1. dio:Mapiranje epigenomske i transkriptomske interakcije tijekom stvaranja memorije i prisjećanja u Ansamblu hipokampalnog engrama

Za više information:ali.ma@wecistanche.com

Pls kliknite ovdje do 2. dijela

Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1Picower Institut za učenje iMemorija, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, SAD.

2Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, SAD.

3Proračun laboratorij za znanost i umjetnu inteligenciju, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, SAD.

4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SAD.

5Broad Institut harvarda i MIT-a, Cambridge, Massachusetts, SAD.

Kliknite naCistanche vitamin shop i Cistanche za pamćenje

Sažetak

Epigenomska i trodimenzionalna (3D) - genomska arhitektura pojavljuju se kao ključni čimbenici u dinamičkoj regulaciji različitih transkripcijskih programa potrebnih za neuronske funkcije. Ovdje koristimo sustav označavanja ovisnog o aktivnostima kod miševa za određivanje epigenetskog stanja, arhitekture 3D genoma i transkripcijskog krajolika engramskih stanica tijekom životnog vijekamemorijaformiranje i opoziv. Naši nalazi otkrivaju damemorijakodiranje dovodi do epigenetskog događaja temeljnog premaza, obilježenog povećanom dostupnošću pojačivača bez odgovarajućih transkripcijskih promjena.Memorijakonsolidacija naknadno rezultira prostornom reorganizacijom velikih segmenata kromatina i interakcija promotora i pojačivača. Konačno, s reaktivacijom, engramski neuroni koriste podskup interakcija raspona denovolonga, gdje su temeljni pojačivači dovedeni u kontakt sa svojim promotorima kako bi regulirali gene uključene u lokalno prevođenje proteina u sinaptičkim odjeljcima. Zajednički, naš rad razjašnjava sveobuhvatnu transkripciju i Korisnici mogu pregledavati, ispisivati, kopirati i preuzimati tekst i podatke-rudariti sadržaj u takvim dokumentima, za akademska istraživanja, podložno uvijek potpunim uvjetima upotrebe:http://www.nature.com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*Korespondencija s: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Prilozi autora:

A.M i L.-H.T. konceptualizirao i osmislio projekt. A.M i A.Z izveli su eksperimente u ponašanju, ISH, imunostaining i MARIS analizu. C.A je izvršio injekciju virusa i imunostaininge. A.M i H.S.M izveli su ATAC-seq eksperimente. A.M i A.Z su izvodili nuklearne RNA-seq eksperimente. A.M, H.S.M i V.D izveli su PC-Hi-C i Hi-C eksperimente. A.M, H.S.M, V.D, R.M.R i J.D.V. proveli su ATAC-seq analizu. A.M., R.M.R, H.S.M, V.D i F.G proveli su nuklearnu RNA-seq analizu. A.M, V.D, H.S.M i R.M.R proveli su PC-Hi-C i Hi-C analizu. Svi autori pomogli su u tumačenju podataka. A.M, H.S.M, V.D, R.M.R, J.Z.Y, M.K i L.H.T napisali su rukopis s doprinosom svih autora. L.H.T. je osigurao alate i nadzirao projekt.

Suprotstavljeni interesi:

Autori ne izjavljuju suprotstavljene interese.

epigenomski krajolik kroz životni vijekmemorijaformiranje i opoziv u ansamblu hipokampalnog engrama.

Formiranje i očuvanje dugoročnih sjećanja ovisi o koordiniranoj ekspresiji gena i sintezi sinaptičkih proteina1. Ovi molekularni procesi djeluju unutar određene populacije neurona, koji se nazivaju engramske stanice2–4. Nedavni pristupi koji su koristili izražavanje novinara ovisno o aktivnostima pružili su okvir za istraživanje engramskog ansambla5–8, ali molekularnih mehanizama koji upravljajumemorijaskladištenje i dohvaćanje ostaju slabo shvaćeni. Naime, epigenetske modifikacije i 3D -genomska arhitektura pojavljuju se kao ključni čimbenik dinamičke regulacije ekspresije gena9–17, a sve se više cijeni njihova važnost u neuronskoj funkciji, razvoju i bolesti14, 16, 18

