Dio 2: Proteinurska kronična bolest bubrega povezana je s promijenjenim životnim vijekom, deformabilnošću i metabolizmom crvenih krvnih stanica

Kliknite za 1. dioOVDJE.

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Ozljeda bubrega izazvana doksorubicinom mijenja životni vijek mišjih crvenih krvnih zrnaca, morfologiju i biofizička svojstva

Dvadeset dana nakon indukcije DIN-a, što se podudara s razvojem smanjenograd bubrega(Slika 1b), fluorescentna boja 5(6)-CFDA, SE,24 koja se brzo apsorbira u eritrocite, ubrizgana je iv kako bi se ispitala brzina uklanjanja eritrocita u navedenim vremenskim točkama in vivo. Reprezentativni histogrami, prikazani na slici 4a, pokazuju uklanjanje obilježenih eritrocita iz cirkulacije i zamjenu neobilježenim eritrocitima. Povećani gubitak crvenih krvnih zrnaca bio je očit već 3 dana nakon primjene boje, a uklanjanje crvenih krvnih zrnaca bilo je značajno brže u 129S1/SvImJ miševa s DIN-om do 37. dana. 41. dana, z17 posto više crvenih krvnih zrnaca uklonjeno je iz cirkulacije kod ovih miševa u usporedbi sa zdravim miševima (Slika 4b).

Cistanchepoboljšatirad bubregaikoristibubrega

Slike uzete iz krvnog razmaza otkrile su morfološke promjene u eritrocitima izvučene iz 129S1/SvImJ miševa s DIN (Slika 4c) i Nphs2Dipod miševa (Dodatna slika S4A). U zdravih miševa, eritrociti imaju oblik bikonkavnog diska. U 129S1/SvImJ miševa s DIN-om primijetili smo povećani broj stomatocita (crvene zvjezdice), stanica u obliku suze (crni trokut), šistocita (crne točke) i mikrocitnih stanica (crna strelica) (Slika 4c). Nphs2Dipod miševi pokazali su povećan udio šistocita (crne točke, dopunska slika S4A, donja slika, lijeva strana), a stanice su bile polikromatske (dodatna slika S4A, donja slika, desna strana).

Kako bi se dalje istražile funkcionalne promjene crvenih krvnih zrnaca, mjerenja deformabilnosti 30. dana provedena su pomoću ektacitometrije.³²Deformabilnost crvenih krvnih zrnaca značajno je smanjena u 129S1/SvImJ miševa s DIN-om, kao i u Nphs2Dipod miševa, kao što je naznačeno smanjenim maksimalnim indeksom istezanja (EImax) (Slika 4d i Dodatna slika S4B). Smično naprezanje za 50 posto (SS1/2) od EImax (Slika 4e) i, prema tome, SS1/2 EImax omjer (Slika 4f) značajno su povećani u 129S1/SvImJ miševa s DIN-om, što ukazuje na čvršće eritrocite. SS1/2 od EImax bio je sličan u Nphs2Dipod miševa (dodatna slika S4C). SS1/2 EImax omjer imao je tendenciju povećanja u Nphs2Dipod miševa u usporedbi sa zdravim C57BL/6 miševima; razlika, međutim, nije dosegla statističku značajnost (P=0,06) (dodatna slika S4D).

Budući da izloženost eritrocita hipertoničnim izvanstaničnim stanjima in vitro oponaša osmotsko okruženje koje se nalazi u srži bubrega, kozmos se može izvesti 30. dana i određeno je nekoliko osmosenzitivnih parametara, kao što je prethodno opisano.³³ Omin predstavlja osmolarnost pri minimalnoj deformabilnosti eritrocita, iznad koje bi eritrociti lizirali s daljnjim smanjenjem osmolarnosti. Vrijednosti Omin bile su veće u 129S1/SvImJ miševa s DIN-om i pomaknute udesno (Slika 5a i d). Slična tendencija prema većem Omin-u primijećena je kod Nphs2Dipod miševa (dodatna slika S4E). Vrijednosti Ohypera, koje odražavaju stanje hidratacije stanica, bile su značajno više u 129S1/SvImJ miševa s DIN (Slika 5b), ali su bile slične u Nphs2Dipod miševa i njihovih kontrolnih miševa (Dodatna slika S4F). Maksimalna deformabilnost (EImax) pri izotoničnosti je točka u kojoj su stanice postigle maksimalnu eliptičnost. EImax pri izotoničnosti bio je značajno smanjen u 129S1/SvImJ miševa s DIN (Slika 5c), ali nije pokazao razlike u Nphs2Dipod miševima u usporedbi sa zdravim C57BL/6 miševima (Dodatna slika S4G). Sve u svemu, ovi rezultati ukazuju na smanjeni integritet i elastičnost membrane, ali i na promjene oblika kod 129S1/SvImJ i Nphs2Dipod miševa, kao i veću osmotsku krhkost crvenih krvnih zrnaca iz 129S1/SvImJ miševa s DIN.

