteaze i inhibitori fosfataze (Roche, Šangaj, Kina). Koncentracije proteina određene su s Micro BCA Kitom （Beyotime, Šangaj, Kina）. 30-ug protein svakog uzorka odvojen je pomoću SDS-PAGE pomoću poliakrilamidnih TGX gelova (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD) i zatim prebačen na membrane od poliviniliden difluorida (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Nakon blokiranja, PVDF membrane su inkubirane s različitim specifičnim primarnim antitijelima u TBST na 4 stupnja preko noći, zatim su isprane i inkubirane u odgovarajućim sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom hrena (HRP) 1 sat na sobnoj temperaturi. Imunoreaktivne vrpce vizualizirane su i detektirane pomoću poboljšane kemiluminiscencije (ECL) plus reagensa za detekciju (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) i analizirane korištenjem ImageQuantTM LAS 4000 sustava za slikanje (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, SAD).

2.13. Kvantitativna (Q) i reverzna transkripcija (RT) PCR u stvarnom vremenu

Ukupna RNA ekstrahirana je iz tkiva mozga i kultiviranih stanica pomoću Trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD). Reverzna transkripcija je provedena pomoću kompleta reagensa TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Japan). qPCR u stvarnom vremenu proveden je pomoću SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) u instrumentu StepOnePlus (Applied Bio-systems). Početnice je kupio i validirao General (Šangaj, Kina). Primeri korišteni za qPCR prikazani su u Dodatnoj tablici 2.

Ovaj je članak izvađen iz časopisa Redox Biology 41 (2021) 101911