Dio 2: Identifikacija dopaminergičkih neurona koji mogu uspostaviti asocijativno pamćenje i akutno prekinuti njegovo bihevioralno izražavanje

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Analiza dendrograma. Dendrogrami neurona su 2D skice 3D rekonstrukcija neurona iz Eichlera et al. (2017). Kao "linearizirane", spljoštene verzije morfološki složenih neurona, dendrogrami su kompaktne vizualizacije koje služe za prikaz prostorne distribucije sinapsi. Pojedinosti algoritma za crtanje dendrograma opisali su Strauch i sur. (2018). Ukratko, dendrogrami su topološki ispravne skice neurona s dominantnom primarnom granom nacrtanom kao ravna linija, i kraćim bočnim granama savijenim pod stereotipnim kutovima i usmjerenim prema gore i dolje naizmjenično kako bi se izbjeglo preklapanje. Crtaju se tako da su duljine kabela i položaji sinapsi približno točni. Male izmjene za poboljšanje čitljivosti uključuju automatsko preuređivanje simbola sinapse kako bi se riješio nered i preklapanje (Strauch et al., 2018).

Za analizu sinaptičke organizacije, izračunali smo matricu udaljenosti (sinapse) koja sadrži geodetske udaljenosti (tj. udaljenost kao "duljina kabela" duž neurona) između lokacija svih sinapsi na neuronu. Geodetske udaljenosti izračunate su kao euklidske udaljenosti u 3D koordinatama rekonstruiranog neurona prelaskom duž neuronskih grana. Lokacije sinapsi grupirali smo klasteriranjem divizivne analize (DIANA) (Kaufman, 2005.) koja djeluje na matrici geodetske udaljenosti. Na temelju analize rezultata siluete, postavili smo broj klastera po neuronu na 10. Klasteri koji nisu sadržavali sve četiri klase sinapsi od interesa (KC!DAN-i1, DAN-i1!KC, DAN-i1!MBON-i1 lijevo, DAN-i1!MBON-i1 desno) uklonjeni su iz analize. Za svaki klaster, središnja točka definirana je kao najsredišnja sinapsa klastera kako je određeno dijeljenjem oko klastera medoida (PAM s k=1 klasterom) (Kaufman, 2005.) na temelju geodetskih udaljenosti sinapsi unutar klastera. Na kraju smo odredili geodetske udaljenosti između svih sinapsi i središnje točke klastera.

Cistanche može poboljšati pamćenje

Dizajn eksperimenta i statistička analiza. Korišteni su dvostrani neparametarski testovi, a statističke pretpostavke za te testove ispunjene su u cijelosti. Kada su višestruke usporedbe obavljene unutar jedne analize, primijenjena je Bonferroni-Holmova korekcija kako bi se stopa pogreške u cijelom eksperimentu zadržala na 5 posto (Holm, 1979.). Svi provedeni statistički testovi i njihovi rezultati prikazani su u Proširenim podacima na slici 1-1 zajedno s izvornim podacima.

Za sve eksperimente ponašanja, vrijednosti su uspoređivane u više skupina s Kruskal-Wallisovim testovima. U slučaju značajnosti, naknadne usporedbe parova koristile su Mann–Whitney U testove. Kako bi se provjerilo razlikuju li se vrijednosti određene skupine od nule, korišteni su predznakovni testovi s jednim uzorkom.

Eksperimenti na slikama 1, 6C–F i 8 slijedili su dizajn dvije skupine, uspoređujući dva uvjeta testiranja za eksperimentalni genotip. Obje skupine uspoređene su Mann–Whitneyjevim U testom, a njihova značajnost od nule testirana je testovima znaka jednog uzorka.

Eksperimenti na slikama 6A, B slijedili su dizajn od šest grupa, s tri genotipa (eksperimentalni genotip koji izražava ChR2-XXL, pokretač i efektorska kontrola) i dva testna uvjeta. Prvo je u svim skupinama proveden Kruskal-Wallisov test. U slučaju značajnosti, proveli smo parove Mann-Whitney U-testova između eksperimentalnog genotipa i svake od genetskih kontrola istog testnog uvjeta, kao i između testnih uvjeta za eksperimentalni genotip (ukupno pet Mann-Whitney U testova) . Svaka grupa je testirana na svoju značajnost od nule testovima znaka jednog uzorka.

