Dio 1: Učinci vodenog ekstrakta Cistanche Tubulosa na mikrobiotu crijeva miševa s crijevnim poremećajima

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Poremećaji crijevne mikrobiote povezani su s mnogim bolestima. *e vodeni ekstrakt izCistanche tubulosa (CT), tradicionalna kineska biljna formula, navodno igra ulogu uštiteći ljudska crijeva. Međutim, malo se zna o njegovim učincima na crijevnu mikrobiotu. *Ova studija je provedena kako bi se utvrdilo može li CT vodeni ekstrakt modulirati crijevni mikrobiom kod miševa s crijevnim poremećajima. Utvrdili smo da oštećenimorfologija crijevarezultat liječenja cefiksimom može se spasiti korištenjem CT vodenog ekstrakta. * Usporedba mikrobne raznolikosti između miševa tretiranih CT ekstraktom i kontrolnih miševa također je pokazala da se poremećaj u zajednici mikrobioma modelnih skupina može obnoviti tretmanom s visokim i srednjim koncentracijama vodenog ekstrakta. Liječenje cefiksimom dovelo je do značajnog smanjenja bakterija mliječne kiseline; međutim, dodatak CT vodenog ekstrakta obnovio je rast ovih bakterija mliječne kiseline. Nadalje, CT vodeni ekstrakt uspio je ublažiti dramatične promjene u metaboličkim putovima crijevnog mikrobioma izazvane cefiksimom. *Ova otkrića pružila su uvid u korisne učinke vodenog ekstrakta CT-a na crijevnu mikrobiotu, a također su pružila važnu referencu za razvoj srodnih lijekova u budućnosti.

Cistanche za opuštanje crijeva klikniteovdjeznati više

Uvod

su pokazali da C.deserticola polisaharidiinduciraju melanogenezu umelanociti, smanjuju oksidativni stres [15], ublažavaju kognitivnu disfunkciju reguliranjem antioksidativnih i protuupalnih procesa u štakora [16], štite stanice PC12 od ozljeda izazvanih OGD/RP [17], poboljšavaju apsorpciju ehinakozida in vivo i utječu na crijevnu mikrobiotu [ 18]. Probiotici su živi nepatogeni mikroorganizmi koji imaju zdravstvene prednosti i osiguravaju mikrobnu ravnotežu u gastrointestinalnom traktu kada se daju u odgovarajućim količinama [19]. *mogu pojačati nespecifične stanične imunološke odgovore karakterizirane aktivacijom makrofaga, stanica prirodnih ubojica (NK) i antigen-specifičnih citotoksičnih limfocita T te otpuštanjem različitih citokina na način specifičan za soj i ovisan o dozi [20]. Probiotski sojevi poboljšavaju svojstva crijevnog epitela putem TJ modulacije, a dokazano je da specifični probiotski sojevi reguliraju ekspresiju mucina, čime utječu na svojstva sloja sluzi i neizravno reguliraju imunološki sustav crijeva [21]. Sojevi bakterija mliječne kiseline (LAB) i Bifidobacterium glavni su probiotici koji se koriste u mnogim područjima [22-26]. *njihove su zdravstvene dobrobiti brojne, a njihov antioksidativni kapacitet važan je čimbenik u njihovim zdravstvenim funkcijama[27]. Probiotici mogu kelirati metalne ione kako bi ih spriječili da kataliziraju oksidaciju [28, 29]; također mogu povećati ekspresiju antioksidativnih enzima [30, 31], proizvesti različite metabolite s antioksidativnim djelovanjem [32, 33], posredovati u antioksidativnim signalnim putovima [34-36] i regulirati enzime koji proizvode reaktivne kisikove vrste (ROS) i njihov odgovor crijeva mikroorganizama na oksidativni stres [37]. Nedavna studija pokazala je da polisaharidi CD-a mogu stimulirati rast nekih bakterija mliječne kiseline, što bi moglo koristiti ljudskom zdravlju [38]. Međutim, sadržaj polisaharida u CD-u razlikuje se od onog u CT [7, 39], a ta razlika može dovesti do različitih učinaka na crijevne mikroorganizme. Nadalje, iako CD polisaharidi mogu smanjiti oksidativni stres aktiviranjem puta NRF2/HO-1 [15], učinci pojedinačnih polisaharida mogu se razlikovati od ukupnog učinka višestrukih sastava u CT-u. *nas, potrebno je precizno definirati djelovanje CT vodenih ekstrakata na crijevne mikroorganizme. Osim toga, ventilatori se također mogu oduprijeti oksidativnom stresu [40] i potisnuti upalne odgovore posredovane lipolisaharidom aktiviranjem puta Keap1/Nrf2/HO-1 [41]. *prije je od velike vrijednosti određivanje učinka CT vodenog ekstrakta. Osim toga, učinci određenih sastojaka vodenog ekstrakta CD-a na oksidativni stres i crijevnu floru sugeriraju da bi otpornost na oksidativni stres mogla biti povezana s promjenama crijevne flore. Kako bismo popunili praznine u znanju o gore navedenim temama, istražili smo učinke CTaqueous ekstrakta na crijevnu mikrobiotu miševa s poremećajima crijevne flore. *Ovi rezultati pružit će vrijedne informacije o mogućim mehanizmima kroz koje se mijenja crijevna flora i daje otpornost crijeva na oksidativni stres.

