Dio 1: Uspostavljanje istovremenog eksperimentalnog modela osteoporoze u kombinaciji s Alzheimerovom bolešću kod štakora i dvostrukim učincima ehinakozida i akteozida iz Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
SAŽETAK
Etnofarmakološka relevantnost: Cistanche tubulosadragocjen je tradicionalni kineski lijek koji se široko koristi u liječenju osteoporoze iAlzheimerova bolest. Ehinakozidi akteozid su glavni aktivni sastojci u Cistanche tubulosa koji imaju farmakološke aktivnosti s istraživačkom vrijednošću. Zabilježeno je da ehinakozid iakteozidmože poboljšati sposobnost učenja i pamćenja, potaknuti proliferaciju i diferencijaciju osteoblasta. Cilj istraživanja: Ehinakozid i akteozid izCistanche tubulosasu pokazali značajne aktivnosti protiv osteoporoze i Alzheimerove bolesti, dok ti učinci nisu proučavani istovremeno na modelu štakora. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi i verificirati model osteoporoze u kombinaciji sAlzheimerova bolestkod štakora i istražiti dvostruke učinkeehinakozidi akteozid na ovom paralelnom modelu.
Materijali i metode:Istovremeno su postavljene tri skupine modela ovarijektomije (OVX), lažne operacije s D-galaktozom i AlCl3 (D), ovarijektomije s D-galaktozom i AlCl3 (OVX plus D). Štakori u skupinama liječenim lijekom su ovariektomirani. Tijekom provođenja intraperitonealne injekcije D-galaktoze i intragastrične primjene AlCl3 u štakorima skupina liječenih lijekom, štakori su oralno davaniehinakozid(90 mg/kg/dan),akteozid(90 mg/kg/d) i lijekovi pozitivne kontrole estradiol valerat (0.6 mg/kg/d), odnosno donepezil HCl (0,8 mg/kg/d). Nakon liječenja lijekom od 8 tjedana, najprije je proveden Morrisov vodeni labirint (MWM) test u trajanju od 6 dana. Štakori su potom žrtvovani kako bi se sakupila krv, maternica, femora, tibija i moždano tkivo. Serum je korišten za biokemijske pretrage. Maternice su korištene za histomorfometriju. Desna bedrena kost korištena je za mikro-CTodnosno histomorfometrija. Za biomehanički test korištena je desna tibija. Hipokampus sakupljen na ledenici korišten je za biokemijske testove. Mozak 41 sakupljen perfuzijom korišten je za histomorfometriju.
Rezultati:U usporedbi sa skupinom Sham, skupina OVX plus D mogla je značajno smanjiti sposobnost učenja i pamćenja uzrokujući oksidativno oštećenje, oštećujući neurone u hipokampusu i utječući na hidrolizu i sintezu acetilkolina. U međuvremenu, aktivnosti BALP-a i TRAP-a u skupini OVX plus D značajno su porasle (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">ehinakozidiakteozid, tipična patološka obilježja osteoporoze iAlzheimerova bolestbili poboljšani.
Zaključci:Model osteoporoze u kombinaciji sAlzheimerova bolestkod štakora bio je izvediv i uspješno uspostavljen.Ehinakozidi akteozid su također pokazali neke značajne učinke na ovaj istodobni model, i mogli bi biti potencijalni 56 kandidati izCistanche tubulosas dvostrukim učincima za daljnje proučavanje.
Ključne riječi:osteoporoza; Alzheimerova bolest; dvostruki učinci; ehinakozid; akteozid; Cistanche tubulosa
Cistanche lost empire herbs ublažava Alzheimerovu bolest
1. Uvod
Osteoporoza je degenerativna bolest kostiju karakterizirana progresivnim gubitkom koštane mase i razaranjem mikroarhitekture, što može povećati rizik od prijeloma zbog krhkosti (Rachner i sur., 2011.).Alzheimerova bolest(AD) je česta neurodegenerativna bolest u starijih osoba koju karakterizira kontinuirano mentalno propadanje, kognitivno oštećenje i gubitak sposobnosti samostalnog življenja u kliničkom smislu (Reitz 76 i sur., 2011.). Stvaranje senilnog plaka izazvanog taloženjem -amiloida, neurofibrilarni čvorovi uzrokovani tau hiperfosforilacijom i neuronska degeneracija u mozgu tipične su patološke značajke AD (Serrano-Pozo i sur., 2011.). Površno gledano, OP i AD su potpuno neovisne bolesti s različitom patologijom i kliničkim obilježjima. Međutim, u kliničkoj praksi često se opaža da se OP i AD pojavljuju istovremeno (Zhang i sur., 2001.; Lui i sur., 2003.; Luckhaus i sur., 2009.). Prevalencija obiju bolesti raste s dobi, osobito u žena u postmenopauzi (Li i sur., 2017.; Stern, 2012.). Sve više i više dokaza pokazuje da osobe s dijagnosticiranom AD imaju povećan rizik od OP (Zhou et al., 2014.).
