za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Rasprava

Molekularna podloga stvaranja engrama bila je područje velikog interesa. Ovdje koristimo model miša TRAP kako bismo razjasnili dinamiku dostupnosti kromatina, 3-D genomske arhitekture i ekspresije gena tijekom životnog vijeka engramske stanice. Prvo, to izravno pokazujemomemorijakodiranje ima golem i dugotrajan učinak na dostupnost kromatina. Nakon što se ovo stanje kromatina uspostavi, naknadni događaji kao što jememorijačini se da konsolidacija i prisjećanje imaju manji učinak na krajolik kromatina. Moguće je da odabrana vremenska točka za prisjećanje možda neće u potpunosti obuhvatiti kromatinske događaje reaktiviranih stanica i naknadne promjene kromatina mogu biti povezane smemorijarekonsolidacija ili izumiranje8. Važno je, u skladu s prethodnim publikacijama12, 13,23, naši podaci to sugerirajumemorijaformiranje je uvelike fenomen koji pokreću pojačivači.

Kliknite na Cistanche UK za uspomenu

Drugo, naša studija pruža prvi sveobuhvatni pejzaž arhitekture 3D-genoma tijekom različitih fazamemorijaformiranje, jer smo pokazali ponovnu lokalizaciju velikih kromatinskih segmenata i specifične dinamičke interakcije promotor-pojačivač unutar ovih odjeljaka koji omogućuju fino podešavanje različitih transkripcijskih programa. Štoviše, pokazujemo da promotori niže reguliranih gena češće komuniciraju s pojačivačima koji sadrže transkripcijske represore i obrnuto.

Na kraju, naš rad pruža prve dokaze za funkcionalni početni događaj, koji je karakteriziran početnim povećanjem dostupnosti pojačivača tijekom kodiranja, bez očekivanih transkripcijskih promjena. Naša analiza je otkrila da s reaktivacijom engramski neuroni koriste podskup interakcija denovopromoter-pojačivač, gdje se početni pojačivači dovode u kontakt sa svojim odgovarajućim promotorima kako bi regulirali gene uključene u transport mRNA i lokalnu translaciju proteina u sinaptičkim odjeljcima. Te su promjene odgovarale očekivanim morfološkim i funkcionalnim promjenama. Zajedno, čini se da su engramske stanice označene na epigenetskoj razini i međuigra između dostupnosti kromatina, 3D-arhitekture genoma i interakcija promotora i pojačivača opisuje dobro koordinirani sustav koji dovodi do odgođenog transkripcijskog porasta tijekom reaktivacije engrama.

Kao i kod svakog rada, studija je imala nekoliko ograničenja. Korištenje TRAP miševa ovisnih o tamoksifenu omogućuje privremenu rezoluciju, ali otvara prozor označavanja od oko 12 sati što bi moglo rezultirati nespecifičnim označavanjem neurona koji nisu dio CFC iskustva. Štoviše, kao što je prethodno predloženo37, neuroni označeni Arc-om mogu biti heterogeni i uključivati ​​različite skupine koje reguliraju imemorijadiskriminacija i generalizacija. Osim toga, bilo koja vremenska točka prije 1,5–2 sata (rano) neće biti dovoljna za hvatanje transkripcijskih i translacijskih događaja uzrokovanih rekombinacijom DNA, tj. ekspresijom Cre rekombinaze i konačnom ekspresijom eYFP gena5. Stoga vjerujemo da su mnogi rani prijelazni klasteri DEG-a propušteni, jer je ranije pokazano da se mnogi IEG-ovi vraćaju na početnu razinu nakon 2 sata (osim Arc46). Na kraju, iako se naša studija usredotočila na hipokampus, strukturna i sinaptička plastičnost povezane su s dugotrajnim skladištenjem informacija u drugim regijama mozga, kao što je prefrontalni korteks, amigdala2. Buduće studije trebale bi utvrditi mogu li ove epigenetske promjene predstavljati globalni kritični proces uključen u dugoročno formiranje i zadržavanje sjećanja ili je to jedinstveno za hipokampalne krugove.

