2. dio Kemijska i genetička diskriminacija Cistanches Herba na temelju UPLC-QTOF/MS i DNA barkoda
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
OPLS-DA i identifikacija markera Kako bi se identificirali potencijalni kemijski markeri za razlikovanje dviju vrsta, generirana je S-plota OPLS-DA (slika 3). Na S-grafikonu svaka točka predstavlja jedan tR–m/z ionski par. X i Y osi predstavljaju doprinos odnosno pouzdanost iona; što je veća udaljenost ionskog tR–m/z para od nule, to je veći doprinos/pouzdanje ove ikone razlici između dviju skupina. Stoga, tR–m/z ion koji pokazuje na dva kraja 'S' predstavlja karakteristične markere s najvećom pouzdanošću u svakoj skupini. Rezultati OPLS-DA pokazali su da se UPLC-QTOF/MS može koristiti za razlikovanjeCistanche deserticolaizCistanche tubulosa(slika 3). Utvrđeno je ukupno šest vjerodostojnih i značajnih markera koji olakšavaju diskriminaciju ovih skupina (Tablica 3). Identiteti triju potencijalnih markera provizorno su dodijeljeni. Komponente koje su u korelaciji s ova tri iona provizorno su identificirane kao izomeri kampneozida II, cistanozida C i cistanozida A. Spojevi markeri a, b i c mogu se koristiti za razlikovanje dviju biljnih vrsta, budući da su intenziteti iona a i b uCistanche deserticolabio viši nego uCistanche tubulosa(Sl. 4A, 4B), a marker c mogao se detektirati uCistanche tubulosa, ali ne uCistanche deserticola(Slika 4C).
DNK barkodiranje: informacija o slijedu i učinkovitost identifikacije
Podaci o sekvenci prikazani su u tablici 4. Prosječna genetska udaljenost psbA-trnH (0.1732) bila je veća od druge dvije regije (0.0740 , 0,1197) značajno. Prosječni GC sadržaj psbA-trnH (20,64 posto) bio je manji od druge dvije regije (55.00 posto, 55.00 posto). Iako stopa uspješnosti ITS i ITS2 nije dobivena u ovoj studiji, regija psbA-trnH pokazala se dobro u PCR amplifikaciji i sekvencioniranju (100 posto, 87,23 posto). Učinkovitost identifikacije postignuta je analizom BLAST1 i metodom najbliže udaljenosti, a uglavnom odražava stopu uspješnosti barkodova. Regija psbA-trnH bila je jasno bolja od druga dva crtična koda u učinkovitosti identifikacije na temelju dvije metode. Nedostatak sekvenci najvjerojatnije je razlog što je ITS regija pokazala 100 postotnu učinkovitost identifikacije na temelju metode BLAST1, odnosno 0 na temelju metode najbliže udaljenosti.
Analiza genetske divergencije pomoću šest parametara
Korišteno je šest parametara za analizu intraspecifične varijacije i interspecifične divergencije pomoću tri crtična koda (Tablica 5). Značajna razlika između inter- i intra-specifičnih varijacija bila je indikativna za korisnost DNK barkodova. Ovdje je minimalna međuvrsna udaljenost tri crtična koda bila veća od maksimalne intraspecifične udaljenosti. Štoviše, regija psbA-trnH imala je veću maksimalnu intraspecifičnu udaljenost i prosječnu interspecifičnu udaljenost od druga dva crtična koda, što pokazuje da je regija psbA-trnH pokazala dobre rezultate u razlikovanju dva porijekla Cistanches Herba.
Analiza praznine u barkodiranju za prepoznavanje
Cistanche deserticolaiCistanche tubulozaPraznina kodiranja predstavlja nevjerojatnu varijaciju između vrsta i uzoraka unutar vrsta i pokazuje odvojene distribucije između uzoraka unutar i između vrsta koje se ne preklapaju. U ovoj studiji (slika 5), raspon udaljenosti postavljen je na 0–0.45, jer je najveća K2P udaljenost psbA-trnH izmeđuCistanche deserticolaiCistanche tubulozabio je blizu 0.45. Tri barkoda pokazala su jasne praznine u distribuciji intra- i inter-specifične varijacije. Nadalje, razmak psbA-trnH bio je znatno veći od druga dva barkoda. Stoga bi regija psbA-trnH mogla biti idealan crtični kod za razlikovanje dvaju izvoraCistanchesHerba.