Eksperimenti na slici 7 slijedili su dizajn tri skupine sa životinjama eksperimentalnog genotipa koje izražavaju ChR2-XXL. Nakon početnog Kruskal-Wallisovog testa u svim skupinama, proveli smo Mann-Whitney U testove u paru za skupinu bez izlaganja plavom svjetlu nakon treninga i obje druge skupine. Za svaku skupinu testirana je značajnost od nule (testovi znaka s jednim uzorkom).

Eksperimenti na slikama 9 i 10 slijedili su dizajn od četiri skupine sa životinjama eksperimentalnog genotipa s ekspresijom ChR2-XXL. Nakon početnog Kruskal-Wallisovog testa u svim skupinama, proveli smo uparene Mann-Whitneyeve U testove između grupa koje su imale trening u paru i bez para unutar istog testnog uvjeta i između testnih uvjeta za danu vrstu treninga (ukupno četiri Mann-Whitneyjeva treninga U testovi). Nisu provedeni testovi znakova s ​​jednim uzorkom.

Podatke o ponašanju predstavljamo kao kutijaste dijagrame s medijanom kao srednjom linijom i 25 posto/75 posto i 10 posto/90 posto kao granicama okvira odnosno brkovima. Outlieri se ne prikazuju. Eksperimentatori nisu bili svjesni genotipa i glede odsutnosti ili prisutnosti nagrade šećerom tijekom testa prisjećanja, ako je primjenjivo. Veličine uzoraka (biološke replikacije) odabrane su na temelju prethodnih studija koje su otkrile veličine umjerenog do blagog učinka (Paisios i sur., 2017.; Saumweber i sur., 2018.) i prikazane su u legendama slika. Veličina uzorka od n =1 uključivala je; 20 životinja oba spola za sve eksperimente s urođenim preferencijama i 2 20 životinja (20 za svaku recipročno treniranu skupinu) oba spola za sve eksperimente učenja.

Kako bismo usporedili brojeve sinapsi između ipsilateralne i kontralateralne strane neurona MBON-i1 (vidi sliku 3A), testirali smo njihovu distribuciju koristeći x2 testove, odvojeno za sinapse KC!MBON-i1 i sinapse DAN-i1!MBON-i1. Kako bismo usporedili udaljenosti sinapsi od središta njihove dotične središnje-okružne strukture na DAN-i1 neuronu (vidi sliku 4C, D), proveli smo Kruskal-Wallis testove za sve tipove sinapsi, kao i Mann-Whitney U u paru testovi između svih tipova sinapsi (ukupno 6 Mann–Whitney U-testova), posebno za lijevi i desni DAN-i1 neuron.

Rezultati

Prostorni raspored sinapsi u DAN-KC-MBON matrici

Nedavna elektronska mikroskopska rekonstrukcija kompletnog kruga tijela gljive larve omogućila je povezivanje DAN-ova, KC-ova i MBON-ova na temelju broja kemijskih sinapsi između njih (Eichler et al., 2017.). Aksonske grane

