Dio 1: Verbascoside štiti stanice gušterače od ER-stresa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 i Carla Perego 1,*

Sažetak:

Značajni epidemiološki dokazi pokazuju da prehrana bogata polifenolima štiti od razvoja dijabetesa tipa 2. Feniletanoidni glikozidverbaskozid/akteozid, široko rasprostranjen polifenolni biljni spoj, ima nekoliko bioloških svojstava uključujući snažno antioksidativno, protuupalno i neurozaštitno djelovanje. Cilj ovog istraživanja bio je ispitati moguće učinkeverbaskozidna stanicama gušterače, meta nikad prije testirana. Mišje i ljudske stanice su inkubirane saverbaskozid(0.8–16 uM) do pet dana, a kombinacija biokemijskih i slikovnih tehnika korištena je za procjenu preživljavanja i funkcioniranja stanica u normalnim uvjetima ili uvjetima koji izazivaju stres endoplazmatskog retikuluma (ER). Našli smo zaštitni učinak ovisan o doziverbaskozidprotiv oksidativnog stresa u klonskim i ljudskim stanicama. Mehaničke studije otkrile su da polifenol štiti stanice od disfunkcija posredovanih ER-stresom, modulirajući aktivaciju grane proteinske kinaze RNA-like kinaze endoplazmatskog retikuluma (PERK) nesmotanog proteinskog odgovora i promičući dinamiku mitohondrija. Kao rezultat toga, povećana vitalnost, mitohondrijska funkcija i sadržaj inzulina otkriveni su u tim stanicama. Ove studije pružaju dokaze daverbaskozidpojačava sposobnost -stanica da se nose s ER-stresom, što je važan čimbenik disfunkcije i neuspjeha -stanica u dijabetičkim stanjima i podupire terapijski potencijal verbaskozida u dijabetesu.

Ključne riječi:

verbaskozid; polifenoli; stanice koje proizvode inzulin; dijabetes; UPR; oksidativni stres; ER-stres; POVLASTICA; protuupalno; mitohondrije

1. Uvod

Dijabetes je kronični poremećaj koji pogađa stotine milijuna ljudi [1]. Različita etiologija karakterizira dijabetes tipa 1 (T1D) i dijabetes tipa 2 (T2D), a oba karakterizira nedostatak inzulina [2]. Inzulin regulira koncentraciju glukoze u plazmi stimulirajući unos glukoze u mišićnim i masnim stanicama i modulirajući metabolizam glukoze u jetri. Dostupnost hranjivih tvari, hormoni i neuralni inputi reguliraju lučenje inzulina gušterače i održavaju koncentracije glukoze u krvi unutar fiziološkog raspona [3-5]. Stoga disfunkcija -stanica dovodi do dijabetesa karakteriziranog hiperglikemijom natašte.

T2D je progresivno stanje u kojem su inzulinska rezistencija i neispravne funkcije -stanica međusobno povezane, a noviji dokazi potaknuli su interes za kritičnu primarnu ulogu -stanica u hiperglikemijskom statusu [6,7]. U pretilih osoba bez dijabetesa stanice kompenziraju otpornost na inzulin povećanim lučenjem hormona. Međutim, kod nekih ispitanika, kako se njihovo stanje pogoršava, inzulinemija opada, a razina glukoze se penje do hiperglikemije [8,9].

Glukoza je najvažniji modulator staničnih funkcija. Stimulacija glukoze utječe na regulaciju gena i ekspresiju proteina uključenih u mnoge stanične funkcije kao što su glikoliza, sinteza i sekrecija inzulina [10]. Lučenje inzulina izazvano glukozom oslanja se na oksidativni metabolizam za proizvodnju adenozin trifosfata (ATP), a fiziološki se proizvodi niska razina reaktivnih kisikovih vrsta (ROS). Međutim, -stanice nisu baš dobro opremljene enzimima čistači i ta ih slabost čini vrlo osjetljivima na oksidativni stres [11,12]. Kako se oksidativni stres penje, proizvodnja inzulina u stanicama opada, a -stanice proizvode citokine koji izazivaju oštećenje stanica kroz upalu i apoptozu [13]. Zanimljivo, iako se smanjena masa stanica ranije pripisivala staničnoj smrti, nedavne studije ukazuju na veliku ulogu stanične dediferencijacije [14,15]. Postalo je jasno da nekoliko faza vodi do T2D. Metabolički i oksidativni inzulti uzrokuju stres endoplazmatskog retikuluma (ER) koji dovodi do pada sinteze i izlučivanja inzulina, upalni procesi prate otpuštanje citokina i gubitak stanica može se dogoditi kroz apoptozu i dediferentaciju. Ovo je znanje temeljno za razvoj odgovarajućih strategija liječenja, budući da se oksidativni stres i upala mogu suzbiti, a plastičnost stanica gušterače dopušta mogućnost vraćanja matičnih stanica u -stanice kao što je dokazano na miševima [16].