Stablo spajanja susjeda (NJ).
NJ stablo ilustrira odnos među vrstama i olakšava određivanje njihovog grupiranja. U ovoj studiji, NJ stablo od tri crtična koda izgrađeno je na temelju K2P modela (Sl. 6). Rezultati su pokazali da su dva podrijetla Cistanches Herba zasebno grupirana u dva klasusa. Dakle, stablo NJ jasno razlikuje izmeđuCistanche deserticolaiCistanche tubuloza.
Rasprava i zaključci
Cistanches Herba važan je ljekoviti materijal koji se obično koristi za prehranu azijske zajednice [38]. Međutim, dva podrijetla odCistanchesHerba, Cistanche deserticolaiCistanche tubuloza, imaju različit kemijski sastav i farmakološku aktivnost. Istodobno, dva izvora se razlikuju u kliničkoj primjeni i tržištu robe. Klasifikacija Cistanche je konfuzna i masovne zamjene i štetočine preplavljuju tržište zbog nedostatka resursa i posebnog okruženja za uzgoj Cistanches Herba. Prihvaćeno je da rod Cistanche uključuje četiri vrste i jednu varijantu:Cistanche deserticola, Cistanche tubuloza, Cistanche sinensis, Cistanche salsa, iCistanchesalsavar. albiflora [39]. Istraživači u Japanu razmatrali su podrijetloCistanchesHerba asCistanche salsa[40–43], dok je identificiran kaoCistanche deserticolaod Tu [44–46]. Stoga postoji zabuna u klasifikaciji Cistanche i teško je razlikovati dva porijekla Cistanches Herba. Tradicionalne metode za kontrolu kvalitete Cistanches Herba su morfološka identifikacija [47,48], mikroskopska identifikacija [49] i TLC (tankoslojna kromatografija) [50,51], FTIR (Fourierova transformacija infracrvene spektroskopije) [14], HPLC (visoka Performansna tekućinska kromatografija) [52,53]. Morfološkom i mikroskopskom metodom lako se mogu razlikovati vrste iz različitih rodova ili porodica koje imaju velike razlike u morfološkim i mikroskopskim karakteristikama, dok je teško razlikovati srodne vrste. TLC i FTIR mogu jasno razlikovati vrste koje imaju različite vrste kemijskog sastava, dok je teško odrediti kemijsku komponentu i sadržaj. HPLC se uglavnom koristi za razlikovanje vrsta s različitim sadržajem kemijskih elemenata, međutim, vrijeme analize je duže i osjetljivost je relativno niža u usporedbi s UPLC. Sukladno tome, tehnologija UPLC-QTOF/MS bila je brža i točnija u određivanju kemijskog sastava od drugih kemijskih metoda. Metode molekularne identifikacije dobro se pokazuju u diskriminaciji na temelju genetske varijacije, kao što je SDS-PAGE (elektroforeza natrijevog dodecil sulfata i poliakrilamidnog gela) [54], AFLP (polimorfizam duljine pojačanog fragmenta) [55,56]. Međutim, ovim molekularnim metodama nije lako upravljati i nisu univerzalne. U skladu s tim, DNK barkodiranje bi moglo diskriminirati vrste univerzalnije, brže i točnije od drugih molekularnih metoda. Za vrste iz istog roda i bliskog genetskog srodstva, same te metode možda neće imati dobre rezultate u identifikaciji.