RBC se metabolički reprogramiraju tijekom proteinurične bolesti bubrega kod miševa

Kako bi se bolje razumjele molekularne prilagodbe povezane s promjenama u obilju i morfologiji crvenih krvnih zrnaca kao funkciji oštećenja bubrega, eritrociti iz 129S1/SvImJ miševa s DIN i Nphs2Dipod miševima analizirani su metabolomikom temeljenom na spektrometriji mase (Slika 6a i Dodatna slika S5A). Koristeći ovaj pristup, relativne razine 256 metabolita određene su za 129S1/SvImJ miševe i Nphs2Dipod miševe. Kako bi se ovi podaci analizirali na sustavan način, provedene su analize više varijacija, uključujući diskriminantnu analizu parcijalnih najmanjih kvadrata i analizu hijerarhijskog klasteriranja. Zanimljivo je da je diskriminantna analiza djelomičnih najmanjih kvadrata metaboloma eritrocita iz oba modela otkrila slične obrasce grupiranja.

Točnije, iako su se uzorci u vrijeme indukcije modela grupirali zajedno sa zdravim uzorcima iz svih vremenskih točaka, uzorci nefrotičnih miševa grupirali su se neovisno o zdravim kontrolnim uzorcima zajedno s komponentom 1 (Slika 6b i Dodatna slika S5B). U skladu s obrascima grupiranja vidljivim u 2 modela, hijerarhijska analiza klasteriranja metabolomičkih podataka za svaki model istaknula je slične trendove za metabolite uključene u upravljanje oksidativnim stresom, kao i nukleotide, aminokiseline, acilkarnitine i masne kiseline (Slika 6c i dodatne slike S5C, S6 i S7). Na primjer, razine alantoina, purinskog katabolita i markera oksidativnog stresa u eritrocitima,³⁴ i smanjeni glutation oba su se značajno akumulirala tijekom vremena u oba modela nefrotičnih miševa, što ukazuje na kontinuirano stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta i aktivaciju antioksidativnog glutationskog sustava (Slika 6d i Dodatna slika S5D). Isto tako, razine prekursora koenzima A (CoA) pantotenata akumulirale su se tijekom vremena (Slika 6e i Dodatna slika S5E).

Slični uzorci bili su očiti u razinama slobodnih masnih kiselina heksadecenske kiseline (C16:1), oktadecenske kiseline (C18:1) i dokozapentaenske kiseline (C22:5), iako je svaki model imao jedinstvene vremenske uzorke (Slika 6f i Dodatna slika S5F).

Osim masnih kiselina, acilkarnitini, uključujući hidroksioktanoil-karnitin (AC C8-OH), hidroksidekanoil-karnitin (AC C10-OH) i dodekanoil-karnitin (AC C12:1), također su reagirali na indukciju proteinurijske nefropatije u oba modela (Slika 6g i Dodatna slika S5G).

Uzeti zajedno, ovi nalazi sugeriraju da kod indukcije proteinurbolest bubregau 2 slična mišja modela, povećane razine oksidativnog stresa mogu oštetiti acilne lance na lipidima membrane. Budući da su eritrociti lišeni sposobnosti sintetiziranja novih lipida, oni koriste sustav koji ovisi o uklanjanju oštećenih acilnih lanaca posredovanim fosfolipazom i zamjeni neoštećenim masnim kiselinama. Nazvan Landsov ciklus,35 ovaj sustav ovisi o aktivaciji acilnog lanca konjugacijom na CoA, što uspostavlja ravnotežu s acilkarnitinom za zamjenu membrane36 (Slika 6h i Dodatna slika S5H).