Potrebno je proučiti i razjasniti odnose između osteoporoze iAlzheimerova bolestin vitro i in vivo. Prije izvođenja studija in vivo, važno je odabrati primjenjive životinjske modele osteoporoze ili Alzheimerove bolesti. Model osteoporoze mogao bi se uspostaviti pomoću nekoliko vrsta metoda kao što su intragastrična primjena retinoične kiseline, operacija ovariektomije i intramuskularna injekcija glukokortikoida (Wei i sur., 2007.; Komori, 2015.). Konkretno, model postmenopauzalne osteoporoze izazvan ovariektomijom u štakora bio je klasičan ije naširoko korišten u većini studija (Miao i sur., 2012; Liu i sur., 2017).Sporadična Alzheimerova bolest je glavni tip Alzheimerove bolesti. Životinjamodele SporadicAlzheimerova bolestmogao biti induciran različitim metodama kao što suinjekcija D-galaktoze odn -amiloid, intragastrična primjena AlCl3,i tako dalje(Bagheri i sur., 2011.; Gao i sur., 2015.; Justin Thenmozhi i sur., 2017.). Osim toga,konjunkcijski model Alzheimerove bolesti induciran dugotrajnim intraperitonealniminjekcija D-galaktoze u kombinaciji s ovariektomijom također se dosta proučavala (Liui sur., 2010.; Zhao i sur., 2012). Kako bi se otkrila važnost osteoporoze iAlzheimerove bolesti, potrebno je uspostaviti model kombinirane osteoporozes Alzheimerovom bolešću za proučavanje uobičajenih mehanizama djelovanja lijekovaosteoporoza iAlzheimerova bolestase.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight je parazitska biljka, koja je uglavnom rasprostranjena u pustinjama sjeverozapadne Kine. Osušene sočne stabljikeCistanche tubulosa(CT) koriste se kao poznati tonik lijek pod nazivom Cistanches Herba s kineskim nazivom Roucongrong u Kineskoj farmakopeji (2015). Častili su ga kao "pustinjski ginseng" i široko se koristi za liječenje bolova u struku i koljenima, ženskog steriliteta i zatvora u tradicionalnoj kineskoj medicini (Jiang i Tu, 2009.). Glavni aktivni sastojci CT-a su feniletanoidni glikozidi (PhG), ehinakozid (ECH) iakteozid(ACT) reprezentativni su spojevi u PhG-ovima (Morikawa et al., 2014.). Konkretno, ECH i ACT obično se odabiru kao markeri za kontrolu kvalitete u CT-u zbog njihovog visokog sadržaja i različitih farmakoloških aktivnosti kao što su učinci neuroprotekcije, zaštite kostiju,
antioksidansi, usporavaju starenje i poboljšavaju sposobnost učenja i pamćenja (Wang et al.,2012.; Li i sur., 2016). Međutim, učinci ECH i ACT na osteoporozuu kombinaciji saAlzheimerova bolestjoš nisu proučavani zajedno na modelu štakora.Stoga je svrha ove studije bila uspostaviti kombinirani model osteoporoze kod štakoras Alzheimerovom bolešću i istražiti učinkeehinakozidi akteozid na ovokonkurentni model, kako bi se pružili eksperimentalni dokazi za daljnje proučavanjemolekularni mehanizam ehinakozida ili akteozida u sljedećim istraživanjima.
cistanche pharma specialzaOGLAS
2. Materijali i metode
2.1. Životinje
Osamdeset 8- tjedana starih ženki Wistar štakora (Broj certifikata: SCXK 2018-0006), težine 180~200 g, nabavljene su od kinesko-britanskog SIPPR/BK Laba. Animal Ltd (Šangaj, Kina) i uzgojen u Eksperimentalnom centru za farmaceutske životinje na Kineskom farmaceutskom sveučilištu.