2. Materijali i metode

primjenjivane dnevno u 12:00 h, a ostale tvari primjenjivane su svakodnevno u 15:00 h. Tijekom pokusa, skupine C, D, E i F držane su u modelu stanja crijevnih poremećaja. * Feces je prikupljan svakih sedam dana na sterilnom operabilnom stolu i pohranjen na -20 stupnjeva. 2.4. Histopatološko promatranje debelog crijeva miševa. Na kraju eksperimenta, miševi su ubijeni cervikalnom dislokacijom, a njihov sadržaj debelog crijeva je sakupljen na sterilnom operabilnom stolu i pohranjen na -80 stupnjeva; u isto vrijeme, uzorci tkiva debelog crijeva su fiksirani u 10 posto neutralnom formalinu.*en, uzorci su dehidrirani korištenjem gradijenta koncentracije etanola, hijalinizirani korištenjem ksilena, uklopljeni u parafin, razrezani i obojeni hematoksilin-eozinom. Morfološke promjene na sluznici debelog crijeva promatrane su i uspoređivane optičkim mikroskopom. Izmjerena je duljina resica i dubina kripte u debelom crijevu te je izračunat omjer duljine resica i dubine kripte (V/C vrijednost) (51).2.5. Ekstrakcija DNK i izgradnja knjižnice. DNK je ekstrahirana iz fecesa pomoću EZNA ®Soil DNA Kita (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, SAD) prema protokolu proizvođača. Kvaliteta DNK određena je pomoću fluorometra (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, SAD). Upareni primeri u V3-V4 regiji 16s rDNA dizajnirani su za umnožavanje regije i proizvodnju fragmenata DNA od 466 bp. *prednji početni bio je 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-), a obrnuti početni bio je 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). Svaki PCR volumen bio je 25 µL, sadržavao je 2,5 µL 10 × PCR pufera, 2 µL dNTP-a, 1 µL svakog primera i 20-30 ng uzorka DNA. *en, indeksirani adapteri su pričvršćeni na kraj amplikona za generiranje biblioteka sekvenciranja. *biblioteke su validirane korištenjem QuantiFluor™ fluorometra i kvantificirane na 10 nmol. 2.6. Sekvenciranje gena 16s rRNA i analiza mikrobne zajednice. *e Illumina platforma (Illumina MiSeq) korištena je za dobivanje 2 × 250 bp uparenih podataka. Operativne taksonomske jedinice (OTU) dobivene su pomoću softvera Uparse kroz standardno grupiranje u skupine s 97 posto sličnosti. *Naivni Bayesov algoritam dodjele RDP klasifikatora korišten je za usklađivanje OTU-ova s ​​bazom podataka Greengene Izdanje 13.5 i izvođenje označavanja vrsta. *E alfa raznolikost crijevne mikrobiote izračunata je pomoću Shannonovog i Simpsonovog indeksa, a razlike između skupina analizirane su linearnom diskriminantnom analizom Effffect Size (LEfSe). *e beta raznolikost analizirana je analizom glavnih koordinata (PCoA) Brady–Curtisovih razlika. PICRUSt2 korišten je za procjenu mikrobnog metaboličkog kapaciteta crijevnog mikrobioma [42]. 2.7. Statistička analiza podataka. SPSS 20 korišten je za jednosmjernu ANOVA-u, a eksperimentalni podaci su izraženi kao X ± S; X označava prosječnu vrijednost, a S označava standardnu ​​devijaciju.