Ovdje smo koristili model miša ciljane rekombinacije u aktivnim populacijama (TRAP)5,6, u kojem su aktivirani neuroni koji izražavaju aktivnost regulirani citoskeletonski pridruženi protein, (Arc) gen, trajno označeni na nedjelotvoran način. Aktivirani neuroni tijekommemorijakodiranje, konsolidacija i opoziv sortirani su i podvrgnuti sekvenciranju nuklearne RNK (nRNA-seq), testu za transpozazi-pristupačni kromatin pomoću sekvenciranja (ATAC-seq) i hvatanju konformacije kromosoma (Hi-C). Naši podaci pokazuju damemorijakodiranje dovodi do povećanja dostupnosti kromatina na razini genoma, bez očekivanih promjena u ekspresiji gena. Nadalje, pokazujemo da je kasna faza konsolidacije memorije bila povezana s re-lokalizacijom velikih segmenata kromatina (pod-odjeljaka) iz neaktivnih u popustljivih okruženja i reorganizacijom krajolika interakcije promotora i pojačivača. Konačno, reaktivacija neurona tijekommemorijaopoziv je povezan s interakcijama denovopromotera i pojačivača, koristeći veliki podskup pojačivača koji su pripremljeni tijekommemorijakodiranje. Ove interakcije promotora i pojačivača povezane su s robusnom promjenom ekspresije gena uključenih u lokalnu sintezu proteina i sinaptičku morfogenezu.

Rezultati

Vremenska i prostorna identifikacija aktiviranih i reaktiviranih engramskih ćelija

Praćenje neuronske aktivnosti tijekom vremena bio je jedan od glavnih izazova pri proučavanju engramskih stanica, jer se markeri za neuronsku aktivnost, poznati kao neposredni rani geni (IEG), vraćaju na polaznu vrijednost ubrzo nakon indukcije1,2. Da bismo prevladali ovo ograničenje, iskoristili smo model TRAP5,6, koji zahtijeva dva transgena, onaj koji izražava CreERT2 od arc promotora ovisnog o aktivnostima i onaj koji omogućuje ekspresiju novinara žutih fluorescentnih proteina (eYFP), na način ovisan o Creu. Primjena tamoksifena (TAM) trap miševima rezultira trajnom oznakom eYFP u aktiviranim Arc neuronima. Bez TAM-a, CreERT2 se zadržava u citoplazmi, a eYFP nije izražen (Prošireni podaci Sl. 1a). TRAP miševi bili su podvrgnuti klasičnoj pavlovskoj paradigmi kondicioniranja kontekstualnog straha (CFC) (Sl. 1a), uobičajenoj metodi proučavanja averzivnih sjećanja19. Otprilike 1,5–2 sata nakon izlaganja FS-u, mozgovi su prikupljeni kako bi se identificirali i) RNA vezni protein fox-1 homolog 3 (Rbfox3) također poznat kao NeuN+ i eYFP+ označeni neuroni koji su se aktivirali tijekom početne izloženosti (Aktivirano-rano), što se može razlikovati od ii) NeuN + / eYFP- neaktivirani bazalni neuroni (Bazalni) (Sl. 1a). Nakon pet dana, u nedostatku dohvaćanja, prikupili smo iii) Neurone NeuN +/eYFP+ koji su označeni na dan treninga, označavajući dugoročnomemorijakonsolidacija (Aktivirano-kasno). U prozoru

različita skupina, miševi su ponovno izloženi uvjetovanom poticaju, a naknadna endogena ekspresija ARC proteina analizirana je 1,5–2 sata nakon ponovnog izlaganja. To je omogućilo identifikaciju iv) dvostruko pozitivnih Neurona NeuN+/eYFP+/ endogenih Arc+ engramskih neurona koji su se aktivirali tijekom treninga i ponovno aktivirali tijekom treningamemorijaopoziv (Ponovno aktiviran). Značajno je da, iako se rekombinacija DNA možda neće u potpunosti pojaviti 1,5–2 h nakon FS-a, primijetili smo visoku ko-lokalizaciju (prosječno 84%) između endogenog arc proteina i izvjestitelja Arc:eYFP (Extended Data Sl. 1b), što je također bilo u skladu s prethodnim izvješćima20.

