1. DIO Echinacoside inhibira otpuštanje glutamata potiskivanjem Ca2 plus ulaska ovisnog o naponu i protein kinaze C u cerebrokortikalnim živčanim završecima štakora

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 i Su Jane Wang 3,*

1 Odjel za anesteziologiju, Far-Eastern Memorial Hospital, Pan-Chiao District, New Taipei City 22060, Tajvan; drluchengwei@gmail.com (CWL); drlin1971@gmail.com (TYL);nskh9450n@yahoo.com.tw (SKH)

2 Odjel za strojarstvo, Sveučilište Yuan Ze, Taoyuan 32003, Tajvan

3 Medicinski fakultet, Katoličko sveučilište Fu Jen, br. 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Tajvan.

Sažetak:Glutamatergički sustav može biti uključen u učinke neuroprotektivnih terapija. Ehinakozid, feniletanoidni glikozid ekstrahiran iz ljekovite kineske biljkeHerba Cistanche,ima neuroprotektivne učinke. Ova studija istraživala je učinke ehinakozida na 4-aminopiridinom izazvano otpuštanje glutamata u završecima cerebrokortikalnih živaca štakora (sinaptosomi). Ehinakozid inhibira Ca^{2 plus}-ovisni, ali ne Ca^{2 plus}-neovisno, 4-aminopiridinom izazvano otpuštanje glutamata na način ovisan o koncentraciji. Echinacoside je također smanjio 4-aminopiridinom izazvan porast slobodnog Ca u citoplazmi^{2 plus}koncentracije, ali nije promijenio potencijal sinaptosomske membrane. Inhibicijski učinak ehinakozida na 4-aminopiridinom izazvano oslobađanje glutamata spriječio je cu-konotoksin MVIIC, blokator širokog spektra kanala Cav2.2 (N-tip) i Cav2.1 (P/Q-tip) , ali je bio neosjetljiv na intracelularni Ca^{2 plus}inhibitori otpuštanja dantrolen i 7-kloro-5-(2-klorofenil)-1,5-dihidro-4,1-benzodiazepin{{ 8}}(3H)-on (CGP37157). Nadalje, ehinakozid je smanjio 4-aminopiridinom induciranu fosforilaciju protein kinaze C, a inhibitori protein kinaze C ukinuli su učinak ehinakozida na otpuštanje glutamata. Prema ovim rezultatima, sugeriramo da je inhibicijski učinak ehinakozida na izazvano oslobađanje glutamata povezan sa smanjenim naponom ovisnim Ca^{2 plus}ulazak i naknadnu supresiju aktivnosti protein kinaze C.

Ključne riječi:ehinakozid; oslobađanje glutamata; cerebrokortikalni živčani završeci; naponski ovisan Ca²plus kanali; protein kinaza C Parkinsonove bolesti, Alzheimerove bolesti i okluzije srednje cerebralne arterije[9-12]. Međutim, mehanizam putem kojeg ehinakozid inducira neuroprotekciju nije u potpunosti shvaćen.

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Ehinakozidu cistanche imaju mnoge funkcije

1. Uvod

Ehinakozidje glavni feniletanoidni glikozid prisutan uHerba Cistanche, poznata tradicionalna kineska medicina koja se koristi za liječenje zaboravnosti, impotencije i kroničnog zatvora [1].Ehinakozidposjeduje različite bioaktivnosti kao što su antioksidacijska, protuupalna, antikancerogena, hepatoprotekcija i imunološka modulacija [2-4]. Posebno,ehinakozidima neuroprotektivne učinke; na primjer, može zaštititi od neurotoksičnosti izazvane oksidativnim stresom ili neurotoksinima u primarnim kortikalnim neuronima štakora, stanicama ljudskog neuroblastoma SH-SY5Y i stanicama feokromocitoma (PC12) [5-8]. Nadalje,ehinakozidublažava oštećenje mozga i poboljšava kognitivnu funkciju u životinjskim modelima Parkinsonove bolesti, Alzheimerove bolesti i okluzije srednje cerebralne arterije [9-12]. Međutim, mehanizam kroz kojiehinakozidizaziva neuroprotekciju nije u potpunosti shvaćen.

