1. DIO Ehinakozid izaziva vazorelaksaciju plućne arterije štakora otvaranjem kanala NO-cGMP-PKG-BKCa i smanjenjem intracelularne razine Ca2 plus

Kako ehinakozid izaziva vensku relaksaciju?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Odjel za farmakologiju, Škola znanosti o životu i biofarmaceutike, Farmaceutsko sveučilište Shenyang, Shenyang 110016, Kina; 2 Istraživački centar za visinsku medicinu, Medicinski fakultet Sveučilišta Qinghai, Xining 810001, Kina; 3 Farmaceutski fakultet, Sveučilište Qinghai za nacionalnosti, Xining 810007, Kina; 4 Qinghai ulazno-izlazna inspekcija i karantenski ured, Xining 810001, Kina

Cilj:Dugotrajna plućna vazokonstrikcija kakva se javlja na velikoj nadmorskoj visini može dovesti do plućne hipertenzije (PH). Glavna svrha ove studije je istražiti vazorelaksirajući učinakehinakozid(ECH), feniletanoidni glikozid iz tibetanske biljke Lagotis brevituba Maxim iCistanche tubulosa, na plućnu arteriju i njezin potencijalni mehanizam.

Metode:Prstenovi plućne arterije dobiveni od mužjaka Wistar štakora suspendirani su u komorama organa ispunjenim Krebs-Henseleit otopinom, a izometrijska napetost je izmjerena korištenjem pretvarača sile. Intracelularne razine Ca2 plus izmjerene su u kultiviranim glatkim mišićnim stanicama plućne arterije štakora (PASMC) pomoću Fluo 4-AM.

Rezultati: ECH(30-300 µmol/L) opustile su plućne arterije štakora unaprijed kontrahirane noradrenalinom (NE) na način ovisan o koncentraciji, a taj se učinak mogao primijetiti i u intaktnom endotelu i u prstenovima ogoljenim endotelom, ali sa znatno nižim maksimalnim odgovorom i viši EC50 u prstenovima ogoljenim endotelom. Ovaj učinak značajno su blokirali L-NAME, TEA i BaCl2. Međutim, IMT, 4-AP i Gli nisu inhibiraliECH- izazvano opuštanje. Pod izvanstaničnim uvjetima bez Ca2 plus, maksimalna kontrakcija smanjena je na 24,54 posto ±2,97 posto i 10,60 posto ±2,07 posto u prstenovima tretiranim sa 100 odnosno 300 μmol/L ECH. Pod uvjetima izvanstaničnog priljeva kalcija, maksimalna kontrakcija smanjena je na 112,42 posto ±7,30 posto, 100,29 posto ±8,66 posto i 74,74 posto ±4,95 posto u prstenovima tretiranim s 30, 100, odnosno 300 μmol/L ECH. Nakon što su stanice napunjene s Fluo 4-AM, srednji intenzitet fluorescencije bio je manji u stanicama tretiranim sECH(100 μmol/L) nego kod NE.

Zaključak: ECHpotiskuje NE-induciranu kontrakciju plućne arterije štakora putem smanjenja intracelularnih razina Ca2 plus, te inducira njezino opuštanje putem NO-cGMP puta i otvaranjem K plus kanala (BKCa i KIR).

Ključne riječi:Tibetanska biljka;ehinakozid; plućna hipertenzija; velika nadmorska visina; vazorelaksacija; NE; BKCa; KIR; arterijski prsten; glatke mišićne stanice plućne arterije.

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima mnoge učinke, kliknite ovdje da biste saznali više