Pacijenti s proteinuričnim CKD-om i anemijom pokazuju pojačanu smrt crvenih krvnih zrnaca

To confirm that PS-exposing RBCs occur also in human CKD, as described earlier,37 we analyzed blood samples from 25 patients treated by our outpatient clinic. To match the mouse models that represent nephrotic syndrome with preserved GFR during the first 10 days, and then advanced CKD with reduced GFR from day 20 onwards (Figure 1 and Supplementary Figure S2), we analyzed 10 patients with primary nephrotic syndrome representing proteinuric CKD with preserved GFR (>60 ml/min po 1,73 m2) i 15 bolesnika s KBB s proteinurijom nefrotskog raspona i GFR<60 ml/min="" per="" 1.73="">². Karakteristike bolesnika prikazane su u tablici 1. Anemija povezana s bolešću bubrega, definirana koncentracijom hemoglobina<13.5 g/dl="" in="" men="" and=""><12 g/dl="" in="" women,="" was="" observed="" in="" 4="" of="" the="" 10="" primary="" nephrotic="" patients="" (red="" triangles="" in="" figure="" 7),="" whereas="" 14="" of="" 15="" ckd="" patients="" with="" nephrotic-range="" proteinuria="" and="" reduced="" gfr="" were="" anemic="" (figure="" 7a).="" in="" the="" latter="" group,="" plasma="" epo="" concentrations="" and="" reticulocyte="" production="" index="" were="" not="" increased="" (figure="" 7b="" and="" c),="" consistent="" with="" reduced="" erythropoiesis.="" in="" fluorescence-activated="" cell="" sorting="" analysis,="" primary="" nephrotic="" patients="" and="" patients="" with="" advanced="" ckd="" had="" a="" higher="" rate="" of="" ps-exposing="" cells="" (mean,="" 1.0%="" 0.3%="" and="" 1.4%="" 0.7%,="" respectively)="" compared="" with="" healthy="" subjects="" (mean,="" 0.6%="" 0.1%;="" figure="" 7d).="" rbc="" cell="" death="" in="" patients="" with="" primary="" nephrotic="" syndrome="" and="" advanced="" ckd="" was="" triggered="" by="" higher="" levels="" of="" reactive="" oxygen="" species="" (figure="" 7e)="" and="" increased="" ceramide="" levels="" (figure="" 7f).="" augmented="" intracellular="" calcium="" concentration="" was="" found="" in="" patients="" with="" advanced="" ckd="" (figure="">

Ljudski eritrociti pacijenata s primarnim nefrotskim sindromom i uznapredovalim CKD-om pokazali su morfološke promjene, kao što je primijećeno na modelima miševa (slike 4c i 7j–l i dodatna slika S4A). Iako je morfologija crvenih krvnih zrnaca bila normalna u kontrolama, anemični bolesnici s primarnim nefrotskim sindromom i bolesnici s uznapredovalom kroničnom bubrežnom bolesti imali su povećan broj suznih stanica (crni trokuti) i ehinocita (crni križevi) (Slika 7k i l). Osim toga, ciljne stanice pojavile su se u primarnih nefrotskih bolesnika s anemijom i u bolesnika s uznapredovalom KBB (crveni križići; slika 7k i l). Sve skupine pacijenata, uključujući primarne nefrotične bolesnike bez anemije, imale su povećan udio sferocita (plave strelice; Slika 7j–l). Kako bi se analizirala deformabilnost ljudskih eritrocita, provedena je ektacitometrija. U usporedbi sa zdravim kontrolama, maksimalna deformabilnost (EImax) bila je smanjena u bolesnika s uznapredovalom KBB (Slika 7h); EImax imao je tendenciju nižeg u bolesnika s primarnim nefrotskim sindromom bez postizanja statističke značajnosti (Slika 7h). Parametri SS1/2, Omin, Ohyper i EImax pri izotoničnosti nisu se značajno razlikovali između zdravih kontrola, pacijenata s primarnom nefrotijom i pacijenata s uznapredovalim CKD-om (dodatna slika S8A-D).

Cistanche koristibubrege i pomoć kod CKD.