Neuroprotekcija je složen proces očuvanja neuronske strukture i funkcije nakon toksičnih inzulta. Smanjenje ekscitotoksičnosti glutamata smatra se potencijalnim mehanizmom uključenim u neuroprotekciju mozga. Glutamat, neurotransmiter ekscitatorne aminokiseline, ima ključnu ulogu u nekoliko funkcija mozga [13]. Međutim, prekomjerna aktivacija glutamatnih receptora pod visokim koncentracijama glutamata uzrokuje intracelularno Ca2 plus preopterećenje, disfunkciju mitohondrija, proizvodnju slobodnih radikala i smrt neurona [14,15]. Ovaj patološki proces povezan je s brojnim poremećajima mozga, uključujući cerebralnu ishemiju, traumatsku ozljedu mozga, epilepsiju i neurodegenerativne bolesti [16,17]. Stoga se inhibitori koji blokiraju patofiziološki glutamatergički prijenos smatraju potencijalnim neuroprotektivnim lijekovima. Značajni primjeri toga su antagonisti glutamatnih receptora [18,19]; međutim, klinička ispitivanja ovih lijekova nisu uspjela zbog manje učinkovitosti i neželjenih ili čak citotoksičnih nuspojava [20,21]. Uz izravnu blokadu receptora glutamata, inhibicija otpuštanja glutamata može biti učinkovita strategija za neuroprotekciju. Nekoliko neuroprotektora (npr. memantin i riluzol) mogu smanjiti oslobađanje glutamata u moždanom tkivu štakora [22-24].

Uzimajući u obzir ulogu glutamata u ekscitotoksičnosti i neuroprotektivni profilehinakozid, u ovoj studiji korišteni su izolirani živčani završeci (sinaptosomi) pročišćeni iz cerebralnog korteksa štakora kako bi se istražio učinakehinakozidna otpuštanje glutamata i dalje istraživao potencijalne mehanizme. Izolirani pripravak živčanog završetka dobro je uspostavljen model za proučavanje presinaptičke regulacije otpuštanja neurotransmitera lijekovima u odsutnosti bilo kakvih postsinaptičkih učinaka [25]. Korištenjem ovog modela procijenili smo učinakehinakozidna otpuštanje glutamata, membranski potencijal, presinaptički Ca2 plus influks i aktivnost protein kinaze C. Prema našem pregledu literature, ovo je prvo izvješće koje dokumentira mehanizam kroz kojiehinakozidinhibira endogeno oslobađanje glutamata na presinaptičkoj razini.

Echinacoside može antioksidirati

2. Rezultati

2.1. EhinakozidInhibira 4-oslobađanje glutamata izazvano aminopiridinima iz cerebrokortikalnih živčanih završetaka štakora smanjenjem vezikularne egzocitoze

Slika 1 ilustrira učinak ovisan o koncentracijiehinakozidna {{0}}aminopiridinom izazvanom oslobađanju glutamata iz pročišćenih cerebrokortikalnih sinaptosoma štakora. U sinaptosomima inkubiranim s 1 mM CaCl2, 1 mM 4-aminopiridina izazvao je otpuštanje glutamata od 7,4 ˘ 0,1 nmol/mg/5 min, koje je smanjeno za 1, 5, 10, 30 i 50 µMehinakoziddo 6,5 ˘ 0.2, 5,8 ˘ 0.3, 4,8 ˘ {{10}}.2, 4,1 ˘ 0.1, ili 2,3 ˘ 0,4 nmol/mg/5 min, redom (F(5,24)=67.1, p=0.000). Vrijednost IC50 zaehinakozid-posredovana inhibicija 4-aminopiridinom izazvanog otpuštanja glutamata, izvedena iz krivulje doza-odgovor, bila je 24 µM. Štoviše, oslobađanje glutamata izazvano 1 mM 4-aminopiridina u izvanstaničnoj otopini bez Ca2 plus koja sadrži 300 µM etilen glikol bis(-aminoetil eter)-N,N,N1,N{{ 13}}tetraoctena kiselina (EGTA) bila je 2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000), a ovaj Ca2 plus -neovisna komponenta 4-aminopiridinom izazvanog otpuštanja glutamata nije utjecalo na 20 µMehinakozid(1,8 ˘ 0.2 nmol/mg/5 min; p=0.58; Slika 1). U sinaptosomima tretiranim s 0.1 µM bafifilomicinom A1, inhibitorom vezikularnog transportera [26], 4-aminopiridinom izazvano otpuštanje glutamata bilo je značajno smanjeno (2,2 ˘ 0.2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249.518, p=0.000). U prisutnosti bafifilomicina A1, 20 µM ehinakozid nije uspio značajno inhibirati oslobađanje glutamata (2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; slika 1). Nasuprot tome, 10 µM DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA, inhibitor ponovne pohrane glutamata) [27], povećalo je otpuštanje glutamata izazvano 4-aminopiridinom na 11,8 ˘ 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=´11.31, p=0.000). Čak iu prisutnosti DL-TBOA, 20 µMehinakozidznačajno inhibira {{0}}aminopiridinom izazvano otpuštanje glutamata (7,7 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p=0.{{ 12}}; Slika 1)