Da biste potvrdilimemorijakodiranje i opoziv tijekom CFC-a, ponašanje smrzavanja zabilježeno je tijekom treninga i ponovnog izlaganja znakovima koji izazivaju strah (Extended Data Sl. 1c). U skladu s prethodnim publikacijama6,20, naši podaci pokazali su značajno povećanje broja eYFP+ (aktiviranih-ranih i -kasnih) neurona u hipokampusu, u usporedbi s miševima koji su ostali naivni cfc-u u kućnom kavezu (F (2, 70) = 240,3, P<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

Stvaranje memorije povezano je s povećanom pristupačnošću kromatina, pretežno na pojačivačima

Kako bismo bolje razumjeli molekularne sile koje upravljaju različitim transkripcijskim programima, izmjerili smo promjene pristupačnosti kromatina na razini genoma u različitim fazamamemorija. Hipokampalna tkiva su objedinjena, a izolirane jezgre (Prošireni podaci Sl. 2a, Dopunska tablica 1) podvrgnute su pripremi ATAC-seq knjižnice. Analiza diferencijalno dostupnih regija (DAR) (Diffbind, NAČIN DESeq2) između svih populacija (sl. 2a) otkrila je da se većina promjena u stanju kromatina događa tijekom rane faze stvaranja memorije, gdje 7,862 regije širom genoma dobivaju na pristupačnosti (Basal vs. Rana, Dopunska tablica 2). Nasuprot tome, uočili smo relativno minimalne promjene u stanju kromatina pri prijelazu s aktiviranog ranog na aktivirano-kasno (582 DAR-a) i između aktiviranih i reaktiviranih neurona (725 DAR-ova), pri čemu se 48% preklapa između njih (Prošireni podaci Slika 2b). Zanimljivo je da smo utvrdili veliki postotak (52%) stabilno stečenih DAR-ova koji su postali pristupačniji u aktiviranom ranom stanju i ostali dostupni i u aktiviranim i reaktiviranim neuronima (sl. 2b,c; Dopunska tablica 2). Zanimljivo je da su i rane promjene (Basal vs. Early) i stabilno stečene DAR-ove obogaćene za intergene regije, kasne promjene kromatina (rane naspram kasnog i kasnog vs. reaktivirane) uglavnom su obogaćene za promotore, (Sl. 2d).

Funkcionalni uvid omogućen je procjenom načina na koji su DAR-ovi obilježeni različitim histonskim modifikacijama. Prvo smo koristili ChromHMM za uspostavljanje modela stanja kromatina iz dvije neovisne studije koje su koristile rasuto tkivo hipokampusa prije i nakon šoka stopala 21,22. Zatim smo proveli analizu obogaćivanja preklopa (uočenu u očekivanoj raspodjeli) DAR-ova za ta različita stanja i otkrili da su rane promjene kromatina i stabilni DAR-ovi obogaćeni za pojačivače (sl. 2e; Prošireni podaci Sl. 2c, Dopunska tablica 3).

Ovi rezultati su u skladu s prethodnim publikacijama, pokazujući da stimuliranje primarne neuronske kulture izaziva dugotrajnu aktivnost pojačivača12,23. Zatim smo analizirali preklapanje pojedinih stabilnih lokusa s H3K4me1 i H3K27ac21. Ove dvije oznake histona ocrtavaju različite populacije pojačivača, koje se mogu ili "premazati" (samo H3K4me1), "aktivne" (H3K4me1 i H3K27ac) ili "latentne" (bez oznaka)18. Stabilni vrhovi pokazali su raspodjelu na temeljnim i aktivnim pojačivačima (Extended Data Sl. 2d), gdje se predviđalo da će 47% tih mjesta biti "latentno" (nema preklapanja između DAR-ova i histonskih oznaka21 dobivenog 1h nakon FS-a). Kako bismo potvrdili naš model, izvršili smo kromatinsku imunoprecipitaciju (ChIP) za histonske markere H3K4me1 i H3K27ac, nakon čega je uslijedio qPCR. Četiri odabrana mjesta odabrana su iz naše analize modeliranja putivnih pojačivača (Prošireni podaci Slika 2d; Enhancer 1 - predviđeno temeljno premazano, enhancer 2- predviđeno Aktivno, Enhancer 3 i 4 - predviđeno latentno). U dogovoru s našim modelom identificirali smo dva "latentna" lokusa u bazalnom stanju (Pojačivači 3 i 4) koji su se tijekom dana pretvorili u "aktivno" stanjememorijaformacija (sl. 2f). Štoviše, utvrđeno je da je putivni pojačivač 1 "pripremljen" u bazalnom stanju i postao aktivan, gdje je došlo do značajnog stabilnog povećanja markera H3K27ac tijekom kasne faze i opoziva (Sl. 2f). Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da je repertoar novopristupačnih pojačivača proširen u potenciranim engramskim neuronima, gdje su latentne ili temeljne regije dobile oznake H3K4me1 i H3K27ac i tako postale aktivni pojačivači.

