| 1. dio Ekstrakt Herba Cistanche poboljšava mitohondrijske ATP generacije u štakorskim srcima i H9c2 stanicama

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung i Kam Ming Ko

Odjel za biokemiju, Sveučilište znanosti i tehnologije Hong Konga, Zaljev bistre vode, Hong Kong SAR, Kina

Ključne riječi: ATP,Cistanche deserticola, H9c2 stanice, srce, mitohondrije

Sažetak

Istražiti farmakološku osnovu "Yang - okrepljujuće" djelovanje Herbal Cistanche [osušena cijela biljka odCistanche deserticolaY.C. Ma (Orobanchaceae)], u kineskoj medicini, učinci ekstrakta metanola Herbe Cistanche na kapacitet mitohondrijske ATP generacije ispitani su pomoću ex vivo modela srca štakora i in situ H9c2 staničnog testa. Liječenje ekstraktom Herba Cistanche povećalo je kapacitet stvaranja mitohondrijskih ATP-a mitohondrijskih mitohondrijskih karcinoma na način ovisan o dozi kod štakora, kako je procijenjeno mjerenjem in vitro. Stimulacija kapaciteta atp proizvodnje bila je povezana s paralelnim poboljšanjem u transportu mitohondrijskih elektrona podržanih piruvatom, ali ne i subkinatom. Liječenje Herba Cistanche također je povećalo mitohondrijski kompleks I i složene III aktivnosti, pri čemu je opseg stimulacije na složenu I aktivnost veći. Liječenje Herbom Cistanche proizvelo je dozu i vremenski ovisno povećanje kapaciteta mitohondrijske ATP proizvodnje u stanicama H9c2. Rezultati pokazuju da liječenje Herba Cistanche možepovećanje mitohondrijske ATP generacijeu štakorskim srcima ex vivo i H9c2 stanice in situ, vjerojatno krozjačanje oksidativne fosforilacije.

Cistanche može poboljšati rad srca, sniziti krvni tlak i sniziti lipide u krvi

Uvod

"Okrijepljenost Yanga", koja utjelovljuje generalizirano poboljšanje tjelesne funkcije u kineskoj medicini, uključuje korištenje energije u pokretanju različitih biokemijskih procesa.

U tom smislu, ATP, koji je univerzalna valuta energije u poticanju stanične funkcije, uglavnom se generira oksidativnom fosforilacijom u mitohondrijama. Pretpostavili smo da "Yang okrepljuje" biljeposjeduju sposobnost povećanja mitohondrijske sposobnosti generiranja ATP-a(Ko i sur., 2004.). Tome u prilog ide i naše nedavno otkriće da bi "Yang- okrepljujuće", ali ne i "Yin-hranjivo" kinesko tonificirano bilje moglo povećati kapacitet generiranja ATP-a miokarda u mišjim srcima ex vivo (Ko i sur., 2006). Herba Cistanche, osušena cijela parazitska biljka (isključujući cvijet) Cistanche deserticola Y.C. Ma (Orobanchaceae), klasificirana je kao'Yang-okrepljujuća biljka koja tonizira u tradicionalnoj kineskoj medicini (Chen, 1998.), a čini se kao najpopularniji sastojak brojnih kineskih patenata za- mulacije koje se koriste za okrepljivanje Yanga". U Kini i Japanu Herba Cistanche se široko koristi za liječenje mnoštva simptoma nedostatka Yanga. Farmakološke studije pokazale su da Herba Cistanche možečistači slobodnih radikala(Xiong et al., 1996),proizvesti sedativ(Lu, 1998.),antiaging(Lee i dr., 1990.),antinociceptivni i protuupalni učinci(Lin i dr., 2002.), ipoboljšati imunološku funkciju(Wu et al., 2005). Glavni aktivni sastojak Herbe Cistanche jefeniletanoidni glikozidi(Ouyang i sur., 2003), za koje je utvrđeno da imajuantibakterijski, antistresni i antioksidativnisvojstva (Xiong i sur., 1998), kao i anti-apoptotičke učinke na kultivirane neurone (Tian & Pu, 2005). U trenutnoj studiji, kako bi se istražila farmakološka osnova djelovanja Herbe Cistanche koja okrepljuje Yang, ispitani su učinci liječenja Herba Cistanche na kapacitet atp generacije u mitohondrijama izoliranim iz štakorskih srca ex vivo i kultiviranih kardiomiocita H9c2 in situ. Kako bi se istražio biokemijski mehanizam na kojem se temelji djelovanje atp-a za povećanje proizvodnje, učinci liječenja Herba Cistanche na transport mitohondrijskih elektrona i složene aktivnosti I-IV također su ispitani u srcima štakora.