Ovdje smo kombinirali UPLC-QTOF/MS i DNA barkodiranje u identifikacijiCistanche deserticolaiCistanche tubulozai procijenili kemijske i molekularne markere koji bi im omogućili diskriminaciju. Otkrivena su 23 kvalificirana maksimuma mase, a 16 ih je identificirano pomoću UPLC–QTOF/MS, a prvo je pronađeno da tri potencijalna markerska spoja olakšavaju razlikovanje dvaju izvora PCA i OPLS-DA analizom. Nadalje, četiri su pokazatelja procijenjena tehnologijom DNK barkodiranja u smislu njihove sposobnosti razlikovanja dvaju podrijetla: učinkovitost identifikacije, genetička učinkovitost, praznina u barkodiranju i analiza NJ stabla. Regija psbA-trnH podržana je kao prikladan DNA crtični kod za razlikovanjeCistanche deserticolaiCistanche tubuloza. Zaključno, najprije smo uspostavili novu kombiniranu metodu molekularne i kemijske analize za razlikovanje i kontrolu kvalitete u dva podrijetla Cistanches Herba. DNK barkodiranje može diskriminirati dva porijekla u genetskim varijacijama i univerzalno i točno potvrditi autentičnost vrsta; UPLC-QTOF/MS tehnologija može analizirati kemijski sastav kako bi se brzo i točno procijenila kvaliteta medicinskih materijala. Kombinirana metoda DNA barkodiranja i UPLC-QTOF/MS tehnologije jamče točniju i znanstvenu identifikaciju u više izvora medicinskih materijala i mogu poslužiti kao metoda za identifikaciju drugih zbunjujućih vrsta ili rodova u klasifikaciji.
Autorski doprinosi
Osmislio i dizajnirao pokuse: LFH SHZ LBW. Izvedeni pokusi: SHZ LBW. Analizirani podaci: SHZ LBW. Dodani reagensi/materijali/alati za analizu: LFH. Napisao rad: SHZ XJ LBW. Provjerite rukopis: ZHW.
Cistanche deserticola ima mnoge učinke, kliknite ovdje da biste saznali više
Reference
1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, et al. (1996) Usporedba hranjenja bubrega i jačanja janga učinkovitosti tri različite vrsteherbacistanče. Časopis kineskih medicinskih materijala 19: 420–421.
2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994.) Usporedba funkcija hranjenja bubrega i jačanja janga tri različite vrsteherbacistanče. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171.
3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Napredak u istraživanju kemijskih sastojaka u biljkamaCistancheHuffing. et Link. Kineski tradicionalni i biljni lijekovi 34: 473–476.
4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et al. (2006) Feniletanoidni aminoglikozidi i acilirani oligosećeri s vazorelaksantnim djelovanjem izCistanchetubuloza. Bioorg Med Chem 14: 7468-7475.
5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et al. (2009) Hipokolesterolemijski učinciCistanchetubulozaekstrakt, kineski tradicionalni sirovi lijek, kod miševa. Am J Chin Med 37: 1125–1138.
6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et al. (2010) Inhibicijski učinak akteozida izoliranog izCistanchetubulozana otpuštanje kemijskog medijatora i proizvodnju upalnih citokina stanicama RBL-2H3 i KU812. Planta Med, 1512–1518.
7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Acilirani feniletanoidni aminoglikozidi s hepatoprotektivnim djelovanjem iz pustinjske biljkeCistanchetubuloza. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890.
8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) Iridoidni i aciklički monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O i P izCistanchetubuloza. Chem Pharm Bull (Tokio) 58: 1403–1407.
9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Identifikacija i pregled komercijalne sirove droge herba cistanche. Časopis kineskih medicinskih materijala 20: 117–122.
10. Zhu SY (2001) Farmakognostička identifikacijaCistanchetubulozazbunjena vrstaCistanchedeserticola. Časopis kineskih medicinskih materijala 24: 24–25.
11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013) Mikroskopska identifikacija trijuherbacistančeu Xin Jiangu. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883.
12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Mikroskopska identifikacija komercijalnihHerbaCistanchestehnikom digitalnog snimanja. Časopis kineskih medicinskih materijala 27: 400–402.
13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Studija o identifikacijiherbacistančei preljubnici. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318.
14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et al. (2010.) FTIR i 2D-IR spektroskopske studije na različitim izvorimaherbacistanče. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900.
15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et al. (2009) IdentifikacijaCistanchedeserticolaiz solarija Boschniakla rossica i Cynomorium korištenjem FTIR i dvodimenzionalne korelacijske IR spektroskopije. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507.