Cistanche za jačanje imuniteta

3. Rezultati

3.1. 8 Učinak CT vodenog ekstrakta na morfologiju debelog crijeva* Reprezentativni spojevi (ehinakozid i acetonid) i njihove koncentracije u CT ekstraktu potvrđeni su HPLC-om (Slika S1). Kako bismo odredili učinak vodenog ekstrakta na crijeva, istraživali smo duljinu resica debelog crijeva i dubinu udubljenja nakon tretmana vodenim ekstraktom. *e resice debelog crijeva u skupinama s normalnom i visokom dozom (A, B i D) bile su duže i poput prsta, dok su resice debelog crijeva u modelu i skupinama s niskom dozom (C i F) bile kratke, a vrhovi resice debelog crijeva bile su slomljene (Slika 1). U skladu s tim, visoka doza CT vodenog ekstrakta značajno je povećala duljinu resica debelog crijeva i smanjila dubinu udubljenja kod miševa s crijevnim poremećajima u usporedbi s miševima u modelnoj skupini (P < 0.01).="" nasuprot="" tome,="" dubina="" udubljenja="" nije="" se="" značajno="" razlikovala="" između="" skupine="" s="" visokom="" dozom="" i="" normalne="" skupine="" (p=""> 0,05) (Tablica S1). *ovi rezultati pokazuju da visoka doza CT vodenog ekstrakta može poboljšati morfologiju unutar debelog crijeva miševa s crijevnim poremećajima. 3.2. 8e Učinak CT vodenog ekstrakta na raznolikost crijevne mikrobiote. Proveli smo sekvenciranje gena 16s rRNA kako bismo istražili potencijalni uzrok morfoloških promjena unutar debelog crijeva i istražili promjene u crijevnoj mikrobioti nakon tretmana CT vodenim ekstraktom. Iz neobrađenih podataka dobiveno je prosječno 100 553 efektivnih oznaka, u rasponu od 77 734 do 125 144 (Tablica S2). *jeleni su grupirani u 4932 OTU-a (Tablica S3). Zatim smo analizirali raznolikost crijevne mikrobiote na temelju Tezeja. *e Shannonov i Simpsonov indeks nije pokazao razliku između skupine A (normalno s CT vodenim ekstraktom) i B skupine (normalno bez CT vodenog ekstrakta) (Slika 2(a)). *indicirano je da kod miševa bez liječenja cefiksimom vodeni ekstrakt CT možda nije imao dodatne korisne ili štetne učinke na -raznolikost crijevne mikrobiote. Međutim, raznolikost u modelnoj skupini (C) pokazala je trend pada u usporedbi s onom u normalnim skupinama. *e miševi tretirani visokim i srednjim dozama CT vodenog ekstrakta pokazali su znakove oporavka raznolikosti, dok takav fenomen nije primijećen kod miševa tretiranih niskom dozom CT vodenog ekstrakta (Slika 2(a)). U međuvremenu, PCoA je otkrio da su normalne skupine (A i B) i skupine s crijevnim poremećajima kojima su davane visoke doze (D) i srednje doze (E) CT vodenih ekstrakata imale tendenciju da imaju kraće udaljenosti između uzoraka od onih u modelnoj skupini iu niskim dozama. -doza C Vodeni ekstrakt dodatak skupini (F) (Slika 2(b)). *rezultati su pokazali da CT vodeni ekstrakt može pomoći u poboljšanju raznolikosti crijevne mikrobiote kod miševa s crijevnim poremećajima.