Nedavno je ranjivost -stanica na oksidativni stres uspješno potaknula upotrebu prehrambenih antioksidansa za prevenciju dijabetesa [17]. Među najzanimljivijim antioksidativnim namirnicama, maslinovo ulje poznato je po svojim blagotvornim svojstvima još od starih Grka. Maslinovo ulje sadrži dobru količinu mononezasićenih masnih kiselina (MUFA) i nekoliko polifenola kao što su tirozol, hidroksitirozol, oleuropein i verbaskozid.

verbaskozid, također poznat kao akteozid, je feniletanoidni glikozid ekstrahiran iz Olea europea, biljaka vrste Verbascum i 23 druge biljne porodice [18-20]. Također se može dobiti iz nusproizvoda maslinova ulja (obogaćeno je otpadnom vodom mlina za masline dobivenom preradom ploda masline) ili se može proizvesti pristupima metaboličkog inženjeringa i sintetske biologije [21].

Još uvijek nisu objavljeni podaci o bioraspoloživosti verbaskozida kod ljudi. Studije provedene na miševima, SKBR3 i Caco-2 stanicama sugeriraju da bi moglo biti izvedivo da nemetabolizirani verbaskozid prijeđe crijevnu barijeru, cirkulira u krvnoj plazmi i ispoljava antioksidativne učinke [20,22,23]. Za razliku od većine biljnih polifenola, verbaskozid uglavnom djeluje na stanice kroz modulaciju transkripcije gena niza enzima i regulatornih čimbenika, s antioksidativnim i protuupalnim učincima [24-30].

Iako su poznati mnogi korisni učinci verbaskozida na ljudsko zdravlje, nema podataka o njegovom djelovanju na stanice gušterače. Budući da su oksidativni stres i upala u osnovi patogeneze T2D, istražili smo može li liječenje verbaskozidom poboljšati vitalnost stanica i

funkcionira u uvjetima koji izazivaju ER-stres i opisali smo molekularne mehanizme njegova djelovanja. Naši podaci otkrivaju da verbaskozid sprječava oksidativni stres i upalu u stanicama modulirajući aktivaciju nesamotanog proteinskog odgovora i promičući dinamiku mitohondrija, što rezultira povećanom vitalnošću stanica i sadržajem inzulina.

2. Materijali i metode

2.1. Kultura stanica i materijali

Mišje tc3 stanice (koje je ljubazno ustupio prof. Hanahan—Odsjek za biokemiju i biofiziku, Sveučilište Kalifornije, San Francisco, CA [31]) uzgajane su u mediju RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Italija) s dodatkom 10 posto (v/v) fetalnog telećeg seruma inaktiviranog toplinom (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italija), 1 posto (v/v) penicilin-streptomicina (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Italija) i 1 posto (v/v) L-glutamina (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italija). Ljudski Langerhansovi otočići izolirani su u Milanu (Niguarda Ca' Granda) od kadaveričnih multiorganskih donora prema postupku koji su opisali Ricordi i sur. [32]; uzgajani su u RPMI mediju kulture koji je sadržavao 5,5 mmol/L glukoze, 10 posto toplinski inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma, 0,7 mM glutamina, 50 jedinica/mL penicilina i 50 ug/mL streptomicina (EuroClone, SpA, Pero MI, Italija). Korištena su četiri različita pripravka otočića, čistoća otočića bila je 80 ± 10 posto. Izolaciju otočića i studije otočića odobrio je Etički odbor bolnice Niguarda Ca' Granda u Milanu (11. prosinca 2009.). tc3 stanice tretirane su s 0,8, 1,6 i 16 uM verbaskozida (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), kafeinskom kiselinom i hidroksitirosolom (ljubazan dar prof. Dell'Agli, Odsjek za farmakološke i biomolekularne znanosti, Universita degli Studi di Milano, Milano, Italija) u potpunom RPMI mediju tijekom 5 dana, dok su ljudski otočići sa 16 uM verbaskozida. Stanice tretirane metanolom/etanolom korištene su kao kontrole. Kako bi se inducirao oksidativni stres, stanice su tretirane s H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, SAD) 500 uM u potpunom RPMI mediju 20 minuta prije analize, dok je tretman s tunikamicinom 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) tijekom 7 h izvedeno je da se izazove ER stres.