Kako bismo razumjeli funkcionalnu ulogu pristupačnih promotora i regija pojačivača, proveli smo analizu obogaćivanja motiva (Dopunska tablica 4.). Naši podaci pokazuju da je većina (70%) motiva o pristupačnim promotorima jednako obogaćena i identificirana u svim fazamamemorija(Prošireni podaci Sl. 2e). Nasuprot tome, većina pojačivača pokazala je različite obrasce motiva koji vežu transkripcijski faktor (TF) u različitim fazama memorije. Zanimljivo je da su sveprisutno izraženi motivi iz Jun Proto-Oncogene, Ap-1 Transkripcijskog faktora Subunit (tj. Jun-Ap1) i obitelji TF-ova Regulatorni faktor X (Rfx) značajno obogaćeni tek nakon početne faze kodiranja (Extended Data Sl. 2e). Ranije je objavljeno da kompleks Jun-Ap1 igra središnju ulogu u odabiru pojačivača i može djelovati kao pionirski TF za definiranje mjesta pojačivača tijekom razvoja mozga i neuronske aktivnosti12,24. Ovi nalazi su u skladu s našim podacima koji su pokazali visok postotak latentnih/temeljnih lokusa u bazalnom stanju (sl. 2f, Prošireni podaci Sl. 2c,d). Stoga se čini da neuronska aktivnost može potaknuti vezivanje Jun-Ap1 na latentne pojačivače, koji zatim regrutiraju modifikatore kromatina koji aktiviraju latentne pojačivače. Slično tome, obogaćivanje motiva transkripcijskog faktora Yin Yang 1 (Yy1) samo u pojačivačima iz ranih i kasnih država sugerira da je promotorska organizacija pojačivača aktivan procesmemorijaformiranje, jer je nedavno objavljeno da Yy1 olakšava formiranje ove dalekometne interakcije25. Zajednički, ovi podaci sugeriraju da je početna fazamemorijaformacija mijenja krajolik pristupačnosti kromatina u aktiviranim neuronima, s dugotrajnim stabilnim promjenama koje se događaju pretežno unutar regija pojačivača.

Dinamičke promjene u prostornoj nuklearnoj arhitekturi i dostupnosti kromatina tijekom početnememorijaformiranje odgovara povećanoj učestalosti interakcija promotora i pojačivača tijekommemorijaopoziv

Nuklearna 3D arhitektura pojavljuje se kao ključni čimbenik u dinamičkoj regulaciji ekspresije gena, u mnogim neuronskim funkcijama26–28. Stoga smo bili zainteresirani za ocrtavanje preciznih promjena koje se događaju u organizaciji prostornog kromatina tijekommemorijaformiranje i konsolidacija. Proizveli smo Hi-C podatke iz bazalnih i eYFP+ označenih neurona (rani i -kasni, Dopunska tablica 5). Kromatin se odvaja u dva prostorno različita podnuklearna odjeljka, "A" i "B", koji odgovaraju transkripcijski aktivnom i neaktivnom kromatinu, odnosno 15, 16,26. Rani dokazi sugeriraju da neuronska aktivnost i vanjska signalizacija mogu potaknuti ponovnu organizaciju 3D -kromatinske arhitekture14,27,28. Naša analiza stanja odjeljka15, 16,26 (sl. 3a–c) otkrila je ponovnu lokalizaciju velikih segmenata kromatina od neaktivnih (B) do popustljivog okruženja (A) (i obrnuto) tijekom početne i kasne faze fazememorijaformiranje (212 segmenata prešlo je s A na B, 127 s B na A, prosječne veličine ~ 436Kbp). Zanimljivo je da je 52% regija u ranoj fazi koje su se prebacile s B na A zadržalo to stanje u kasnoj fazi (tj. ostalo je u državi A, Sl. 3b,c; Dopunska tablica 6). Nadalje, gotovo sve te regije preklapale su se s dobivenim DAR-ovima iz naše analize ATAC-seq, potvrđujući prijelaz potrazdjeljka iz neaktivnog u popustljivo okruženje (Sl.3d). Ovi podaci ukazuju na to da se neki lokusi podvrgavaju prebacivanju ispod odjeljka u različitim fazama memorije i stoga mogu pridonijeti dugoročnim promjenama neuronskih svojstava i funkcija nakon početne aktivacije.