Slika 3. Organizacija sinaptičkih ulaza u neuron MBON-i1. Broj KC!MBON-i1 i DAN-i1!MBON-i1 sinapsi za svaki MBON-i1 neuron, odvojenih hemisferom. Oba neurona MBON-i1 imaju više sinapsi s tim KC-ovima i taj DAN-i1 nalazi se u hemisferi kontralateralno u odnosu na tijelo njihove stanice. *Značajni x2 testovi (p, 0.05, ispravljeno prema Bonferroni-Holmu). Podaci su iz Eichlera i sur. (2017). B, Semishematski pregled distribucije sinapsi od ipsilateralne i kontralateralne hemisfere do MBON-i1. KC i oba DAN-i1 neurona tvore više sinapsi s kontralateralnim dijelom MBON-i1 nego s njegovim ipsilateralnim dijelom. C, Distribucija broja zrelih KC-ova koji tvore naznačeni broj sinapsi s lijevim ili desnim neuronom MBON-i1. KC iz lijeve hemisfere formiraju manje sinapsi s lijevim nego s desnim neuronom MBON-i1 (lijevo). KC iz desne hemisfere, nasuprot tome, tvore više sinapsi s lijevom nego s desnom MBON-i1 (desno). S obzirom da KC-ovi ne prelaze središnju liniju, sve sinapse koje je npr. desni MBON-i1 formirao s KC-ima iz lijeve hemisfere nalaze se na dijelu MBON-i1 kontralateralno u odnosu na tijelo njegove stanice. D, Unatoč činjenici da MBON-i1 neuroni primaju manje ulaznih podataka od KC-ova hemisfere ipsilateralno u odnosu na njihova stanična tijela nego iz kontralateralne hemisfere, oba MBON-i1 neurona primaju informacije o punom prostoru KC ulaza, u bilo kojoj hemisferi. Da bi se odredio odnos između MBON-i1 i senzorskog unosa projiciranog na KC-ove, ukupni unos koji MBON-i1 prima od KC-a koji zauzvrat primaju svoje podatke od uniglomerularnih olfaktornih projekcijskih neurona (PN) (bijeli i tamnosivi), multiglomerularnih olfaktornih PN (svijetlo sivi) i neolfaktorni PN (crni) uzeti su u obzir za izračun matričnog produkta odgovarajućih PN!KC i KC!MBON-i1 sinapsi. To je učinjeno odvojeno za MBON-i1 lijevo i njegove veze s desnim (tj. kontralateralnim) KC-om (gore lijevo), i onima s lijevim (tj. ipsilateralnim) KC-om (gore desno), i prema tome za MBON-i1 desno ( dno). Podaci se temelje na Eichler et al. (2017). Svi statistički testovi i njihovi rezultati navedeni su zajedno s izvornim podacima na slici proširenih podataka 1-1.

pojedinačni DAN-ovi i dendritične grane pojedinačnih MBON-ova ograničeni su i preklapaju se unutar specifičnih odjeljaka zajedno sa snopovima aksona KC (larve: Pauls et al., 2010.;

Eichler i sur., 2017.; Saumweber i sur., 2018.; Eschbach i sur., 2020.; odrasli: Aso i sur., 2014.a; Takemura i sur., 2017). DAN-i1 inervira i-odjeljak medijalnog režnja tijela gljive (koji se ponekad naziva i gornji prst medijalnog režnja). Rekonstrukcija je otkrila da ne samo da signalizira KC-ima, već zapravo ima dvije glavne mete: KC-e i MBON-i1 (Slika 2A, B) (Eichler et al., 2017). Sukladno tome, MBON-i1 ima dva glavna uzvodna partnera: KCs i DAN-i1. Slična organizacija DAN-ova i MBON-ova nalazi se u odjeljcima tijela gljiva (ličinke: Eichler et al., 2017; odrasle jedinke: Takemura et al., 2017). Konkretno, za DAN-i1, 75 posto i 21 posto njegovih izlaznih sinapsi u tijelu gljive povezuje se s KCs odnosno MBON-i1, a MBON-i1 prima; 74 posto i 14 posto svojih ulaznih sinapsi u tijelu gljive od KCs odnosno DAN-i1 (Eichler i sur., 2017.; Saumweber i sur., 2018.). Iako su takve analize na mnogo načina informativne, one ne uzimaju u obzir prostorni raspored sinapsi duž neurona. Kako bismo rasvijetlili ovaj raspored u i-odjeljku, koristimo se dendrogramima koji nam omogućuju da prikažemo složeni, 3D gestalt neurona kao 2D skicu koja bilježi njegovu strukturu grananja, čuva duljine grana i identificira lokaciju sinapse duž grana ( Strauch i sur., 2018). Takve detaljne analize premašuju rezoluciju kojom se trenutačno može manipulirati neuronima kod životinja koje se slobodno ponašaju (Aso i Rubin, 2020.). Ipak, oni nude uvid u stvarnu složenost neurona koji se proučavaju i računalne implikacije motiva sklopova čiji su dio (vidi također Bilz et al., 2020.). Iz naših analiza izdvajamo sljedeće točke (slike visoke rezolucije neurona DAN-i1 i MBON-i1 iz obje hemisfere, kao i svih zrelih KC dostupni su na slikama proširenih podataka. 2-1, 2-2 , odnosno 2-3):