RASPRAVA

Ova studija otkriva nove patofiziološke mehanizme koji dovode do anemije povezane s bolešću bubrega u 2 mišja modela proteinurijskebolest bubregas teško oštećenimrad bubrega. Naša studija pokazuje da je u ovim modelima anemija rezultat smanjenog životnog vijeka eritrocita izazvanog izlaganjem PS-u i ubrzanom fagocitnom klirensu. Intrigantno je da se anemija kod ovih miševa razvila unatoč stimuliranoj eritropoezi, što sugerira da bi smanjeni životni vijek eritrocita, kroz povećanu smrt eritrocita, moglo biti alternativno objašnjenje za ove nalaze. Za razliku od bolesnika s kroničnom bubrežnom bolesti i anemijom (Slika 77), oba mišja modela karakterizirana su povećanom koncentracijom EPO u plazmi. To se može pretpostaviti očuvanjem sposobnosti izlučivanja EPO-a u ovim modelima koji vjerojatno štede stanice koje izlučuju EPO smještene u intersticiju bubrega. Povećano izlučivanje EPO u ovim modelima, međutim, ne poništava zaključak da je smrt eritrocita glavni igrač u patogenezi anemije povezane s bolešću bubrega. Naprotiv, stimulacija eritropoeze povećanim izlučivanjem EPO može se smatrati kompenzacijskim mehanizmom za povećanu smrt eritrocita izazvanuzatajenja bubregau ovim modelima. U skladu s tim, povećana ekstramedularna eritropoeza s povećanim volumenom slezene nedavno je primijećena u drugom modelu proteinuričnih miševa s anemijom.³⁸

U bolesnika s proteinuričnom kroničnom bubrežnom bolesti i popratnom anemijom, također smo primijetili povećani postotak eritrocita koji su izloženi PS-u zajedno s višim razinama reaktivnih kisikovih vrsta i ceramida. Ovo sugerira da bi ubrzana smrt crvenih krvnih zrnaca mogla biti uključena u patogenezu anemije povezane s bolešću bubrega kod KBB-a kod ljudi. Koncentracije EPO u plazmi i indeks proizvodnje retikulocita nisu bili povećani u anemičnih bolesnika s kroničnom bubrežnom bolesti, što ukazuje na smanjenu eritropoezu, za koju se očekuje da će u kombinaciji sa smrću crvenih krvnih zrnaca pogoršati anemiju povezanu s bolešću bubrega. Razlozi za gubitak lučenja EPO u bubrezima kod KBB-a kod ljudi ostaju nejasni. Zanimljivo, iako nisu svi pacijenti s normalnim GFR-om imali anemiju, svi oni sa smanjenim GFR-om bili su anemični, što ukazuje na učinak dugotrajne i uznapredovale KBB. Značajno je da se relativni deficit EPO u KBB-u može prevladati uporabom nove klase inhibitora prolil hidroksilaze,³⁹sugerirajući poremećeni senzor kisika kao mogući uzrok hiposekrecije EPO.

Cistanchepoboljšatirad bubregas i pomoć kod kronične bubrežne bolesti.

Naši podaci pokazuju smanjenu deformabilnost crvenih krvnih zrnaca u oba mišja modela proteinurijske nefropatije, što može biti izravno povezano s povišenim razinama Ca2þ u citoplazmi.⁴⁰ Zajedno, ovi mehanizmi mogu djelovati usklađeno kako bi olakšali indukciju stanične smrti eritrocita i uklanjanje starih i ozlijeđenih eritrocita iz krvotoka.¹⁵Nadalje, promatrali smo metaboličko reprogramiranje u tim stanicama, što ukazuje na oksidativni stres i remodeliranje membranskih lipida. Iako CoA i acil-CoA nisu izravno izmjereni u ovim uzorcima, oni se aktivno pretvaraju u eritrocite u acilkarnitine pomoću karnitin palmitoil transferaze.³⁶Akumulirane razine potonje klase spojeva ukazuju na aktivaciju ovih mehanizama u nefropatiji, jer se ti metaboliti ne prenose lako kroz membrane crvenih krvnih zrnaca.⁴¹ Kao dodatnu potporu, uočili smo nakupljanje u oba modela prekursora CoA, uključujući pantotenat, koji je preuzet⁴²i metabolizirani⁴³eritrocitima, paralelno s povećanjem slobodnih masnih kiselina i smanjenjem slobodnog karnitina. Zanimljivo je da smo prethodno otkrili da se te promjene događaju u vezi sa suprafiziološkim razinama intracelularnog Ca2þ.¹⁶Iako su ti rezultati generirani ex vivo, ovdje izvješćujemo o sličnim odgovorima in vivo. Nadalje, acilkarnitini mogu izravno modulirati svojstva membrane⁴⁴i koreliraju s deformabilnošću eritrocita^,45, kao i osmotska i oksidativna hemoliza.⁴⁶Nekonjugirani slobodni karnitin, potiče deformabilnost membrane posredstvom interakcija između membranskih proteina.⁴⁷ Naša opažanja značajno smanjenih razina karnitina u eritrocitima miševa s nefropatijom, vjerojatno zbog povećane potrošnje za stvaranje acilkarnitina, mogu pridonijeti smanjenim reološkim parametrima koje smo promatrali paralelno.