Iako su naši Hi-C podaci sugerirali reorganizaciju velikih razmjera, ostalo je nejasno je li ova preorijentacija omogućila interakciju novih repertoara promotora i pojačivača i fino podešavanje različitih transkripcijskih programa (Sl. 3e). Koristeći tehniku promotora-hvatanja Hi-C (pc-HiC), proučavali smo precizne promjene koje se događaju u interakcijama promotora i pojačivača tijekom procesamemorijaformiranje i opoziv. Za ovu studiju koristili smo prilagođene "mamce" usmjerene na ~5000 promotora29. U dogovoru s prethodnim publikacijama29, otkrili smo ~ 19,000 (po skupini) značajnih promotora-pojačivača (67,5%) i promotora-promotora (46,2%) interakcija (Prošireni podaci Sl. 3a,b).

Budući da bi promotori u mozgu sisavaca mogli biti pod kontrolom više regulatornih elemenata14,30,31, analizirali smo preklapanje između svih pojačivača u interakciji i njihovih promotora. Otkrili smo da je tijekom svakogmemorijafaza, isti promotori češće komuniciraju s različitim podskupom pojačivača (tj. jedinstvenim, bazalnim – 3243, ranim – 7602, krajem – 7028., reaktiviranim – 7244; sl. 4a,b; Prošireni podaci Sl. 3c; Dopunska tablica 7). Ovaj rezultat je u skladu s prethodnim publikacijama koje pokazuju da je više pojačivača koji okružuju nekoliko gena (c-Fos i Arc) ključno za njihovu aktivaciju, a njihova učestalost interakcije s njihovim promotorima mijenja se kao odgovor na različita depolaracijska sredstva u kultiviranim neuronima31. Sud je također utvrdio manji podskup interakcija u kojima su promotori komunicirali s istim pojačivačima u različitim područjimamemorijafaze (tj. uobičajene, ~31% svih interakcija; Dopunska tablica 7). Nadalje, reaktivirani neuroni prikazali su znatno jače rezultate interakcije (prema izračunu Chicaga, sl. 4b; Proširena slika podataka.3d). Stoga, iako je broj jedinstvenih interakcija bio sličan u ranim, kasnim i reaktiviranim stanjima, jači rezultati interakcije ukazuju na to da se specifične interakcije promotora i pojačivača češće javljaju tijekom pamćenja

opoziv. Taj je pojam dodatno potvrđen 3C eksperimentima, s prajmerima dizajniranim za mjerenje učestalosti interakcije između odabranog pojačivača (E) i promotora gena (P) koji kodiraju za eukariotski faktor inicijacije prijevoda 3 podjedinica D (Eif3d) ili receptor glutamata, jonotropni, kainat 3 (Grik3) (Slika 4c). Naši podaci pokazali su da su reaktivirani neuroni imali značajno povećanje učestalosti interakcije između promotora Eif3d i odabranog pojačivača, u usporedbi s drugim populacijama (slika 4c). Zajednički, ovi podaci ukazuju na to da se interakcije promotora i pojačivača češće događaju tijekommemorijaopoziv.

Zatim smo pitali odgovaraju li dinamičke interakcije dugog dometa identificirane putem PC-HiC-a kromatinskim regijama koje postaju pristupačnije, kako je utvrđeno putem ATAC-seq-a. Time bi se potvrdilo da povećana pristupačnost ima funkcionalnu posljedicu u ostvarivanju novih interakcija promotora i pojačivača. Da bismo to postigli, usporedili smo preklapanje između pojačivača u interakciji u svakoj staničnoj populaciji s DAR-ovima (promatranim) ili slučajnim skupom dostupnih genomskih lokusa (očekivanih). Naša analiza otkrila je značajno preklapanje između i dobivenih DAR-ova u aktivnim ranim neuronima i stabilno stečenih DAR-ova s pojačivačima u interakciji, u svim staničnim populacijama (All Ps< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 3e).="" in="" contrast,="" changes="" in="" chromatin="" accessibility="" that="" occurred="" during="" the="" late="" phase="" of="">memorijakonsolidacija i reaktivacija nisu se značajno preklapali s pojačivačima u interakciji (Prošireni podaci sl. 3e). Zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da je povećanje pristupačnosti tijekom kodiranja memorije temeljni događaj i ovi pripremljeni lokusi sudjeluju u de-novo funkcionalnim interakcijama promotora i pojačivača tijekom kasnijih fazamemorijaformacija. Ovaj dinamički krajolik ilustriran je vizualizacijom genomskih regija oko gena za inicijaciju eukariotskog prevođenja 5 podjedinica A (Eif5a) (sl. 4d). Ova vremenska molekularna disekcija životnog vijeka engrama naglašava koliko je koordinirano temeljno premazivanje epigenetičkog stanja stanice tijekommemorijakodiranje i konsolidacija olakšavaju dalekometne interakcije tijekom reaktivacije.