Učinkoviti sastojci Cistanchea mogu očistiti razne aktivne radikale bez kisika

Materijali i metode

Kemikalije, kultura stanica i biljni materijali

ATP, ADP i 3-[4,5-dimetiltiozol-2-yl]-2,5-difenil- tetrazolijev bromid (MTT) kupljeni su od tvrtke Sigma Chemical Co. Otopina Luciferaze (ATPlite) dobivena je od PerkinElmera (Boston, MA, SAD). Dulbeckov modificirani Eagleov medij (DMEM) i fetalni goveđi serum (FBS) kupljeni su od GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, SAD). H9c2 linija ćelija kupljena je od ATTC-a (Rockville, dr. Med., SAD). Herbu Cistanche isporučio je lokalni trgovac biljkama (Lee Hoong Kee). Biljka je autentificirana od strane dobavljača, a uzorak vaučera (HKUSTY00301) pohranjen je na Odjelu za biokemiju Sveučilišta znanosti i tehnologije Hong Konga (HKUST).

Biljna ekstrakcija

Herba Cistanche (100g) izrezana je na male komadiće, a zatim izvađena zagrijavanjem pod refluksom u metanolu od 300 mL pri 65◦C za 2 sata. Postupak je ponovljen dva puta. Udruženi ekstrakt osušen je isparavanjem otapala pod smanjenim tlakom, a ekstrakt metanola Herba Cistanche dobiven je s prinosom od 39% (w/w). Kemijska analiza pokazala je da je metanol ex-trakt Herba Cistanche sadržavao ukupne saponine, ukupne flavonoide, ukupne lignane i polisaharide u koncentracijama od 1,62% (w/w), 0,08%, 0,15%, odnosno 75,6%.

Briga o životinjama

Odrasli muški štakori Sprague-Dawley (8-10 tjedana; 250–300 g) održavani su u ciklusu tamne/ svjetlosti od 12 h u prostoriji s kontroliranom zrakom / vlagom na oko 22◦C i dopuštali su ad libitum za hranu i vodu u ustanovama za njegu životinja na HKUST-u. Eksperimentalne protokole odobrio je Odbor za istraživačku praksu na HKUST-u.

Liječenje lijekovima

Životinje su nasumično podijeljene u skupine, s pet do šest životinja u svakoj. U terapijskim skupinama štakori su intragastrično primijenjeni s ekstraktom metanola Herba Cistanche (otopljeni/suspendirani u vodi) pri povećanju dnevnih doza (0,031–0,5 g/kg) tijekom 3 dana. Kontrolne životinje dobile su samo vodu. Dvadeset i četiri sata nakon posljednjeg doziranja, srce je dobiveno od fenobarbitalno-anesteziranih životinja i podvrgnuto biokemijskoj analizi.

Priprema mitohondrijskih frakcija i mjerenje kapaciteta proizvodnje ATP-a (ATP-GC) ex vivo

Uzorci tkiva lijeve klijetke srca izvađeni su i isprani ledeno hladnim izotoničnim puferom (saharoza od 0,32 M, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4). Srčane mitohondrijske frakcije pripremljene su diferencijalnom centrifugiranjem u izotoničnom puferu na 4◦C. 10% (w/v) srčani homogenat pripremljen je homogenizacijom mljevenog klijetnog tkiva homogenizatorom teflonskog stakla pri 4000 o / min za 20-30 potpunih poteza. Homogenat je centrifugiran na 600 × g tijekom 10 minuta kako bi se uklonile jezgre i ostaci stanica. Supernatant je zatim centrifugiran na 8000 × g 30 minuta kako bi se mitohondrije sedimentirale (Evan, 1992. Kuglice su ponovno potrošene u 1 mL izotoničnog pufera i rekonstituirane mitohondrijske frakcije. Mitohondrijski ATP-GC neobrađenih životinja mjeren je metodom Leung i dr. (2005)