3.3. Promjene u sastavu crijevne mikrobiote tretirane CT vodenim ekstraktom. * Profili sastava mikrobiote uspoređeni su među različitim skupinama. Na razini vrste, relativna brojnost proteobakterija u modelnoj skupini bila je veća od one u drugim skupinama.

Slika 1: *e učinak vodenog ekstrakta Cistanche tubulosa (CT) na morfologiju debelog crijeva: A, normalna skupina kojoj je dodana srednja doza vodenog ekstrakta Cistanche tubulosa (CT); B, normalna skupina; C, skupina modela; D, modelna skupina s dodanom visokom dozom CT vodenog ekstrakta; E, modelna skupina s dodanom srednjom dozom CT vodenog ekstrakta; F, modelna skupina s dodanom niskom dozom CT vodenog ekstrakta. (a) GrupaA. (b) Grupa B. (c) Grupa C. (d) Grupa D. (e) Grupa E. (f ) Grupa F.

(Slika 3(a)). *Povećanje proteobakterija sugerira da je mikrobiom modelnih miševa promijenjen cefiksimom i da bi CT vodeni ekstrakt mogao koristiti crijevnoj mikrobioti budući da je povećana prevalencija proteobakterija središnji biljeg poremećene crijevne flore [43-45]. Osim toga, na razini roda, relativna zastupljenost Lactobacillusa u modelnoj skupini smanjila se u usporedbi s onom u normalnoj skupini i skupini s visokom dozom; međutim, povećao se u usporedbi s onim u skupini sa srednjom i niskom dozom (Slika 3(b)). *ovi rezultati pokazuju da bi ekstrakt visoke doze CTaqueous mogao potaknuti rast nekih bakterija iz roda Lactobacillus. Diferencijalna mikrobiota između ispitivanih skupina dodatno je određena LEfSe analizom. *analiza je pokazala da su se nakon tretmana cefiksimom značajno povećale relativne količine Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales i Chloroflflexi, dok su relativne količine lactobacillusa, Eubacterium_nodatum_skupine, Pseudono cardiales i Christensenellaceae_R-7_skupina značajno smanjena u usporedbi s onima u normalnoj skupini (Slika 4(a)). Zapanjujuće, kada je modelna skupina nadopunjena visokom dozom CT vodenog ekstrakta, relativne količine Muribaculaceae, Lactobacillus, Kin eosporiaceae, Eubacterium no datum skupine i Pedobacter bile su značajno povećane u usporedbi s onima u modelnoj skupini. U međuvremenu, relativna brojnost Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostridium_9 i Candidatus Stoquefifichus značajno se smanjila u usporedbi s onima u modelnoj skupini (Slika 4(b))

Slika 2: Analiza raznolikosti crijevne mikrobiote mišjeg izmeta. (a) -Raznolikost bakterijskih zajednica mjerena Shannonovim indeksom (A) i Simpsonovim indeksom (B); (b) dijagram analize glavnih koordinata (PCoA) koji vizualizira podatke temeljene na Bray–Curtisovim razlikama. A, normalna skupina s dodanom srednjom dozom vodenog ekstrakta Cistanche tubulosa (CT); B, normalna skupina; C, skupina modela; D, skupina modela s dodanom visokom dozom CT vodenog ekstrakta; E, skupina modela s dodanom srednjom dozom CT vodenog ekstrakta; F, skupina modela s dodanom niskom dozom CT vodenog ekstrakta.