2.2. Detekcija vitalnosti stanica MTT testom

Stanice su stavljene u ploče s 96 jažica, a pet dana nakon tretmana verbaskozidom inkubirane su s 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetiltiazol{{7} }il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, SAD) 4 h u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2 na 37 oC. Nakon inkubacije, stanice su nježno resuspendirane u 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italija), a apsorbancija na 540 nm detektirana je čitačem mikropločica (Benchmark, čitač mikropločica, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, SAD) [33]. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka, a podaci su izraženi kao višestruko povećanje u odnosu na kontrolne uzorke.

2.3. Detekcija stanične smrti protočnom citometrijom

Pet dana nakon inkubacije s 16 uM verbaskozida, -stanice su odvojene 7 min inkubacije s tripsinom/EDTA, sakupljene i centrifugirane; talog je nježno resuspendiran u fosfatnom puferu fiziološkoj otopini s niskim sadržajem soli. Stanice su obojene MuseTM reagensom za brojanje i vitalnost (Millipore, MCH100102, Burlington MA, SAD) prema protokolu proizvođača i analizirane protočnom citometrijom. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka, a podaci su izraženi kao postotak mrtvih stanica prema ukupnom broju.

2.4. ROS generacija

Intracelularni ROS je procijenjen s DCFDA (2/,7/-diklorofuorescein diacetat) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, SAD), membranski propusnom sondom koja postaje fluorescentna kada se veže na ROS [34]. tc3 stanice su prethodno napunjene s 15 uM DCFDA u Krebs-Ringerovom puferu (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 i 2 mM CaCl2)

dopunjen s 11 mM glukoze tijekom 1 sata na 37 oC. Sadržaj ROS detektiran je 30 minuta u bazalnim i stresnim uvjetima s čitačem mikropločica (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Švicarska). Srednje vrijednosti i standardne devijacije temeljene su na tri neovisna eksperimenta.

2.5. Western Blotting

tc3 stanice su sakupljene i otopljene u RIPA puferu (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 posto TERGITOLw NP40, 0,5 posto deoksiholata) kojem je dodan aprotinin (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, SAD), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, SAD) i Roche inhibitore (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, SAD) 40 minuta na 4 oC. Koncentracija proteina određena je Bradfordovim testom [35] korištenjem Bradfordovog reagensa (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, SAD), 30 ug proteina razdvojeno je 10-postotnom SDS-PAGE i preneseno na nitrocelulozne membrane (Millipore, Burlington MA, SAD). Primarna protutijela primijenjena su 2 sata u puferu za blokiranje s 5 postotnim nemasnim mlijekom ili 5 postotnim otopinama BSA; korištena su sljedeća primarna protutijela: mišji anti- -aktin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, SAD), mišji anti-akrolein (Abcam, ab48501, Cambridge, UK), mišji anti-BIP (ljubazan dar prof. Borgese Nica, Institut za neuroznanost, CNR, Milano, Italija), zečji anti-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, SAD), mišji anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, SAD), zečji anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, SAD), mišji anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, SAD), zečji anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, SAD), zečji anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, SAD), ovčji anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Njemačka), zečji anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, SAD), zečji anti-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Danvers, MA, SAD) i zečji anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, SAD). Sekundarna antitijela konjugirana s HRP (Dako Agilent, Santa Clara, CA, SAD) korištena su u razrjeđenju 1:5000. Proteini su detektirani korištenjem ECL detekcijskog sustava (Euro-Clone SpA, Pero MI, Italija) korištenjem Odyssey Fc Image sustava (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Njemačka), a gustoća trake je kvantificirana softverom Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, SAD) [36]. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka, a podaci su izraženi kao višestruko povećanje u odnosu na kontrolne uzorke.