Cistanche polisaharidi mogu odgoditi fiziološku degeneraciju organa i degeneraciju stanične morfologije

Mjerenje transporta mitohondrijskih elektrona

Mjerenje transporta elektrona u izoliranim mitohondrijama, koje se temelji na smanjenju MTT-a, prema[1], formirano je kako ga je opisao Cohen i sur. Mitohondrije su pripremljene u koncentraciji proteina od 1 mg/mL s inkubacijskim puferom (250 mM saharoza, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4). Aliquot (40 μL) mitohondrija pomiješan je sa 100 μL svaki od 15 mM piruvata ili 0,5 mM sukcinata i 0,42 mg/mL MTT. Reakcijska smjesa inkubirana je na 37◦C 10 minuta uz lagano tresenje. Nakon inkubacije, reakcijska smjesa prekinuta je dodavanjem pufera lize od 100 μL (10%, w / v, natrijevog dodecil sulfata i 45% dimetilformamida, prilagođenog pH 4,7 s ledenom octenom kiselinom). Nakon stajanja 5 minuta, očitanja upijanja reakcijske smjese uzeta su čitačem mikrotiterske ploče (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD) i prijavljena kao razlika između 570 nm i 630 nm. Podaci su izraženi kao postotak srednje vrijednosti kontrolne (tj. Herba Cistanche-neliječene) skupine.

Kultura stanica

Stanice H9c2, stalna stanična linija izvedena iz srčanih mioblasta (Hescheler i sur., 1991.), kultivirane su kao monosloji u DMEM-u dopunjene s 10% (v / v) FBS. Medij je sadržavao glukozu (4,5 g/L) i glutamin (4,5 mM), dopunjenu NaHCO3 (17 mM), penicilinom (100 IU/mL) i streptomicinom (100μg/mL). Sve su stanice uzgajane u atmosferi od 5% (v/v) CO2 u zraku na 37◦C. Medij je zamijenjen svježim medijem svaka 2 ili 3 dana. Zalihe stanica uzgojene su u tikvici kulture od 75 cm2 i podijeljene prije ušća u omjeru subkultivacije od 1:10. Za ATP-GC test, H9c2 stanice su zasijane gustoćom od 2,5 × 104 stanice / dobro u ploču od 24 bušotine. Nakon pričvršćivanja stanica, ekstrakt Herbe Cistanche (otopljen u fiziološkoj otopini s fosfatom; PBS) je primijenjen u mediju, a stanice su inkubirane tijekom povećanja vremena (2-16 h). Kontrolne (neobrađene) stanice dobile su samo PBS.

Mjerenje ATP-GC in situ

Nakon naznačenih razdoblja inkubacije s Herbom Ekstrakt cistanca u povećanim koncentracijama (50–300 μg/mL), izvršen je ATP-GC test. Medij aspiriran je, a stanice su tretirane digitoninom (50 μg/mL) u inkubacijskom međuspremniku (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0.5% BSA, pH 7.4) za 3 min na 37◦C. Nakon aspiracije digitonin, glutamat (5 mM), malat (5 mM) i ADP (60 μM) dodani su stanicama za mitohondrijske ATP generacije, koje su praćene u sve većim vremenskim intervalima u rasponu od 0 do 15 min. Reakciju je prekinuo dodavanje 60 μL perklorne kiseline (30%, w/v) i reakcijske smjese su zatim centrifugirane na 600 × g za 10 minuta na 4◦C. Aliquot (120 μL) supernatanta pomiješan je s 90 μL od 1,4 M KHCO3 za neutralizaciju. Smjese su ponovno centrifugirane na 600 × g na 4◦C, a nadnaravi su mjereni za ATP sadržaj kao opisano ranije. ATP-GC neobrađenih ćelija procijenjen je izračunavanjem područja ispod krivulje grafikona (AUC1) iscrtavanje atp generiranog (nmol/mg proteina) protiv vrijeme (0–15 min) i izraženo u proizvoljnim jedinicama. Za Herbu Normalizirane su stanice tretirane cistancheom, vrijednosti AUC1 povećanja vremena inkubacije (3, 5, 7, 10 i 15 min) odgovarajućoj prosječnoj kontrolnoj vrijednosti iz neobrađenih uzoraka i izražena kao posto kontrole. Zatim, područje ispod krivulja (AUC2) grafikona koji iscrtava kontrolne vrijednosti postotka protivno vremenu inkubacije (3–15 min) izračunato je i izraženo u proizvoljnim jedinicama. Podaci Herbe Cistanche -tretirani grupe su izražene kao postotak kontrole iz jednadžba:

[AUC2(HerbaCistanche − tretiran)/AUC2(neliječen)] ×100%

Mjerenja složene I-IV i citratne sintaze aktivnosti

Kompleks transportnog lanca mitohondrijskih elektrona (ETC) I– III aktivnosti mjerene su spektrofotometrijskim metodama pomoću složenih podloga specifičnih (NADH za kompleks Ja, sukminirati za kompleks II, i decylubiquinol za kompleks III) kako je opisano (Grad & Lemire, 2004.; Hsu i sur., 2005; Mark et al., 2001). Složena IV aktivnost mjerena je pomoću komplet za analizu citokroma c oksidaze iz Sigme. Aktivnost sintaze mitohondrijski citrat izmjerena je metodom Srere (1969.).

Analiza proteina

Koncentracije proteina mitohondrijskih frakcija i stanica lizati su određeni pomoću bioradskog testa proteina komplet koji standardno koristi albumin goveđeg seruma (0.038–0.600 mg/mL).

Statistička analiza

Svi su podaci izraženi kao srednja ± standardna pogreška srednja vrijednost (SEM). Analizirani su jednosmjernom analizom varijanca (ANOVA). Post hoc višestruke usporedbe bile su gotovo s LSD-om. P vrijednosti<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Rezultati

Učinci liječenja Herba Cistanche na miokard mitohondrijski ATP-GC u štakora

Kao što je prikazano na slici 1., liječenje ekstraktom Herba Cistanche u dozama do 0,5 g/kg povećalo je mitohondrijski ATP-GC mitohondrijski ATP-GC na način ovisan o dozi kod štakora, s stupanj stimulacije je 89% u dozi od 0,5 g/kg.

Učinci liječenja Herba Cistanche na transport mitohondrijskih elektrona u štakorskim srcima

Opseg transporta elektrona u izoliranim mitohondrijama mjereno je praćenjem smanjenja MTT-a. podloga koja se koristila za analizu bila je piruvat ili sukcinat.

Slika 1.Učinak liječenja Herba Cistanche na mitohondrijski kapacitet generiranja ATP-a u štakorskim srcima ex vivo

Svaka traka predstavlja srednja vrijednost ± SEM, s n = 5. Životinje su oralno tretirane Herbom Cistanche u naznačenim dnevnim dozama tijekom 3 dana. Kapacitet generiranja ATP-a mjeren je kako je opisano u "Materijalima i metodama". Podaci izraženi su u postotskoj kontroli u odnosu na vrijednosti (AUC2) odgovarajuće neliječene kontrolne skupine. ∗Značajno drugačije iz odgovarajuće neliječene kontrolne skupine; značajno različito iz skupine liječene Herbom Cistanche na 0,5 g/kg.

Slika 2. Učinci liječenja Herba Cistanche na transport mitohondrijskih elektrona u štakorskim srcima

Svaka traka predstavlja srednju vrijednost ± SEM, s n = 5. (a) Transport mitohondrijskih elektrona koji se temelji na piruvatu (b) dobiven je mitohondrijskim elektronom koji podržava sukupint, mjeren je smanjenjem MTT-a, kako je opisano u "Materijali i metode". Podaci su izraženi u postotku neobrađene kontrolne vrijednosti [podržane piruvatom: OD570nm− OD630nm = 0.0206 ± 0.0001 (SEM), n = 5; podržana sukminatom: muškarac, 0.255 ± 0.015, n = 5]. ∗Značajno se razlikuje od odgovarajućih neliječenih kontrolna skupina; značajno se razlikuje od skupine od 0,5 g/kg.

Kao što je prikazano na slici 2.a, doza liječenja Herba Cistanche ovisno o povećanju opsega mitohondrijske elektrona transport podržan piruvatom u srcima štakora, s optimalnom stimulacijom vidljivom u dozama od 0,5 g/kg. Međutim, nema značajnih promjena u opsegu mitohondrijskog elektronski transport podržan sukpinatom otkriven je u Herba Cistanche-tretirana srca štakora (Slika 2b).

Za drugi dio,kliknite ovdje.