2.2. EhinakozidSmanjuje citosolni Ca²plusKoncentracija, ali ne mijenja sinaptosomsku

Membranski potencijal

Depolarizacija sinaptosoma uzrokovana 1 mM 4-aminopiridina povećala je Ca²plus koncentracija(p= 0.000; Stol 1). Primjena 20 |vMehinakozidnije značajno utjecao na baralni Ca²plus koncentracija (t(8) = 0.06, p= 0.95), ali je značajno smanjio 4-aminopiridinom izazvan porast iia Ca²plus koncentracija (t(10) = 6.16, p =0.000). Osim toga, 1 mM 4-aminopiridina povećao je 3',3',3'-dipropiltiadikarbocijanin jodid [DiSC₃(5)] fluorescencija (p= 0.000). Dodatak o⁽20 fdM ehinakozid nije promijenio potencijal membrane u mirovanju (t(8)=0.976,p= 0.36) ili značajno promijeniti povećanje DiSC-a posredovano 4-aminopiridinom₃(5) fluorescencija (t(8) = —0.014, p= 0.99; Stol 1).

Cistancheehinakozidmože liječiti bolest bubrega

2.3. Sniženi- CO2 plusUlaz kroz kanale Cav2.2 (N-tip) i Cav2.1 (P/Q-tip) može biti povezan s inhibicijom 4-oslobađanja glutamata izazvanog aminopiridinomEhinakozid

Lik 2 pokazuje da 2 cu-konotoksin MVIIC, N-i P / Q-tip Ca²plus blokator kanala,

smanjeno {{0}}aminopiridinom izazvano otpuštanje glutamata sa 7,4 土 0.2 na 2.0 土 0,1 nmol/mg/5 min (t(9) = 25.35, p{{0}}.000). U prisutnosti cu-konotoksina MVIIC, učinak 20 pM ehinakozida na 4-aminopiridinom izazvano otpuštanje glutamata nije bio značajan (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min;t(8) = 1.06, p= 0.32). Dantrolen (10 ^M), inhibitor intracelularnog Ca²plus otpuštanje iz endoplazmatskog retikuluma [28], smanjeno 4-aminopiridinom izazvano otpuštanje glutamata (5,6 土 0.3 nmol/mg/5 min; F(2,14)=104. 95,p= 0.000). Međutim, u prisutnosti dantrolena, 20 pJMehinakozidjoš uvijek može značajno inhibirati otpuštanje glutamata (3,3 土 0.2 nmol/mg/5 min;p= 0.000). Slični rezultati uočeni su korištenjem 100 pM 7-kloro-5-(2-klorofenil)-1,5-dihidro-4,1-benzotiazepina -2(3H)-on (CGP37157), membranski blokator mitohondrijskog Na^plus/oko²plus razmjena. U pet ispitanih sinaptosomskih pripravaka 20 pMehinakozidu kombinaciji sa 100 pM CGP37157 smanjio je 4-aminopiridinom izazvano otpuštanje glutamata za 48,3 posto 土 5,2 posto (F(2,13) ​​= 136.79,p= 7.000), slično inhibiciji samo ehinakozidom (46,2 posto 土 2,3 posto;p = 0.89;