2.2. Kemikalije i reagensi
Kloral hidrat, penicilin G natrij, D-galaktoza, aluminijev klorid heksahidrat, estradiol valerat, donepezil HCl kupljeni su od Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Kina).Ehinakozid(HPLC 94 posto) dobiven je od Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina).Akteozid(HPLC 98 posto) kupljen je od Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kina). Kompleti za alkalnu fosfatazu specifičnu za kosti (BALP), kiselu fosfatazu otpornu na tartarat (TRAP), superoksid dismutazu (SOD), malonaldehid (MDA), acetilkolinesterazu (AChE) i kolin acetiltransferazu (ChAT) enzimski imunoanalizu (ELISA) bili su kupljen od Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Šangaj, Kina). Univerzalni fiksativ za tkivo dobiven je izChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina).
ehinakozid
2.3. Životinjski modeli i tretmani
Sve pokuse na životinjama odobrio je i nadzirao Odbor za etiku životinja Kineskog farmaceutskog sveučilišta. Štakori su držani u ciklusu svjetlo/tama od 12 sati u prostoriji s kontroliranom temperaturom (22±2 stupnja) i hranjeni standardnom peletiranom stočnom hranom i vodom iz slavine.
Nakon prilagodbe od tjedan dana, model osteoporoze je postignut provođenjem operacije ovariektomije (French i sur., 2008). Nakon završetka operacije, penicilin G natrij je jednom posut po šavu rane kako bi se spriječila infekcija. Štakori su potom normalno hranjeni tri tjedna. Prema referenci (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), modelAlzheimerova bolestmože biti izazvan dugotrajnom intraperitonealnom injekcijom D-galaktoze u kombinaciji s ovarijektomijom ili dugotrajnom intragastričnom primjenom AlCl3. Za proučavanje izvedivosti modela osteoporoze u kombinaciji s Alzheimerovom bolešću, tri skupine modela ovarijektomije (OVX skupina), lažne operacije s intraperitonealnom injekcijom 150 mg/kg/dan D-galaktoze i intragastrične primjene 30 mg/kg/dan AlCl3 (D skupina), ovarijektomija s intraperitonealnom injekcijom 150 mg/kg/d D-galaktoze i intragastrična primjena 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX plus D skupina) postavljeni su u ovoj studiji.
Stoga su štakori nasumično podijeljeni u osam skupina (n{{0}} za svaku skupinu) nakon 3 tjedna i oralno liječeni lijekovima tijekom 8 tjedana: Lažna skupina; OVX grupa; D grupa; OVX plus D grupa; skupina za liječenje estradiolvaleratom (EV skupina, OVX plus D plus 0.6 mg/kg/d estradiolvalerat); skupina za liječenje donepezil HCl (DPZ skupina, OVX plus D plus 0,8 mg/kg/d donepezil HCl);ehinakozidskupina za liječenje (ECH skupina, OVX plus D plus 90 mg/kg/d ehinakozid);akteozidskupina za liječenje (skupina ACT, OVX plus D plus 90 mg/kg/dan akteozid). U skladu s načelom pretvorbe ekvivalentne doze za čovjeka i štakora i dozom iz povezane reference (Li et al., 2013.; Gao et al., 2014.), usvojene su doze skupina koje su liječene lijekom u ovoj studiji.
Tjelesna težina svakog štakora mjerena je svaki tjedan. Nakon cjelokupnog liječenja lijekovima u trajanju od 8 tjedana, prvo je učinjen Morrisov vodeni labirint (MWM) test u trajanju od 6 dana. Nakon toga, 6 štakora iz svake skupine je žrtvovano za žetvu materijala. Štakori su anestezirani intraperitonealnom injekcijom od 3.0 mL/kg 10 posto kloralhidrata, a krv je sakupljena iz abdominalne aorte. Krv je stavljena na sobnu temperaturu da se zgruša i centrifugirana na 3500 o/min 10 minuta. Serum je sakupljen u epruvetu za centrifugu od 1,5 mL (NEST Biotechnology) i pohranjen na -80 stupnjeva do upotrebe za biokemijske testove. Zatim su sakupljeni maternica, femora, tibija i moždana tkiva. Maternice su korištene za histomorfometriju. Desna bedrena kost korištena je za mikro-CT i histomorfometriju. Za biomehanički test korištena je desna tibija. Hipokampus sakupljen na ledenici korišten je za biokemijske testove. Nakon toga, druga tri štakora iz svake skupine perfundirana su iz srca fiziološkom otopinom i univerzalnim fiksativom za tkivo kako bi se sakupio mozak za histomorfometriju.