Naša otkrića upućuju na uobičajene mehanizme koji dovode do smrti crvenih krvnih zrnaca u miševa s nedostatkom DIN-a i podocina, što može biti povezano s proteinurijom nefrotskog raspona i, što je još važnije, razvojem teškihzatajenja bubregau mišjim modelima promatranim od 20. dana nadalje. Kod ljudi je uznapredovala KBB sa smanjenom GFR jak prediktor anemije,⁴⁸a stimulacija smrti eritrocita mogla bi biti povezana s uremičnim miljeom. Mora se priznati da u uznapredovaloj kroničnoj bubrežnoj bolesti mnogi čimbenici i poremećaji mogu doći u igru ​​i promicati anemiju povezanu s bolešću bubrega. Doprinos jake proteinurije stimulaciji smrti eritrocita ostaje nejasan, ali, iako nije dokazan, može uključivati ​​čimbenike koji se gube urinom, poput transferina ili drugih koji reguliraju metabolizam eritrocita.⁴⁹Dosadašnje liječenje anemije povezane s bolešću bubrega usredotočeno je na povećanje eritropoeze supstitucijom željeza ili EPO-a,⁵⁰primjenom oralnih stabilizatora proteina čimbenika inducibilnog hipoksije,⁵¹ili oralnom ili iv primjenom željeza.⁵²Međutim, ovi tretmani ne uzimaju u obzir povećanje smrti crvenih krvnih zrnaca. U prethodnoj presječnoj studiji u bolesnika na hemodijalizi i peritonealnoj dijalizi, otkrili smo da su pacijenti s višim postotkom eritrocita izloženih PS-u liječeni višim dozama EPO.¹⁴ Stoga, ublažavanje smrti eritrocita obećava mogući terapijski pristup u liječenju anemije povezane s bolešću bubrega. U tom kontekstu, inhibicijski učinak različitih farmakoloških sredstava na smrt RBC stanica53 zahtijeva daljnje studije na ljudima i životinjama.

U zaključku, promijenjeni stanični metabolizam pridonosi disfunkciji crvenih krvnih zrnaca, pojačanoj smrti crvenih krvnih zrnaca, a time i anemiji u mišjim modelima proteinurijske KBB, unatoč povećanim razinama EPO u serumu. Nalazi ove studije mogu djelomično objasniti mehanizme anemije povezane s CKD-om kod ljudi.

Cistanche koristifunkcije bubrega i pomoć kod kronične bubrežne bolesti.

RAZOTKRIVANJE

Iako nisu povezani sa sadržajem članaka, ADA i TN su osnivači Omix Technologies, Inc. Svi ostali autori izjavili su da nemaju suprotstavljenih interesa.

IZJAVA PODATAKA

Podaci će biti dostupni na razuman zahtjev.

ZAHVALA

Autori zahvaljuju Andrei Janessi na stručnoj tehničkoj pomoći. Ove su studije podržane donacijom Njemačke istraživačke zaklade za RB (BI 2149/2-1) i FA (AR 1092/2-2). LS je dobio potporu Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) od strane medicinskog fakulteta Sveučilišta u Tübingenu. SMQ je podržan resursima Kanadske krvne službe. Kao uvjet za financiranje od strane kanadske vlade, ovo izvješće mora sadržavati izjavu "Ovdje izražena stajališta ne predstavljaju nužno gledište federalne vlade Kanade."