Metode

Miševi i ponašanje

Kao što je prethodno opisano6, miševi ArcCreERT2(plus) uzgajani su s homozigotnom linijom R26R-STOP-floxed-žuti fluorescentni protein (eYFP). ~140 sljedećih muških potomaka genotipizirano je korištenjem protokola genotipizacije laboratorija Jackson. Miševi su smješteni četiri do pet po kavezu u 12 sati (06:00–18:00) svijetlo-tamnoj kolonijskoj sobi na 22 stupnja s 40-60 posto vlage. Hrana i voda su davani ad libitum. Testiranje ponašanja provedeno je tijekom svjetlosne faze. 1 sat prije testa ponašanja, miševi su primili jednu dozu 4-hidroksitamoksifena (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich), što otvara prozor za označavanje od ~12 sati5. Kako bi se smanjila nespecifična eYFP oznaka, jedan dan prije bihevioralnog zadatka (npr. CFC), miševi su pojedinačno smješteni u 24-satnu tamnu/mračnu komoru. Osim toga, kako bi se smanjila razina tjeskobe, u kavez je dodana cijev za sklonište i gniježđenje. Sljedećeg dana, miševima je ubrizgan TAM 1 sat prije CFC-a. Nakon bihevioralnog zadatka, miševi su ili eutanazirani nakon 1,5-2 sata, a mozgovi su sakupljeni. ili se vrati u tamnu komoru na sljedećih 48 sati. Nakon što su miševi izvađeni iz mraka, vraćeni su na normalan ciklus od 12 sati (06:00–18:00) svjetlo-tama, u istoj prostoriji. 3 dana kasnije (ukupno 5 dana nakon CFC-a), polovica kohorte miševa je eutanazirana i sakupljen je mozak, dok je druga polovica vraćena u prostoriju za testiranje, gdje su bili izloženi znaku koji izaziva strah (ton i kontekst) . Sav rad s miševima odobrio je Odbor za brigu o životinjama Odjela za komparativnu medicinu na Massachusetts Institute of Technology. Cistanche se može poboljšatimemorija.

Cistanche može poboljšati pamćenje

Kontekstualno uvjetovanje straha

Aparat za kontekstualno uvjetovanje straha (CFC) i program prikupljanja bili su od TSE-Systema. Miševi su uvedeni u komoru s CFC-om, nakon 3 minute početnog navikavanja. Ton od 3 kiloHz s intenzitetom od 80 DB bio je predstavljen 30 sekundi i prekinut je šokom stopala od 0,7 mA tijekom 1 sekunde. Između pokusa za čišćenje kaveza korišten je 70-postotni izopropanol. 5 dana kasnije miševi su uvedeni u izvorni uvjetovani kontekst uparen s tonom, a razine smrzavanja su mjerene 3 minute (zadani parametri softvera TSE korišteni za praćenje ponašanja pri smrzavanju), kako bi se procijenilo kontekstualnomemorija. Kontekst B bio je modificirani kontekst A. Šipke od nehrđajućeg čelika bile su prekrivene bijelim plastičnim umetkom, a vanjske stijenke komora bile su prekrivene oblicima ljepljive trake kako bi se promijenio izgled komore. Komora je bila namirisana vanilijom, osvjetljenje u prostoriji bilo je mnogo svjetlije i miševi su do aparata prevezeni u drugim kolicima od konteksta A.

Droge

Rekombinacija u transgenim miševima ArcCreERT2 × R26R-STOP-floxed-EYFP inducirana je pomoću 4-hidroksitamoksifena (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich). 4-OHT je otopljen u 2,5 ml EtOH/100 posto i mućkan na mućkalici 30 minuta. Zatim je dodano 5 ml kukuruznog ulja i mućkano na mućkalici 1 sat. Konačno, epruvete su postavljene na 30 minuta na 60 stupnjeva kako bi se omogućilo potpuno isparavanje EtOH. Jednokratna injekcija od 50 mg/kg ubrizgana je intraperitonealno (ip).