2.6. Potencijal mitohondrijske membrane

tc3 stanice i ljudski Langerhansovi otočići inkubirani su sa 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Italija) ili 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Milano, Italija) 30 minuta na 37°C. oC; Intenziteti fluorescencije detektirani su čitačem mikropločica TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em za MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em za MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Švicarska). Stanice su inkubirane s 500 uM H2O2 20 minuta i intenzitet fluorescencije je detektiran kao što je prethodno opisano. Srednje vrijednosti i standardne devijacije temeljene su na tri različita eksperimenta.

2.7. Morfologija i dinamika mitohondrija

tc3 stanice su prethodno napunjene sa 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Italija) u 11 mM glukoznog Krebs-Ringerovog pufera na 37 oC tijekom 30 minuta. Uzorci su postavljeni u komoru za snimanje i nasumična polja su snimljena korištenjem rhodan filtra mikroskopa Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Njemačka). Kako bi se procijenila morfologija mitohondrija, sljedeći parametri analizirani su korištenjem softvera za analizu čestica ImageJ: površina (um2), kružnost (4mArea2/Perimeter2) i Feretov maksimalni promjer (um) [37].

Za pokuse s vremenskim odmakom, snimanje jedne stanice provedeno je pri 1 sličici u sekundi tijekom 30 s pod kontrolom ili uvjetima oksidativnog stresa. Kako bi se izmjerila mitohondrijska kumulativna udaljenost (um2), slike su najprije korigirane za izbjeljivanje fotografija, zatim su videozapisi analizirani pomoću postojećeg dodatka Image-Pro Plus (praćenje objekata) (Media Cybernetics, Rockville, MD, SAD). Do dvanaest

stanice su snimljene u tri neovisna eksperimenta i podaci su prikazani kao srednje vrijednosti i standardne devijacije.

2.8. Lučenje inzulina

Ljudski izolirani Langerhansovi otočići nasađeni su u 96-ploču s jažicama u gustoći od 20 otočića po jažici i, nakon 5 dana liječenja, izmjereni su sadržaj inzulina i izlučivanje u bazalnoj (3,3 mM glukoze) i stimuliranoj (16,7 mM glukoze) ) stanja pomoću ELISA imunološkog testa (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Švedska).

2.9. Statističke analize

Sve statističke analize provedene su s GraphPad Prism 8.0 na neovisnim biološkim replikama. Srednje vrijednosti između dvije skupine procijenjene su korištenjem dvosmjernog Studentovog t-testa, a p-vrijednost < 0.05="" uzeta="" je="" kao="" dokaz="" statističke="" značajnosti.="" srednje="" vrijednosti="" između="" tri="" ili="" više="" skupina="" uspoređene="" su="" analizom="" varijance="" (anova),="" nakon="" čega="" je="" uslijedio="" višestruki="" post-hoc="" (tukeyjev)="" usporedni="" test.="" upotrijebljeni="" statistički="" test,="" točne="" p="" vrijednosti="" i="" broj="" replika="" (n)="" naznačeni="" su="" u="" legendama="" pojedinačnih="" slika.="" trake="" pogrešaka="" na="" slikama="" prikazuju="" srednju="" vrijednost="" ±="" sd="" ili="" srednju="" vrijednost="" ±="" se,="" kako="" je="">