• I DAN-i1 i MBON-i1 sadrže masivne međuhemisferne veze. Ovo je nevjerojatno s obzirom na to koliko se malo međuhemisfernih preslušavanja inače opaža duž uzlaznih putova, uključujući KC (Slika 2A) (Berck i sur., 2016.; Eichler i sur., 2017.; Saumweber i sur., 2018.; Thum i Gerber, 2019. ). Konkretno, oba DAN-i1 neurona recipročno su povezana s većinom zrelih KC, u obje hemisfere. Štoviše, DAN-i1 neuroni daju izlaz za oba MBON-i1 neurona, ipsilateralno i kontralateralno (Slika 2E; za slike visoke rezolucije oba DAN-i1 neurona, pogledajte Proširene podatke na slici 2-1). To implicira da svaki MBON-i1 neuron, zauzvrat, prima ulaz od oba DAN-i1 neurona, ipsilateralno i kontralateralno (Slika 2F; za slike visoke razlučivosti oba MBON-i1 neurona, pogledajte Proširene podatke Sl. {{28 }}). Isto tako, neuroni MBON-i1 primaju ulazne informacije od većine zrelih KC-ova, u obje hemisfere (Eichler et al., 2017.) i daju izlazne podatke izvan tijela gljive, također u obje hemisfere. Dendrogrami preciznije otkrivaju da su izlazi iz DAN-i1 na MBON-i1 neuron ipsilateralne i kontralateralne hemisfere isprepleteni, kao i ulazi u MBON-i1 iz DAN-i1 neurona ipsilateralne i kontralateralne hemisfere (slika 2E,F). Značajno je da MBON-i1 nije hemisferno simetričan u smislu broja sinapsi koje prima u tijelu gljive: oba MBON-i1 neurona primaju više sinapsi u hemisferi kontralateralno svojim staničnim tijelima (slike 2F, 3A, B); usprkos tome, oba neurona MBON-i1 primaju informacije o cijelom senzornom ulaznom prostoru u bilo kojoj hemisferi (sl. 3C, D).

cistanche pharma special

• Uzorci grananja i DAN-i1 i MBON-i1 strukturirani su u nekoliko glavnih regija. Za DAN-i1 mogu se identificirati tri takve glavne regije. Počevši od tijela stanice, u prvoj regiji, DAN-i1 prima podatke od svojih partnera izvan tijela gljive (označeno s 1 na slici 2C–E) (Eschbach et al., 2020), dok druga i treća regija podudaraju se s i-odjeljkom ipsilateralnog i kontralateralnog tijela gljive (označeno s 2 i 3 na sl. 2C–F). U tijelu gljive, DAN-i1 je recipročno povezan s KCs i daje izlaz prema MBON-i1. Primarni neurit MBON-i1 prelazi središnju liniju, a neuron zatim inervira i-odjeljak tijela gljive kontralateralno u odnosu na staničko tijelo (područje označeno s 3 na sl. 2C–F); ovdje uglavnom prima podatke od KC-a i DAN-i1. Zatim, MBON-i1 prelazi natrag preko središnje linije i na isti način inervira tijelo gljive ipsilateralno u odnosu na tijelo njezine stanice (područje označeno s 2 na slici 2C–F). Osim toga, MBON-i1 ima nekoliko malih grana u obje hemisfere koje se povezuju s partnerima blizu, ali neposredno izvan tijela gljive.