2.4. Morrisov test vodenog labirinta (MWM).
Štakori su bili podvrgnuti prostornom referentnom učenju i testiranju pamćenja u MWM testu nakon 8 tjedana intervencije. MWM test je proveden prema prethodno navedenim metodama (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Ukratko, 5 uzastopnih dana s četiri pokusa po danu, štakori su trenirani da koriste različite vizualne znakove smještene na stijenci bazena kako bi pronašli skrivenu potopljenu platformu (promjer 11 cm, visina 29 cm) u kružnom bazenu (promjer 130 cm, visina 50 cm) ispunjen neotrovnom vodom obojenom karbonskom tintom. Bazen je bio zamišljeno podijeljen u četiri kvadranta, a četiri startne pozicije nalazile su se na sjecištima kvadranata. Platforma se nalazila u središtu jednog od kvadranata i položaj je bio konstantan tijekom ispitivanja. U svakom pokusu štakori su nasumično postavljeni na odabrana mjesta, okrenuti prema zidu bazena. Svaki pokus je prekinut kada je štakor stigao do platforme ili nakon 60 s, a proteklo vrijeme je zabilježeno kao latencija bijega. Štakori koji nisu uspjeli doći do platforme su navedeni na nju. Nakon svakog pokusa na skrivenoj platformi, štakor je ostao na platformi 10 s. Prosječno vrijeme latencije četiri pokušaja dnevno izračunato je kao rezultati treninga. Šestog dana svi su štakori bili podvrgnuti ispitivanju u kojem su plivali 60 s u bazenu bez platforme. Vrijeme prelaska na mjestu platforme i vrijeme putovanja u ciljnom kvadrantu zabilježeni su kao konačni rezultati. Štakori su praćeni kamerom postavljenom na strop neposredno iznad bazena, a svi pokusi su snimljeni i analizirani pomoću programa MORRIS MAZE koji je isporučila Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Peking, Kina)
2.5. Biokemijski test ELISA
Prema uputama proizvođača ELISA kitova, aktivnost alkalne fosfataze specifične za kosti (BALP), aktivnost kisele fosfataze otporne na tartarat (TRAP), aktivnost superoksid dismutaze (SOD) i sadržaj malondialdehida (MDA) u serumu testirani su od strane BioTek Synergy 2 multi-mode čitača mikropločica (BioTek, SAD). Tkiva hipokampusa iz svake skupine isprana su PBS-om (0.01 M, pH 7,4) kako bi se uklonila krv ili nečistoće preostale na površini tkiva. Tkiva hipokampusa s jedne strane izvagana su i zatim izrezana na komade što je moguće manje. Tkiva hipokampusa homogenizirana su u omjeru 1:9 (težina tkiva: volumen PBS-a). Homogenat je centrifugiran na 4 stupnja, 3000 o/min tijekom 15 minuta. Supernatant je sakupljen i razrijeđen za mjerenje koncentracije proteina BCA metodom. Aktivnost acetilkolinesteraze (AChE), aktivnost kolin acetiltransferaze (ChAT), aktivnost superoksid dismutaze (SOD) i sadržaj malondialdehida (MDA) u tkivu hipokampusa zatim su testirani ELISA metodama.
2.6. Histomorfometrija hipokampusa
Tkiva mozga (n=3/skupina) su fiksirana u univerzalnom fiksativu tkiva. Uzorci moždanog tkiva zatim su isprani, dehidrirani gradijentnim etanolom, uklopljeni u parafinski vosak i izrezani na krunske dijelove od 5 μm. Sekcije su obojene hematoksilinom i eozinom (HE). Nakon toga su koronarni presjeci moždanih tkiva fotografirani invertnim fluorescentnim mikroskopom (Nikon, Japan). Posebno su promatrane morfološke promjene CA1, CA2, CA3 i DG u hipokampusu.