3. Rezultati

3.1. Verbaskozid poboljšava vitalnost stanica

Budući da nije bilo podataka o učinku verbaskozida na -stanice, proveli smo MTT test za procjenu održivosti stanica i kao što je prikazano na slici 1A, primijećen je pozitivan trend ovisan o dozi. Stoga smo za daljnja istraživanja odabrali koncentraciju od 16 uM za koju je statistički dokazano da je učinkovita za povećanje vitalnosti -stanica. Protočnom citometrijom proučavali smo utjecaj petodnevne inkubacije verbaskozida na preživljavanje -stanica u bazalnim uvjetima i nakon 2{{21} } min prethodne obrade s 500 uM H2O2. U bazalnom stanju, verbaskozid nije utjecao na preživljavanje stanica, što sugerira da povećana vitalnost stanica uočena u MTT testu može biti posljedica poboljšane aktivnosti mitohondrija. Dok je, nakon izlaganja H2O2, prethodna obrada s 16 uM verbaskozida značajno smanjila smrt stanica izazvanu oksidativnim stresom (Slika 1B,C). Verbaskozid je složena molekula koja se može modificirati hidrolizirajućim enzimima [18]. Kako bi se ispitalo mogu li metaboliti verbaskozida biti odgovorni za uočeni zaštitni učinak, tc3 stanice su tretirane hidroksitirozolom i kafeinskom kiselinom (0,8 i 16 uM) tijekom 5 dana. Oba metabolita nisu povećala vitalnost stanica, naprotiv, citotoksični učinak, relevantniji nakon izlaganja H2O2, otkriven je za koncentraciju od 16 uM (Slika S1). Ovo otkriće dokazuje da verbaskozid, a ne njegovi metaboliti, ima zaštitni učinak na liječenje H2O2.

3.2. Verbaskozid modulira redoks homeostazu i ima protuupalni učinak u -stanicama

Prvo smo potvrdili u tc3 stanicama protuupalne i antioksidativne učinke verbaskozida uočene u drugim tipovima stanica [24,29,34]. Aktivnost uklanjanja verbaskozida ROS procijenjena je tc3 stanicama obilježenim ROS specifičnom DCFDA (2/,7/-diklorofuorescein diacetat) stanično propusnom sondom. Kao što je prikazano na slici 2A, značajno smanjenje sadržaja ROS-a otkriveno je nakon predtretmana verbaskozidom, i pod uvjetima bazalnog i oksidativnog stresa.

Western blot analize otkrile su značajno smanjenje ekspresije markera oksidativnog stresa akroleina i 4-hidroksinonenala (HNE) u stanicama tretiranim verbaskozidom. Osim toga, pronašli smo povećanje ekspresije superoksid dismutaze (SOD1), što sugerira da verbaskozid ispoljava svoju antioksidacijsku aktivnost vjerojatno s dva različita mehanizma, izravno kao čistač ROS-a i neizravno induciranjem ekspresije antioksidativnih enzima (Slika 2B,C).

Protuupalni učinak verbaskozida na -stanice procijenjen je procjenom aktivacije NFKB puta, najvažnijeg proinflamatornog puta u tim stanicama [38]. Western blot analizom pronašli smo smanjenu ekspresiju inhibitora nuklearnog faktora kapa B (IKB) i nuklearnog faktora kapa-pojačivača lakog lanca (NFKB), te značajno smanjenje fosforilacije NFKB u prethodno tretiranim stanicama, podupirući hipotezu o učinkovitost verbaskozida u smanjenju stanične upale (Slika 2D,E).

3.3. Verbaskozid modulira nesmotani proteinski odgovor -stanica

Zatim smo detaljno analizirali molekularni mehanizam kojim verbaskozid ima antioksidacijsku i protuupalnu ulogu, usredotočujući se na endoplazmatski retikulum koji se pojavljuje kao ključni senzor metaboličkih i stresnih signala u stanicama. U uvjetima stresa, organela pokreće homeostatski odgovor, poznat kao nesmotani proteinski odgovor (UPR), usmjeren na oporavak funkcije ER; međutim, prekomjerna aktivacija ovog puta rezultira apoptozom [39,40].

Markeri povećanog ER stresa su pojačana regulacija proteina šaperona i aktivacija UPR odgovora. Western blotting analiza stanica tretiranih verbaskozidom otkrila je smanjene razine dvaju šaperonina, proteina toplinskog šoka 70 (HSP70) i ​​veznog imunoglobulinskog proteina (BIP) (Slika 3A,B). Nadalje, otkriveno je značajno smanjenje ekspresije protein kinaze RNA-slične ER kinaze (PERK) i smanjena fosforilacija njezinog nizvodnog efektora, eukariotskog faktora inicijacije translacije 2 (eIF2).

Kliknite ovdje za 2. dio