Imunohistokemija (IHC)

Miševi su transkardijalno perfundirani s ledeno hladnim 25 ml fosfatno puferirane fiziološke otopine (PBS), a zatim s 40 ml 4-postotnog paraformaldehida u PBS-u. Mozgovi su uklonjeni i naknadno fiksirani u 4 posto PFA preko noći na 4 stupnja i prebačeni u PBS do rezanja. Mozgovi su postavljeni na postolje vibratoma (Leica VT1000S) pomoću superljepila i izrezani s rezom debljine 40 μm. Kriške su isprane s PBS-om i blokirane upotrebom 1 posto goveđeg serumskog albumina (BSA) pripremljenog u PBS-u koji sadrži 0,1 posto Triton-X100 (PBST) tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi. Pufer za blokiranje je aspiriran van i rezovi su inkubirani s odgovarajućim primarnim antitijelom (dodatna tablica 11) preko noći na 4 stupnja na mućkalici. Kriške su zatim isprane tri puta po 15 minuta s puferom za blokiranje, a zatim su inkubirane s Alexa Fluor 488, 594 ili 647 konjugiranim sekundarnim protutijelima 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon tri ispiranja po 15 minuta s puferom za blokiranje i jednog konačnog ispiranja s PBS-om tijekom 10 minuta, rezovi su postavljeni s fluromount-G (Electron microscopic Sciences). Cistanche se može poboljšatimemorija.

In situ hibridizacija (RNAscope®)

Uzorci su pripremljeni prema uputama proizvođača za RNAscope® multiplex fluorescent v2 test (Advanced cell diagnostics, SAD), uz nekoliko izmjena i u kombinaciji s Immunohistochemistry (IHC) protokolom. Prvo su uzorci obojeni na primarna (Arc i GFP) i sekundarna (Alexa Fluor 488 odnosno 594) protutijela (kao što je gore opisano u IHC protokolu). Kriške mozga umetnute su na predmetno staklo i

dehidriran 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je povučena barijera oko svakog odjeljka hidrofobnom olovkom Immedge™, a uzorci su tretirani s RNAscope® vodikovim peroksidom 10 minuta na sobnoj temperaturi (nije primijenjeno vraćanje cilja i tretman proteazom). Na temelju uputa proizvođača, sekcije su podvrgnute hibridizaciji sonde (RNAscope® Probe-Mm-Gria1, 26241, Advanced cell diagnostics), amplifikaciji i razvoju HRP-C1 signala pomoću TSA® Plus Cyanine 5 kanala. Cistanche može poboljšati pamćenje.

Analiza slike

Slike su dobivene pomoću konfokalnih mikroskopa LSM 710 ili LSM 880 (Zeiss) s objektivima 10×, 20×, 40× ili 63× pri identičnim postavkama za sve uvjete. Slike su kvantificirane pomoću ImageJ 1.42q ili Imarisx64 8.1.2 (Bitplane, Zurich, Švicarska). Za svaki eksperimentalni uvjet, pet koronarnih presjeka od najmanje pet životinja korišteno je za kvantifikaciju. Cistanche može poboljšati pamćenje.

Quantification of tagged cells—The surfaces module was utilized to detect Arc+ and eYFP+ cells. Double positive cells (co-localization of Arc+/eYFP+) were then counted using the Surface-To-Surface Xtension module. After applying the 'area' filter (>6 μM) za uklanjanje nespecifičnog označavanja, kvantifikacija dvostruko pozitivnih stanica provedena je u CA1, CA3 i DG. Cistanche može poboljšati pamćenje.

Kvantifikacija Eif i Gria1 proteina/mRNA—modul površina korišten je za otkrivanje i 3D renderiranje aksona neurona na temelju GFP signala. Pozitivne točke EiF2a, Eif4E, Eif3E i Gria1 - zatim su izbrojane pomoću modula mrlja. Konačno, modul Spots Close - To -Surface Xtension je pokrenut kako bi se pronašao podskup točaka koje su bliže površinskim objektima od definiranog praga od 1uM i isključile su točke koje su izvan tog raspona.

Morfologija bodlji – bodlje su klasificirane u tri vrste na temelju duljine kralježnice (L), promjera glave (Dh) i promjera vrata (Dn). Zdepaste bodlje – Dn=L, Tanke bodlje – L > Dn i Dh Veće ili jednako Dn, Gljive bodlje – Dh Veće ili jednake 2Dn, Proširene gljive bodlje – Dh Veće ili jednake 2Dn.Cistanche može poboljšati pamćenje.