2.7. Histomorfometrija i morfometrija maternice
Odabrane maternice (n{{0}}/skupina) fiksirane su u univerzalnom fiksativu tkiva. Uzorci tkiva maternice zatim su isprani, dehidrirani gradijentnim etanolom, uklopljeni u parafinski vosak i izrezani na poprečne dijelove od 5 μm. Sekcije su obojene hematoksilinom i eozinom (HE). Promatrani su i fotografirani poprečni presjeci maternice. Nasumično je odabrano pet vidnih polja, zatim je izmjeren promjer poprečnog presjeka maternice i debljina epitela sluznice maternice pomoću softvera Image-Pro Plus 6.0. Također je izbrojan broj žlijezda maternice u lamini propriji.
2.8. Mikro-CT
Odabrana desna bedrena kost (n=3/skupina) skenirana je u položaju s udaljenosti objekta od izvora od 121 mm i udaljenosti kamere od izvora od 171 mm pomoću SkyScan 1176 micro X- zračna kompjutorizirana tomografija (mikro-CT) skener (Bruker, Njemačka). Distalna ploča za rast odabrana je kao referentna površina. S udaljenosti od 1 mm ispod referentne površine, područje debljine 1,8 mm odabrano je kao volumen od interesa (VOI, 100 slojeva). Dobivene slike u sivim tonovima imale su veličinu piksela od 17,76 μm iz rekonstrukcije kosti (65 kV, 385 μA). Za odabir trabekula iz kortikalne kosti korištena je poluautomatska metoda konturiranja. Izravne 3D metode mjerenja korištene su za procjenu postotka volumena kosti (BV/TV), površinske gustoće kosti (BS/TV), trabekularne separacije (Tb. Sp), trabekularnog broja (Tb. N), trabekularne debljine (Tb. Th) , indeks modela strukture (SMI), faktor trabekularnog uzorka (Tb. Pd) i srednja mineralna gustoća kostiju (srednja BMD) za isti VOI korištenjemCTProgram analizatora (Bruker, Njemačka). 3D vizualizacija VOI-ja pomoću adaptivnog algoritma za renderiranje napravljena je pomoću softvera CTvol (Bruker, Njemačka).
ekstrakt biljke cistanche
2.9. Histomorfometrija kosti
Odabrana desna bedrena kost (n=3/skupina) fiksirana je u univerzalnom fiksativu za tkivo, a zatim dekalcificirana u otopini od 10 posto EDTA-2Na tijekom 3 tjedna. Dekalcificirani uzorci su isprani, dehidrirani gradijentnim etanolom, uklopljeni u parafinski vosak i izrezani na uzdužne dijelove od 5 μm. Sekcije su obojene hematoksilinom i eozinom (HE). Uzdužni presjeci bedrene kosti su fotografirani. Promatrane su strukture koštanog tkiva svake skupine, posebice strukture trabekularne kosti.
2.10. Biomehanički test
Nasumično odabrane desne tibije (n=4/skupina) procijenjene su za test savijanja u tri točke pomoću univerzalnog stroja za testiranje (SHIMADZU, Japan). Promjeri ovih uzoraka izmjereni su pomičnom mjerom u rasponu od 2.16-2.38 mm (d). Uzorak je zatim postavljen na dvije potporne prečke s razmakom od 25 mm (L) između dvije tračnice, a fiziološka zakrivljenost uzorka bila je prema gore. Šipka za opterećenje nalazila se u središtu uzorka i padala je konstantnom brzinom od 1,5 mm/min sve dok se uzorak nije slomio. Podaci o sili (F) i pomaku automatski su snimljeni u računalo koje je bilo povezano sa strojem za ispitivanje, a krivulja opterećenje-deformacija je iscrtana istovremeno. Vrijednosti maksimalnog opterećenja (N) i apsorpcije energije (mJ) istovremeno su zabilježene softverom za ispitivanje materijala TRAPEZIUM X. Vrijednosti maksimalnog naprezanja (MPa) izračunate su prema sljedećoj formuli: Naprezanje (σ)=moment savijanja (M) / Faktor presjeka (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )
2.11. Statistička analiza
Rezultati modelnih skupina uspoređeni su sa skupinom Sham, a rezultati skupina liječenih lijekovima uspoređeni su sa skupinom OVX plus D. Podaci su analizirani pomoću jednosmjerne ANOVA praćene Bonferronijevim testom višestruke usporedbe pomoću softvera Graph Pad Prism 5.0. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD, a P vrijednosti manje od 0.05 smatrane su statistički značajnim.
miricetinicistanche