AUTORSKI PRILOZI

RB i FA izradili su studiju. Prikupljanje podataka vršili su RB, TN, MG, TD, DE, MW, LS, MX, JMB, MZK, KO, LK, IG-M i BF.

Statističke analize proveli su RB, TN, MG, TD, LS, JMB, LK, IG-M i ADh; a brojke su generirali RB, TN, MZK, IG-M, LQ-M, BF i ADh. RB, TN, ADA, MG, BNB, LS, AS, TB, MS, ALB, FG, SMQ,

a FA je interpretirao podatke. Rukopis su napisali, recenzirali i uredili RB, TN, ADA, MG, BNB, TB, ALB, FG, SMQ i FA.

DOPUNSKI MATERIJAL

Dodatna datoteka (PDF)

Dopunski materijali i metode.

Slika S1. Eksperimentalni dizajn studija na 129S1/SvImJ i Nphs2Dipod miševima.

Slika S2. Brisanje ekspresije podocina i obilježja nefrotskog sindroma u Nphs2Dipod miševa.

Slika S3. Smanjena stopa preživljavanja crvenih krvnih stanica u eksperimentalnom nefrotskom sindromu u Nphs2Dipod miševa.

Slika S4. Promijenjena morfologija i smanjena deformabilnost crvenih krvnih stanica u Nphs2Dipod miševa.

Slika S5. Metabolomika ukazuje na nakupljanje oksidativnog stresa i aktivaciju remodeliranja membranskih lipida unutar crvenih krvnih stanica u Nphs2Dipod miševa.

Slika S6. Metabolomika ukazuje na izmijenjeni metabolizam unutar crvenih krvnih stanica dobivenih od 129S1/SvImJ miševa.

Slika S7. Metabolomika ukazuje na izmijenjeni metabolizam unutar crvenih krvnih zrnaca primljenih od Nphs2Dipod miševa.

Slika S8. Smični stres na polovici maksimalne deformabilnosti crvenih krvnih zrnaca (RBC) i osmotska osjetljivost eritrocita ne razlikuju se značajno u primarnog nefrotskog sindroma i uznapredovalih bolesnika s kroničnom bubrežnom bolešću (CKD).

REFERENCE

1. Finkelstein FO, Story K, Firanek C, et al. Kvaliteta života povezana sa zdravljem i razina hemoglobina u bolesnika s kroničnom bubrežnom bolešću. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4:33-38.

2. Efstratiadis G, Konstantinou D, Chytas I, et al. Sindrom kardiorenalne anemije. Hipokratije. 2008;12:11-16.

3. Staples AO, Wong CS, Smith JM, et al. Anemija i rizik od hospitalizacije u pedijatrijskoj kroničnoj bubrežnoj bolesti. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4: 48–56.

4. Kurella Tamura M, Vittinghoff E, Yang J, et al. Anemija i rizik od kognitivnog pada kod kronične bubrežne bolesti. BMC Nephrol. 2016;17:13.

5. Toft G, Heide-Jørgensen U, van Haalen H, et al. Anemija i klinički ishodi u bolesnika s teškom kroničnom bubrežnom bolešću koja nije ovisna ili o dijalizi: danska populacijska studija. J Nephrol. 2020;33:147-156.

6. Geddes CC. Patofiziologija renalne anemije. Nephrol Dial transplantacija. 2018;34:921-922.

7. Artunc F, Risler T. Koncentracije eritropoetina u serumu i odgovori na anemiju u bolesnika s ili bez kronične bubrežne bolesti. Nephrol Dial transplantacija. 2007;22:2900-2908.

8. Erslev AJ, Besarab A. Eritropoetin u patogenezi i liječenju anemije kroničnog zatajenja bubrega. Kidney Int. 1997;51:622-630.

9. Wish JB, Aronoff GR, Bacon BR, et al. Pozitivna ravnoteža željeza kod kronične bolesti bubrega: koliko je previše i kako prepoznati? Am J Nephrol. 2018;47:72–83.

Howard RL, Buddington B, Alfrey AC. Urinarni albumin, transferin i izlučivanje željeza u bolesnika s dijabetesom. Kidney Int. 1991;40:923-926.

I tako dalje.