Cistanche može poboljšati pamćenje

Priprema tkiva

Hipokampalno tkivo je ekstrahirano i brzo zamrznuto. Nakon ekstrakcije, uzorci su odmah homogenizirani u {{0}}.5 mL ledeno hladnog PBS-a s inhibitorima proteaze (Pi) (11836170001, Roche ). Kako bi se koliko god je moguće ublažio utjecaj sortiranja, samo u eksperimentima NC-RNAseq i capture-HiC, suspenzija je fiksirana s 1 posto (za NC-RNAseq/HiC) ili 2 posto (pc-HiC) paraformaldehida tijekom 10 minuta, ugašena s glicinom 2,5 M tijekom 5 minuta, i isprana dva puta s 5 mL PBS-a. Ovaj proces čuva transkripcijski i kromatinski krajolik i minimalizira pristranost sortiranja. Za ATACseq, RNAseq i capture-HiC, suspenzija je centrifugirana na 1200 g, 4 stupnja, 5 minuta, a talog je resuspendiran u 5 mL NF-1 hipotoničnog pufera (0,5 posto Triton X-100/ 0,1 M saharoza/5 mM MgCl2/1 mM EDTA/ 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, Pi). Zatim je suspenzija homogenizirana (tučak A) s 30 udaraca i tučak je ispran s dodatnih 5 mL NF-1 pufera za kombinirano ukupno 10 mL. Suspenzije su skupljene u stožastu epruvetu od 15 mL, filtrirane s mrežastim filtrom od 70 μm (08–771-2, Falcon) i inkubirane na ledu 30 minuta. Peletirane jezgre (sve centrifuge su bile na 4 stupnja, 1600 x g tijekom 15 minuta) resuspendirane su u 10 mL PBS plus 1 posto BSA plus Pi i inkubirane na ledu 1 sat. Jezgre su centrifugirane, a talog resuspendiran u 1 mL PBST plus 1 posto BSA plus Pi i inkubiran s primarnim antitijelima NeuN, Arc i GFP preko noći na 4 stupnja. Nevezana antitijela isprana su dva puta s 5 mL PBS-a i konačno resuspendirana u 1 mL PBS-a plus 1 posto BSA plus Pi i sekundarna antitijela tijekom 2-4 h na 4 stupnja. Nakon dva ispiranja, jezgre su resuspendirane u 0,5 mL (PBS plus 1 posto BSA plus Pi) i filtrirane s filterom od 40 μm mesh za FACS sortiranje. 4′,6-Diamidin-2′-fenilindol dihidroklorid (DAPI) dodan je izravno u FACS epruvete (1:5000, 10236276001, Sigma-Aldrich). Cistanche se može poboljšatimemorija.

Protočna citometrija

Za protočnu citometriju, jezgre su prvo usmjeravane korištenjem parametara područja pulsa raspršenog naprijed i sa strane (FSC-A i SSC-A) isključujući krhotine, nakon čega je uslijedilo isključivanje agregata korištenjem širine pulsa (FSC-W i SSC-W). Zatim je upotrijebljeno izotipsko kontrolno bojenje za postavljanje NEUN plus, ARC plus i GFP plus vrata. Kako bi se osigurala homogena neuronska populacija, NeuN plus populacija je usmjerena prije usmjeravanja populacija na temelju ARC plus i GFP plus fluorescencije. Razvrstali smo četiri različite populacije iz tri različite vremenske točke; Otprilike 1,5–2 sata nakon izlaganja FS i) NeuN plus /GFP plus ii) NeuN plus /GFP-. Nakon pet dana, u nedostatku pronalaska, prikupili smo iii) NeuN plus /GFP plus. U drugoj kohorti, miševi su ponovno bili izloženi uvjetovanom podražaju. 1,5–2 sata nakon ponovnog izlaganja prikupili smo iv) NeuN plus /ARC plus /GFP plus. Sve jezgre su razvrstane u Eppendorfove epruvete od 1,5 mL koje sadrže; 500 ul PBS plus 1 posto BSA plus Pi za ATCAseq, 200 ul pufera za probavu (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit za FFPE, kat. AM1975, Invitrogen) za RNAseq, 500 ul svježe ledeno hladne lize pufer (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 posto Igepal CA-630, Pi i voda stupnja PCR) za Hi-C/hvatanje-HiC. Analiza podataka provedena je s Flowjo (v10).