2.4. EhinakozidInhibira 4-izazvano aminopiridinima (oslobađanje glutamata putem signalizacije putem protein kinaze C

Kao što je prikazano na slici 3, 10 stupnjeva jlM 2-[1-(3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimid (GF109203X), opći inhibitor protein kinaze C [29], smanjen 4-aminopiridinom izazvano otpuštanje glutamata (F(2,13) ​​= 19.46, p=0 .000). U sinaptosomima tretiranim GF109203X, 20 pM ehinakozida smanjilo je 4-aminopiridin-izazvano otpuštanje glutamata za samo 5,5 posto 土 1,8 posto (p=0.89), manje nego samo ehinakozid (42,4 posto 土 2,3). postotak; p=f.000). Slični rezultati dobiveni su s 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-okso-12H-indolo[2,3-a]pirolo[3 ,4-c]karbazol-12-propannitril (Go6976), selektivan za izoforme protein kinaze C ovisne o Ca2 plus (a, |3I, |3II, y) [29]. U prisutnosti 3 uM Go6976, 20 uMehinakozidsmanjeno otpuštanje glutamata za 11,9 posto 土 2,9 posto (p=0.59), što označava značajno smanjenje u usporedbi s onim samo ehinakozidom (42,4 posto 土 2,3 posto; p=0.000; slika 3). Nasuprot tome, 3 pM rottlerina, inhibitor protein kinaze C6 neovisan o Ca2 plus [30], nije značajno promijenio otpuštanje glutamata izazvano 4-aminopiridinom (1 mM) (p=0.45). Unatoč tome, u prisutnosti rottlerina, 20 pM ehinakozida učinkovito je uzrokovalo prosječnu inhibiciju od 37,1 posto 土 5,6 posto otpuštanja (F(2,13) ​​= 19.72, p=0.{{33 }}), slično kao kod samog ehinakozida (p=0.41; Slika 3). Osim toga, inhibitor protein kinaze aktiviran mitogenom 2-(2-amino-3-metoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on) (PD98059 ) (50 pM) i inhibitor protein kinaze A N-[2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-izokinolinsulfonamid (H89) (100 pM) smanjili su 4-aminopiridinom izazvano oslobađanje glutamata (p=0.000). Čak i u prisutnosti PD98059 ili H89, 20 pMehinakozidučinkovito smanjio otpuštanje (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; Slika 3).

Slika 4 pokazuje da je 11 mM 4-aminopiridina povećalo fosforilaciju protein kinaze C u sinaptosomima (t(4) = —6.871, p= 0.002). Kada su sinaptosomi prethodno tretirani s 20 pM ehinakozida 10 minuta prije dodatka 4-aminopiridina, 4-aminopiridinom inducirana fosforilacija protein kinaze C znatno se smanjila (F(2_a6) = 29.202, p = 0.00 1).

Ehinakoziducistanchemože potaknutiimunološki sustav

2.5. Ehinakozid- Posredovana inhibicija otpuštanja glutamata ne uključuje gama-aminomaslačnu kiselinu tipa A (GAB³A_A) Receptor

Na slici 5, učinak ehinakozida na 4-aminopiridinom izazvano oslobađanje glutamata u odsutnosti ili prisutnosti SR95531 (antagonista GABA_Areceptor) je uspoređivan. Dodatno, 100 pM SR95531 nije značajno promijenilo otpuštanje glutamata izazvano 4-aminopiridinom (1 mM). u

SR{0}}tretiranim sinaptosomima, primjena 20 pM ehinakozida rezultirala je 43-postotnom inhibicijom otpuštanja glutamata izazvanog 4-aminopiridinom (F(2,12)=42).63,p= 0.000), koja se nije značajno razlikovala od inhibicije koju je proizveo sam ehinakozid (40 posto;p= 0.000). Sličan rezultat dobiven je s drugim antagonistom GABAa receptora, bikukulinom (50 pM). Oslobađanje mjereno u prisutnosti bikukulina i