• Unutar ovih regija ne mogu se identificirati odjeljci nalik odjeljcima koji su prepoznatljivi u DAN-i1 i MBON-i1 neuronima obiju hemisfera (Sl. 2E, F; Slike s proširenim podacima 2-1, {{7 }}). Međutim, za DAN-i1 neurone očite su višestruke, lateralno "idiosinkratične" središnje-okružne strukture bogate sinapsama (slika 4). Prema njihovom središtu nalaze se svi gore navedeni tipovi sinapsi DAN-KC-MBON matrice, dok njihov okružuju gotovo isključivo KC!DAN sinapse (slika 4). Značajno je da svaki dati KC obično uspostavlja sve svoje sinapse u samo jednoj ili dvije od tih središnjih okružujućih struktura (Slika proširenih podataka 1-1).

• Što se tiče zrelih KC, 86 posto i 88 posto njih uspostavlja sinapse s lijevim i desnim DAN-i1 neuronom, odnosno 78 posto i 74 posto s lijevim i desnim MBON-i1 neuronom. Pojedinačni KC imaju medijane od 4 KC!DAN-i1, 4 DAN-i1!KC i 5 KC!MBON-i1 sinapsi (Eichler et al., 2017; za više detalja o DAN-i1, vidi Saumweber et al., 2018 ). Prema dendrogramima svih pojedinačnih KC, KC!DAN-i1, DAN-i1!KC i KC! Čini se da su sinapse MBON-i1 ispremiješane bez vidljivih podjela u nizu KC-ova, kao i sinapse s lijevim i desnim DAN-i1 neuronom te lijevim i desnim MBON-i1 neuronom (ExtendedDataFig.2-3).

Zajedno, ove analize otkrivaju detaljnu prostornu organizaciju DAN-KC-MBON matrice i-odjeljka. Važno je napomenuti da su sinapse DAN-i1 s njegova dva glavna cilja, KCs i MBON-i1, lokalno izmiješane unutar višestrukih struktura bogatih sinapsama duž aksonskih grana DAN-i1, umjesto da su odvojene između njih ( Slike 2E, 4; Prošireni podaci, slika 2-1). Takva bi arhitektura mogla implicirati da DAN-i1 isporučuje korelirane, a ne neovisno modulirane signale KC-ovima i MBON-i1 unutar ovih struktura bogatih sinapsama.

Aktivacija istih neurona može uspostavitimemorijai prekinuti njegov opoziv

Zaintrigirala nas je činjenica da DAN-i1 ima dvije glavne mete, naime KCs i MBON-i1; da su njegove sinapse s ove dvije mete tako blisko isprepletene; te da prirodne nagrade imaju dvije funkcije, naime da utvrđujumemorijau treningu i akutno prekinuti bihevioralno izražavanje ovogamemorijatijekom testa prisjećanja (slika 1A) (Gerber i

Slika 4. Organizacija sinapsi na DAN-i1 neuronu. Analiza klastera otkrila je da su sinapse od i do lijevog DAN-i1 neurona u regijama 2 i 3 (vidi sliku 2) raspoređene u šest klastera (označenih kao 29,299, itd.). Čini se da ovi klasteri imaju središnju i okružujuću organizaciju: prema njihovom središtu nalaze se DAN!KC, KC!DAN i DAN!MBON sinapse, dok su njihove okružujuće značajke gotovo isključivo KC!DAN sinapse. B, Isto kao u A, ali za desni DAN-i1 neuron. Može se identificirati sedam središnjih i okružujućih struktura. C, Kako bismo kvantificirali ovu organizaciju sinapsi, odredili smo udaljenost (u duljini kabela duž neurona) različitih tipova sinapsi do središta njihovog klastera i otkrili da su KC!DAN sinapse dalje od središta od svih drugih tipova sinapsi. Ovo potvrđuje organizaciju klastera kao središnjih i okružujućih struktura. D, Isto kao u C, ali za desni DAN-i1 neuron. E, Shematski crtež strukture središnjeg okvira (gore) i povećanje spojeva u sredini (dolje). Različita slova iznad dijagrama okvira označavaju značajnost parova (Mann–Whitney U test, str, 0.05, ispravljen prema Bonferroni-Holmu). Svi statistički testovi i njihovi rezultati navedeni su zajedno s izvornim podacima na slici proširenih podataka 1-1.