Uvod

Trajna plućna vazokonstrikcija kakva se javlja na velikoj nadmorskoj visini može dovesti do plućne hipertenzije (PH) i medijalne hipertrofije[1], koje su identificirane kao glavni uzrok hipertrofije desne klijetke i zatajenja srca[2]. Pojedinci koji žive na velikoj nadmorskoj visini, bilo privremeno ili trajno, mogu imati blagu do umjerenu plućnu hipertenziju, a oni s većom osjetljivošću na hipoksiju mogu imati pretjeranu plućnu vazokonstrikciju, što dovodi do raznih bolesti na velikim visinama koje su povezane sa značajnim pobolom i smrtnošću, kao što su npr. plućni edem na velikoj nadmorskoj visini i bolesti srca[3].Ehinakozid(ECH) (Slika 1) je afeniletanoidni glikozidnalazi se u raznim kineskim biljkama kao što su tibetanska biljka Lagotis brevituba Maxim iCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim je vrsta Lagotis spp. koja pripada Scrophulariaceae i raste široko na nadmorskoj visini od preko 3000 metara na visoravni Qinghai-Tibet.ECHima različita poželjna farmakološka svojstva, kao što su antioksidativna, protuupalna, neuroprotektivna, hepatoprotektivna i svojstva hvatanja radikala dušikovog oksida (NO) [6]. Također može izazvati opuštanje ovisno o endotelu u prstenovima torakalne aorte štakora i izliječiti kardiovaskularne bolesti[7]. Međutim, prema našim saznanjima, nije bilo studije koja bi istraživala njegove učinke na vaskularni tonus u plućnim arterijama. Svrhe ove studije su sljedeće: (1) istražiti izaziva li ECH in vitro vazorelaksaciju u plućnim arterijama štakora prethodno kontrahiranim noradrenalinom (NE) i je li taj učinak, ako postoji, ovisan o endotelu ili djeluje izravno na vaskularne glatke mišiće ; (2) istražiti učinak ECH na izvanstanični priljev kalcija i intracelularno otpuštanje kalcija u glatkim mišićnim stanicama plućne arterije štakora (PASMC); i (3) identificirati moguće putove i K plus kanale uključene u relaksaciju izazvanu ECH.

Materijali i metode

Reagensi

ECH je ljubazno osigurao dr. Peng-fei TU sa Pekinškog sveučilišta (Peking, Kina), s čistoćom većom od 98 posto kako je utvrđeno tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti. Dimetil sulfoksid (DMSO) je kupljen od Solar Science & Technology Co, Ltd (Peking, Kina); NE, acetilkolin (ACh, veći ili jednak 99 posto), indometacin (IMT), Nω -Nitro-L-arginin metil ester hidroklorid (L-NAME), tetraetilamonijev klorid (TEA), barijev klorid (BaCl2), {{ 9}}aminopiridin ({{10}}AP) i glibenklamid (Gli) od Sigma Chemical Co (St Louis, MO, SAD); visoko-glukozni Dulbeccov modificirani Eagleov medij (DMEM), fetalni goveđi serum (FBS) i tripsin od Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, SAD); mišje protutijelo protiv primarnog glatkog mišićnog aktina (-SMA) i kozje anti-mišje sekundarno protutijelo od Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, Kina); Fluo indikatori kalcija (Fluo 4-AM) od Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, SAD); i sve anorganske soli od Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Peking, Kina). IMT je otopljen u DMSO i 5 posto NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM i ECH su otopljeni u DMSO, a svi ostali reagensi su otopljeni u Krebs-Henseleit (KH) ili PBS otopini. Preliminarni pokusi pokazali su da DMSO u koncentraciji manjoj od 0,1 posto (v/v) nije imao učinka na razvoj napetosti izoliranih prstenova plućne arterije.

Pokusne životinje

Sve postupke i protokole odobrio je Odbor za brigu i korištenje životinja Medicinskog fakulteta Sveučilišta Qinghai. Muški Wistar štakori, stari 6-8 tjedana, tjelesne težine 250-300 g, kupljeni su od Centra za životinje Sveučilišta Lanzhou (Lanzhou, Kina) i držani na standardnoj laboratorijskoj prehrani i vodi iz slavine ad libitum na temperaturi okoline od 22± 2 stupnja i relativna vlažnost od 45 posto – 55 posto tijekom cijelog eksperimenta.

In vitro perfuzija plućne arterije

Priprema plućnih arterijskih prstenova štakora

Štakori težine 250–300 g anestezirani su intraperitonealnom injekcijom natrijeva pentobarbitala (40 mg/kg), a zatim su im srca i pluća izvađena i odmah uronjena u ledeno hladnu otopinu KH koja je sadržavala (u mmol/L) : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4.7H20, 1,2 KH2P04, 25 NaHC03 i 11,1 glukoze (pH 7,4). Intrapulmonalne arterije (0,7-1,5 mm u promjeru) su secirane bez okolnog vezivnog tkiva i adventicije, a zatim izrezane u prstenove duljine približno 2-3 mm. Prstenovi su suspendirani u komorama organa napunjenim s 10 mL otopine KH na 37 stupnjeva i oplinjeni s 95 posto O2–5 posto CO2 [8], a izometrijska napetost je izmjerena pomoću pretvarača sile (JH-2, Space Medico - Inženjerski institut, Peking, Kina)