16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008.) Studija o HPLC otisku prstaCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257.
17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005.) Kromatografski otisak prstaCistanchedeserticolapomoću HPLC. Kineski tradicionalni i biljni lijekovi 36: 268–271.
18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et al. (2010) IdentifikacijaCistanchevrsta (Orobanchaceae) na temelju sekvenci intergenske regije plastida psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130.
19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) IdentifikacijaCistancheVrsta po kemijskom sastavu i ponavljanje otiska prsta između jednostavnih sekvenci. Biol. Pharm. Bull., 32: 142–146.
20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Strukturna karakterizacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida izCistanchesdeserticolaYC Mapomoću UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Fitokemijska analiza 23: 668–676.
21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS analiza alkaloida u tradicionalno prerađenom Coptis chinensis Franch. Komplement temeljen na dokazima Alternat Med 2012: 942384.
22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013.) Ispitivanje tehnologije obrade lista mušmula (Eriobotrya japonica) tekućinskom kromatografijom ultraučinkovitosti – kvadrupolna vremenski proletna spektrometrija mase u kombinaciji s kemometrijom. PLoS ONE 8: e64178.
23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Barkodiranje životinjskog svijeta: razlike podjedinice 1 citokrom c oksidaze među blisko srodnim vrstama. Proc. R. Soc. Lond. B., 270 Suppl 1: S96–99.
24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Biološke identifikacije putem DNK barkodova. Proc Biol Sci., 270:313:321.
25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005.) Upotreba DNK barkodova za identifikaciju cvjetnica. Proc Natl Acad Sci., 102: 8369–8374.
26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et al. (2010.) Validacija ITS2 regije kao novog DNK barkoda za identifikaciju ljekovitih biljnih vrsta. PLoS One 5: e8613.
27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011.) MEGA5: Molekularna evolucijska genetička analiza korištenjem metoda maksimalne vjerojatnosti, evolucijske udaljenosti i metode maksimalne štedljivosti. Mol Biol Evol 28: 2731-2739.
28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNK barkodiranje: stope pogrešaka temeljene na sveobuhvatnom uzorkovanju. PLoS Biol 3: e422.
29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984.) Studije o sastavnicamaCistancheHerba.IV. Izolacija i strukture dvaju novih fenilpropanoidnih glikozida, cistanozida C i D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885.
30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985.) Studije o sastojcimaCistancheHerba. VI. Izolacija i strukture novog iridoidnog glikozida, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650.
31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009.) DiferencijacijaHerbaCistanchesotiskom prsta s tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti–detekcijom niza dioda–spektrometrijom mase. Journal of Chromatography A 1216: 2156–2162.
32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Strukturna karakterizacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida izCistanches deserticola YC Mapomoću UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Phytochem Anal 23: 668–676.
33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et al. (2008) Izolacija i pročišćavanje feniletanoidnih glikozida izCistanchedeserticolabrzom protustrujnom kromatografijom. Kemija hrane 108: 702–710.
34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et al. (2013) Kvantitativna analizaCistanchesHerbakoristeći tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti u kombinaciji s detekcijom niza dioda i masenu spektrometriju visoke rezolucije u kombinaciji s kemometrijskim metodama. J Sep Sci 26: 1945–1952.
35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985.) Studije o sastojcimaCistancheHerba. V. Izolacija i strukture dvaju novih fenilpropanoidnih glikozida, cistanozida E i F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457.
36. Jiang Y, Tu PF (2009.) Analiza kemijskih sastojaka uCistanchevrsta. J Chromatogr A 1216:1970-1979.
37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Rukovanje podacima u znanosti i tehnologiji. Kemometrija: udžbenik.
38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014.) EkotipoviCistanche deserticolana temelju kemijske komponente i molekularnih svojstava. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328.
39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011.) istraživanje i industrijski razvoj herbacistanče. Journal of Chinese pharmaceutical 46: 882–887.
40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et al. (1987) Novi feniletanoidni glikozidi izCistanchetubuloza(SCHRENK) Kuka. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314.