cistanche pharma special

Hendel, 2006.; Schleyer i sur., 2011., 2013., 2015.a,b, 2018.; Paisios i sur., 2017). Stoga smo se pitali može li optogenetska aktivacija DAN-ova tijekom treninga i tijekom testa dodijeliti ove dvije funkcije. Počeli smo koristiti 58E02- soj pokretača Gal4 koji pokriva DAN-i1 plus dva DAN-a koji inerviraju druge odjeljke medijalnog režnja (Sl. 5A, B) (Rohwedder et al., 2016.) i UAS-ChR{ {14}}XXL kao efektorski soj (Dawydow et al., 2014.). 58E02-DAN-ovi su aktivirani ili upareni ili neupareni s mirisom tijekom treninga, a razlika u preferiranju mirisa u naknadnom testu prisjećanja korištena je za kvantificiranje asocijativnogmemorijakroz PI. Uočili smo pozitivne rezultate PI koji ukazuju na apetitivne asocijativememorijau eksperimentalnom genotipu, dok genetske kontrole heterozigotne samo za transgenski efektor ili pogonski konstrukt nisu pokazalememorija(Slika 6A, gornji dijagrami crno-ispunjenih okvira) (Rohwedder et al., 2016.). Stoga, 58E02-DAN aktivacija tijekom treninga može pružiti signal nagrade za asocijativnumemorijaformiranje.

Zatim smo ponovili eksperiment, ali smo aktivirali i 58E02-DAN tijekom testa prisjećanja. Time su smanjene vrijednosti PI (tj. smanjenememorija-temeljeno pretraživanje) na otprilike polovicu (Sl. 6A, gornji, plavo ispunjeni okviri; za replikaciju ovog rezultata, pogledajte Sl. 6C). Kritično, baš kao što je slučaj s prirodnim nagradama (Slika 1B) (Schleyer et al., 2011, 2015a,b), aktivacija 58E02-DAN nije utjecala na urođeno olfaktorno ponašanje (Slika 6A, dolje). Prema tome, aktivacija 58E02- DAN također može pružiti akutni signal prekida traženja tijekom testa prisjećanja.

Prethodni eksperimenti pokazuju da tri 58E02- DAN-a mogu dodijeliti ista dva signala kao prirodnu nagradu (tj.

Slika 5. Uzorak ekspresije transgena sojeva pokretača 58E02-DAN i 864-DAN. A, B, prethodna flip-out analiza pokretačkog soja 58E02-DAN identificirala je neurone DAN-h1, DAN-i1 i DAN-j1 (koji se također nazivaju pPAM1, pPAM3 i pPAM4), kao kao i jedan dodatni neuron izvan tijela gljive (Rohwedder et al., 2016.). Ovaj uzorak je potvrđen: soj pokretača je ukršten ili s (A1-A5) pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP ili (B1-B4) UAS-ChR{{ 27}}XXL. A1, B1, Signal a-GFP ili a-ChR antitijela, redom. A2, B2, Signal pozadinskog bojenja preko a-FASII odnosno a-HRP protutijela. A3, B3, spajanje odgovarajućih signala. A4, B4, djelomična z projekcija otkriva jaku inervaciju medijalnog režnja tijela gljive. A5, Ne otkriva se inervacija bočnog slijepog crijeva (strelica). C, D, Za soj pokretača 864-DAN-a je objavljeno da se snažno izražava u DAN-i1 (Saumweber et al., 2018). Ovdje smo ga prešli na (C1-C5) pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP ili (D1-D4) UAS-ChR2-XXL. C1, D1, signal a-GFP ili a-ChR antitijela, respektivno. C2, D2, Signal pozadinskog bojenja preko a-FASII ili a-HRP protutijela, redom. C3, D3, spajanje odgovarajućih signala. C4, D4, djelomična z projekcija otkriva jaku inervaciju i-odjeljka u obje hemisfere (strelice), potvrđujući ekspresiju u DAN-i1. C5, Kao što je prethodno objavljeno (Saumweber et al., 2018.), soj pokretača povremeno se eksprimira u dodatnim neuronima, ali ako je tako, obično u samo jednoj hemisferi mozga i u neuronima koji se razlikuju po identitetu između preparata. Relativno najčešće promatrali smo neuron MBON-d1 koji inervira lateralni apendiks u jednoj hemisferi (strelica). Kod više životinja korištenih za našu grupnu analizu, takva stohastička dodatna ekspresija vjerojatno neće izazvati sustavne učinke.