Procjena aktivnosti žilnog prstena i procjena endotelne funkcije

Prstenovi posuda ostavljeni su da se uravnoteže 2 h pod bazalnom napetosti od 400 mg, za koje vrijeme je otopina KH mijenjana svakih 15 minuta; zatim je 1 μmol/L NE dodan u komoru za procjenu aktivnosti svakog prstena detekcijom postotka kontrakcije. Prije i nakon eksperimentalnog protokola mjeren je postotak kontrakcije (Slika 2A i 2B). Endotel je uklonjen u nekim prstenovima nježnim trljanjem površine intime finom čeličnom žicom, a cjelovitost je kvalitativno procijenjena pomoću stupnja opuštanja uzrokovanog ACh (10 μmol/L) u postotku kontraktilnog tonusa induciranog NE (1 μmol/L). Ako je opuštanje s ACh bilo veće od 80 posto, endotel je ostao u dobrom stanju; ako je opuštanje bilo manje od 30 posto, endotel je bio uništen (Slika 2A i 2B)[9].

Izolacija i kultura štakorskih PASMC

Distalne plućne arterije izolirane su iz plućnih režnjeva štakora, a endotel i adventicija pažljivo su uklonjeni. Nakon što su tkiva usitnjena u komade od {{0}} mm, odmah su dodana u tikvice, održavana na 37 stupnjeva i 5 posto CO2 u vlažnom inkubatoru otprilike četiri sata, a zatim uzgajana s DMEM s visokim sadržajem glukoze nadopunjen s 20 posto FBS-a, 100 U/mL penicilina i 100 U/mL streptomicina otprilike pet dana. Polovica medija kulture zamijenjena je svježim medijem kada su se stanice pojavile. Kada su stanice dosegle 80 posto konfluencije, sakupljene su s 0,125 posto tripsina i posađene u tikvice (omjer 1:2) koje sadrže DMEM s visokim sadržajem glukoze uz dodatak 10 posto FBS-a, 100 U/mL penicilina i 100 U/mL streptomicina . Za sve eksperimente korištene su stanice s tri do osam prolaza.

Identifikacija PASMC imunohistokemijom

PASMC su bili pozitivni na imunokemijsko bojenje kada su opažene tipične karakteristike "brda i doline". Stanice su nasađene u 6-pločice s jažicama sa staklenim pokrovnim stakalcima. Kada su stanice dosegle 80 posto konfluencije, fiksirane su u 4 posto paraformaldehida, blokirane s 3 posto vodikovim peroksidom 15 minuta, a zatim inkubirane s mišjim anti-štakorskim primarnim -SMA protutijelom preko noći na 4 stupnja. Nakon što su isprane tri puta u PBS-u tijekom 10 minuta, stanice su inkubirane s kozjim anti-mišjim sekundarnim protutijelom na sobnoj temperaturi tijekom 45 minuta, ponovno isprane tri puta u PBS-u tijekom 10 minuta i vizualizirane s diaminobenzidinom.

Detekcija intracelularne koncentracije kalcija u PASMC štakora

PASMC su nasađeni u {{0}}pločice s jažicama sa staklenim pokrovnim stakalcima. Kada su stanice dosegle 80 postotnu konfluenciju, medij kulture zamijenjen je DMEM-om bez seruma. Dvadeset i četiri sata kasnije, stanice su napunjene sa 7 μmol/L Fluo 4-AM na 37 stupnjeva tijekom 30 min u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2. Preostala boja isprana je Hanksovom otopinom uravnotežene soli (HBSS) koja sadrži sljedeće (u mmol/L): 1,26 CaCl2, 0,49 MgCl2·6H2O, 0,41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 i 5,56 D-glukoze, bez fenol crvenog. Stanice napunjene Fluo 4-AM bile su izložene jednom od tri uvjeta liječenja: (1) kontrolna skupina (con group), u kojoj su stanice bile inkubirane s DMEM-om bez seruma; (2) skupina NE, u kojoj su stanice inkubirane s DMEM bez seruma uz dodatak 1 μmol/L NE tijekom 10 minuta; i (3) skupina NE plus ECH (100 μmol/L) (skupina NE plus ECH100), u kojoj su stanice inkubirane s DMEM bez seruma uz dodatak 1 μmol/L NE tijekom 10 minuta i 100 μmol/L ECH 20 min. Intenzitet fluorescencije promatran je i fotografiran fluorescentnom mikroskopijom (IX71, Olympus, Tokyo, Japan)[11]. Za svaki uzorak prikupljeno je šest vidnih polja (200x). Unutarstanična koncentracija kalcija kvantificirana je mjerenjem srednjeg intenziteta fluorescencije pomoću softvera Image Pro-Plus 6.0.

Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost±SD. Kada je odgovarajuća, značajna razlika procijenjena je Dunnettovim testom ili Student-Newman-Keulsovim testom za višestruke usporedbe nakon jednosmjerne analize varijance (ANOVA). Razina vjerojatnosti P<0.05 was="" considered="">

Rezultati Vazorelaksantni učinci ECH na izoliranu plućnu arteriju

Na početku eksperimenta, kumulativni dodatak ECH od 30 do 300 μmol/L nije imao značajan učinak na bazalnu napetost plućne arterije. Nakon što je NE-inducirana vazokonstrikcija dosegla plato, ECH je dodan kumulativno (30-300 μmol/L) intaktnom endotelu (E plus, slika 2C) ili prstenovima ogoljenim endotelom (E–, slika 2C). U intaktnim endotelnim prstenovima, kumulativni dodatak ECH je proširio krvne žile na način ovisan o koncentraciji, s maksimalnim

postotak mamine relaksacije od 89,22 posto ±0.32 posto pri 300 μmol/L i EC50 od 51,60±0,57 μmol/L (Slika 2A i 2C). Slično, u prstenima ogoljenim endotelom, ECH je također proširio žile na način ovisan o koncentraciji, ali sa značajno nižim maksimalnim odgovorom od 67,72 posto ±1,69 posto (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Učinci ECH na intracelularno oslobađanje kalcija i izvanstanični influks kalcija

Prstenovi ogoljeni od endotela bili su izloženi 1 μmol/L NE dok nije postignuta maksimalna kontrakcija. Pod izvanstaničnim uvjetima bez Ca2 plus, prstenovi su uravnoteženi u otopini KH bez Ca2 plus koja sadrži 0.2 mmol/L EGTA prije početka pokusa. Nakon tri ispiranja otopinom KH bez Ca2 plus i EGTA, prstenovi su prethodno inkubirani s ECH (30, 100 i 300 μmol/L) 20 minuta i zatim ponovno izloženi 1 μmol/L NE. Proizvedeno prstenje

neodržive kontrakcije koje su se brzo vratile na početnu vrijednost, u usporedbi s početnim kontrakcijama izazvanim NE, koje su služile kao referenca. Maksimalna kontrakcija kontrole bila je 33,27 posto ± 2,94 posto (Slika 3A i 3E), ali je značajno smanjena na 24,54 posto ± 2,97 posto i 10,60 posto ± 2,07 posto u prstenovima koji su prethodno tretirani sa 100 odnosno 300 μmol/L ECH (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Uloge različitih inhibitora u vazorelaksaciji plućne arterije štakora izazvanoj ECH

ECH-inducirana vazorelaksacija plućne arterije štakora ispitivana je u prisutnosti ili odsutnosti sljedećih inhibitora: L-NAME (inhibitor eNOS), IMT (inhibitor ciklooksigenaze), TEA (inhibitor K plus kanala velike vodljivosti aktiviran Ca2 plus), BaCl2 ( inward rectifier K plus inhibitor kanala), 4-AP (inhibitor K plus kanala ovisan o naponu) i Gli (inhibitor K plus kanala osjetljiv na ATP). Prstenovi su maksimalno kontrahirani s 1 μmol/L NE, a zatim L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) dodani su BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L), odnosno Gli (10 μmol/L). Nakon što je dostignut novi plato, ECH je dodan kumulativno od 30 do 300 μmol/L. Krivulje koncentracija-odgovor u prisutnosti različitih inhibitora prikazane su na slici 4. Vazorelaksirajući učinak ECH na plućne arterijske prstenove kontrahirane s 1 μmol/L NE bio je značajno blokiran L-NAME (100 μmol/L), TEA ( 1 mmol/L) i BaCl2 (1 mmol/L), s maksimalnim relaksacijama od 64,41 posto ±3,20 posto, 84,38 posto ±0,70 posto, odnosno 75,27 posto ±0,93 posto (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Identifikacija štakorskih PASMC

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 posto) (Slika 6A). Smeđe obojeni miofilamenti jasno su uočeni u citoplazmi pri velikom povećanju (Slika 6B).

Cistancheehinakozidmože odoljetiapoptoza

Učinak ECH na intracelularnu koncentraciju kalcija u PASMC štakora

NE (1 μmol/L) značajno je povećao unutarstaničnu koncentraciju kalcija (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">