ChIP-qPCR

Odmah nakon sljedećeg sortiranja, 10,000 stanica je peletirano na 4 stupnja, 1600 × g tijekom 15 minuta, i resuspendirano u SDS puferu za lizu. ChIP je proveden na temelju uputa proizvođača za komplet ChIP-IT High Sensitivity® (HS) (kataloški br. 53040, Active Motif, SAD) koristeći anti-H3K4me1 (Abcam, ab8895, 1:100) i anti-H3K27ac (Abcam, ab4729, 1:100) antitijela. ChIP testovi izvedeni su u Bio-Rad CFX96 connect PCR jedinici u stvarnom vremenu koristeći SsoFast™ EvaGreen® qPCR mješavinu reagensa (Bio-Rad, 172-5202). Uzorci su ispitani u triplikatu i rezultati su normalizirani prema ulazu. Sekvence parova početnica za ChIP–qPCR testove navedene su u Dodatnoj tablici 12.

Cistanche može poboljšati pamćenje

ATAC-seq

priprema knjižnica— Biblioteke ATAC seq pripremljene su kao što je prethodno opisano u 49 s manjim izmjenama. 10,000 stanica iz svake skupine, izvučeno je iz 8-10 različitih miševa i smatrano je N=1. Za pripremu knjižnice korištena su 3–4 biološka ponavljanja (N=3–4). Odmah nakon sljedećeg sortiranja, stanice su centrifugirane (4 stupnja, 1600 × g tijekom 15 minuta) i resuspendirane u svježem puferu za lizu od 50 ul (0,15 posto NP-40 umjesto Igpala) i ljuljane na ledu 10 minuta . Zatim je provedena reakcija segmentacije (Nextera DNA sample prep kit 24 reakcije, FC-121–1030, Illumina) u volumenu od 25 ul (12,5 ul TD, 1,25 ul TDE1, 11,25 ul vode bez nukleaze), tijekom 30 min na 37c uz lagano ljuljanje. Povećani fragmenti DNK umnoženi su i barkodirani pomoću PCR reakcije (1 ciklus; 5 min – 72c, 30 s – 98c, 10 ciklusa; 15 s – 98c, 30 s – 60c, 3 min – 72c). Slijedeći protokol proizvođača, amplificirana DNK očišćena je i pročišćena pomoću 1,8x AMPure kuglica (AmpureXP kuglice, Beckman Coulter, A63880). Nakon bioanalizatora QC za veličinu i distribuciju biblioteke, biblioteke su sekvencirane na platformi Illumina Nextseq 550 u MIT BioMicro Centru. Cistanche može poboljšati pamćenje.

ATAC-seq analiza—neobrađeni fastq podaci 40-bp očitavanja sekvenciranja uparenog kraja usklađeni su s referentnim genomom miša mm9 pomoću Bowtie 2.0 u načinu uparenog kraja50. Zbirka Samtools51 korištena je za sortiranje, uklanjanje PCR duplikata (crveno gore), indeksiranje BAM datoteka (indeks) i izračunavanje statistike knjižnice (flagstat, vidi dodatnu tablicu 13). Datoteke BAM smanjene su s ispravno poravnatih, uparenih i jedinstvenih očitavanja na 50M. Otvoreni vrhovi kromatina analizirani su pomoću softvera MACS252 Diferencijalno dostupne regije (DARs) identificirane su pomoću Diffbind v1.16.353 sa zadanim parametrima i postavkama za korištenje DESeq2 (cutoff; FDR < 0,01;="" fold="" changes=""> 1,5). Punu matricu normaliziranih brojača (RPKM54) dohvatio je paket DiffBind. Za generaciju velikih staza, pileup signalne datoteke (fragment pileup po milijun čitanja) u biografskom formatu konstruirane su korištenjem MACS2 funkcije vršnog poziva s oznakama -B –SPMR. Zatim je generirano normalizirano obogaćivanje nabora (FE) preko ulaznih lambda tragova upotrebom bdgcmp funkcije MACS2 s postavkom - m FE. Zatim su bedGraph datoteke pretvorene u bigwig format. Cistanche može poboljšati pamćenje

Za vizualizaciju bigwig datoteka korišteni su IGV55 alati. ChromHMM56 korišten je za uspostavljanje modela stanja kromatina iz dvije neovisne studije koje su koristile masovno tkivo hipokampusa prije i nakon šoka stopala21,22 i za određivanje ponuda obogaćivanja nabora u odnosu na model stanja. Analiza obogaćivanja motiva57,58 i označavanje vrhova provedeni su pomoću HOMER59 alata. Svi kodovi dostupni su u dodatnoj softverskoj datoteci