signal za nagradu tijekom treninga i signal za završetak pretrage tijekom testa prisjećanja). Međutim, ostaje nejasno da li svaki od tri DAN-a daje oba signala ili postoji podjela rada, pri čemu su različiti DAN-ovi odgovorni za signal nagrade i signal prekida pretraživanja. Stoga smo odabrali split-Gal4 pokretački soj 864, koji podržava jaku i pouzdanu ekspresiju transgena u samo jednom od DAN-ova pokrivenih 58E02-DAN, DAN-i1 neuronom, u obje hemisfere ( Slika 5C, D) (Saumweber i sur., 2018.). Asocijativna 864-DAN aktivacija u treningu uspostavila je pozitivne indekse izvedbe (tj.memorija-temeljeno pretraživanje; Slika 6B, gornji dijagrami crno-ispunjenih okvira) (Saumweber et al., 2018.). Aktiviranje 864-DAN također tijekom testa prisjećanja je ovo prekinulomemorija-temeljeno pretraživanje (Sl.6B, gornji, plavo ispunjeni okviri). Tri neovisna skupa podataka potvrđuju opažanje da je pretraživanje ugađeno (Slika 6D–F). 864-DAAktivacija (Sl.6B, dolje) nije utjecala na urođeno mirisno ponašanje.

Prethodno je utvrđeno da aktivnost DAN-ova između treninga i testa prisjećanja (tj. tijekom razdoblja zadržavanja) potiče zaboravljanje kod odraslih D. melanogaster (Berry i sur., 2012., 2015.; Shuai i sur., 2015.; Aso i Rubin, 2016). Stoga smo se pitali bi li, u našoj paradigmi, 864-DAN aktivnost promicala zaboravljanje, za razliku od akutnog prekida pretraživanja temeljenog na pamćenju i napuštanjamemorijanetaknuta. Da bi se ispitala ova mogućnost, ličinke su trenirane kao i prije, ali prije povlačenja

Slika 6. Aktivacija istih neurona može uspostavitimemorijai prekinuti njegov opoziv. A Top, Ličinke su trenirane s mirisom predstavljenim u paru ili nespareno s 58E02-DAN aktivacijom plavim svjetlom. U testu prisjećanja, pozitivne vrijednosti PI u eksperimentalnom genotipu, ali ne i u genetskim kontrolama, ukazuju na naučeno ponašanje traženja na temelju asocijativnog pamćenja za miris (krajnji lijevi okvir). Stoga, tijekom treninga, aktivacija 58E02-DAN može posredovati u signalu nagrade. ThememorijaPretraživanje eksperimentalnog genotipa temeljeno na eksperimentu je smanjeno kada je 58E02-DAN također aktiviran plavim svjetlom tijekom testa prisjećanja (krajnji lijevi plavo ispunjen okvir). Prema tome, aktivacija 58E02 također može prenijeti signal završetka traženja. Veličine uzoraka: 16, 15, 17, 18, 15, 18. Na dnu, Larve su testirane na urođenu preferenciju mirisa, bilo u odsutnosti ili prisutnosti plavog svjetla. Svi genotipovi preferirali su miris podjednako jako pod oba uvjeta, što sugerira da aktivacija 58E02-DAN nije imala utjecaja na urođenu sklonost mirisu. Veličina uzorka: 24 svaki. B, Isto kao u A, ali s 864-DAN aktivacijom plavim svjetlom. Vrh, pozitivan PI, i stogamemorija-temeljeno pretraživanje, promatrano je samo u eksperimentalnom genotipu i samo kada je test prisjećanja obavljen u mraku. Veličine uzoraka: 19, 19, 19, 19, 19, 20. Dno, 864-DAN aktivacija nije imala utjecaja na urođenu preferenciju mirisa. Veličina uzorka: 16 svaki. C, U replikaciji eksperimenta prikazanog u A (gore) za eksperimentalni genotip, ličinke su pokazalememorija-temeljena potraga u tami. Kada je 58E02-DAN aktiviran plavim svjetlom tijekom testa prisjećanja, ovo pretraživanje je ugašeno. Veličine uzoraka: 15, 16. D, U ponavljanju pokusa prikazanog u B (gore) za eksperimentalni genotip, ličinke su pokazalememorija-temeljena potraga u tami. Kada je 864-DAN aktiviran tijekom testa prisjećanja, ova pretraga je prekinuta. Veličine uzoraka: 28, 28. E, U daljnjoj replikaciji D, test je proveden na Petrijevoj zdjelici unutarnjeg promjera 9 cm umjesto 15 cm.MemorijaPretraživanje temeljeno na testu prisjećanja promatrano je u mraku i, u ovom slučaju, djelomično je ugađeno 864-DAN aktivacijom. Veličine uzoraka: 22, 22. F, Larve su trenirane u diferencijalnoj verziji eksperimenta s dva mirisa, koristeći n-amilacetat razrijeđen 1:50 i nerazrijeđeni 1-oktanol. Test prisjećanja proveden je na Petrijevoj zdjelici unutarnjeg promjera 9 cm. Thememorija-bazirano pretraživanje promatrano je u mraku i ugađeno je 864-DAN aktivacijom. Veličine uzoraka: 26, 26. Različita slova iznad dijagrama okvira označavaju značajnost parova (Mann–Whitney U test, str, 0.05, ispravljeno prema Bonferroni-Holmu). *Značajnost od nule (test znaka s jednim uzorkom, p, 0.05, ispravljeno prema Bonferroni-Holmu). ns: Neznačajnost u svim eksperimentalnim uvjetima (Kruskal–Wallisov test, str. 0,05). Svi statistički testovi i njihovi rezultati navedeni su zajedno s izvornim podacima na slici proširenih podataka 1-1.

Slika 7. Aktivacija 864-DAN između treninga i testa prisjećanja ne poboljšava zaboravljanje ili izumiranje. Grupa ličinki je trenirana kao na slici 6. Zatim su ličinke držane ili u tami ili na plavom svjetlu 3 minute (pričekajte) i zatim su testirane. Kada je taj test prisjećanja proveden u mraku, amemorijaPretraživanje temeljeno na analizi promatrano je neovisno o uvjetima osvjetljenja, a time i neovisno o 864-DAN aktivnosti, tijekom faze čekanja (lijevi i srednji okvir). Potvrdili smo da i nakon takvog razdoblja čekanja 864- DAN aktivacija tijekom testa opoziva prestajememorija-temeljeno pretraživanje (desni okvir). Veličine uzoraka: 25, 24, 19. B, Isto kao u A, ali ovaj put s mirisom prisutnim tijekom razdoblja čekanja. Veličina uzorka: 28 svaki. Različita slova iznad dijagrama okvira označavaju značajnost parova (Mann–Whitney U test, str, 0.05, ispravljeno prema Bonferroni-Holmu). * Značajnost od nule (test predznaka jednog uzorka, p, 0,05, ispravljeno prema Bonferroni-Holmu). Svi statistički testovi i njihovi rezultati navedeni su zajedno s izvornim podacima na slici proširenih podataka 1-1.

cistanche pharma special