DIO 1 Ekstrakt cistanche tubulosa (Schenk) Wight poboljšava performanse stražnjeg umba i ublažava ekspresiju teškog lanca miozina IId/IIx u lijevanim imobiliziranim miševima

Za više informacija obratite se na:Joanna.jia@wecistanche.com

1Division of Neuromedical Science, Institut za prirodnu medicinu, Sveučilište u Toyami, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japan 2Department japanske orijentalne medicine, Diplomski medicinski fakultet i farmaceutske znanosti, Sveučilište u Toyami, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japan

Korespondenciju treba uputiti Chihiru Tohdi; chihiro@inm.u-toyama.ac.jp

Primljeno 14. lipnja 2019.; revidirano 13. rujna 2019.; Prihvaćeno 17. rujna 2019.; Objavljeno 22. listopada 2019.

Akademski urednik: Wen-yi Kang

Copyright © 2019 Yoshiyuki Kimbara et al. Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod Licencom za atribuciju Creative Commons, koji dopušta neograničenu uporabu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju pod uvjetom da je izvorno djelo pravilno navedeno.

Atrofija skeletnog mišića susreće se u mnogim kliničkim stanjima, ali farmakološko liječenje još nije utvrđeno.Cistanche tubulosa(Schenk) Wight je biljni lijek koji se koristi u tradicionalnoj japanskoj i kineskoj medicini. U trenutnoj studiji istražili smo učinakEkstrakt C. tubulosa(CTE) na atrofiranom mišiću in vivo. Također smo istraživali imobilizaciju hindlimbnog lijeva na miševima i osmislili novu vrstu odljeva koji imobilizira stražnje udove, a sastoji se od trake nalik spužvi i tanke plastične cijevi. Koristeći ovu metodu, 3 od 4 skupine miševa (n 11 za svaku skupinu) lijevano je imobilizirano u stražnjim udovima i primijenjeno CTE ili vozilo tijekom 13 dana. Lažni postupak proveden je kod miševa četvrte skupine kojoj je vozilo primijenjeno. Zatim su izvađeni mišići tricepsa surae (TS). Kako bismo analizirali učinak novog lijevanog sustava i primjene CTE-a na atrofiju mišića, procijenili smo TS mokru težinu i područje poprečnog presjeka miofibera (CSA). Također smo odredili razinu ekspresije MyHC IId / IIx prema zapadnjačkom nadutosti, budući da je njihovo povećanje obilježje nekorištene atrofije mišića, što sugerira sporo-brz pomak tipa miofibera. Štoviše, proveli smo dva testa performansi stražnjeg dijela. Nova metoda imobilizacije lijevanog lijeva značajno je smanjila TS mokru težinu i MIOFIBER CSA. To je bilo popraćeno pogoršanjem funkcije stražnjeg dijela i povećanjem MyHC IId/IIx izraza. CTE administracija nije promijenila TS mokru težinu ili MIOFIBER CSA; međutim, pokazao je trend melioracije gubitka funkcije stražnjeg dijela i suzbijanja povećanog izraza MyHC IId/IIx kod lijevanih imobiliziranih miševa. Naša nova metoda imobilizacije stražnjeg dijela lijeva učinkovito induciranu atrofiju mišića. CTE nije utjecao na mišićnu masu, već je potisnuo pomak od sporog do brzog tipa miofibera kod lijevanih imobiliziranih miševa, ublažavajući pogoršanje funkcije stražnjeg umba.

Cistanche deserticola ima mnogo učinaka, kliknite ovdje da biste saznali više

1. Uvod

Patofiziološka stanja povezana s atrofijom skeletnih mišića uključuju sarkopeniju [1], cacheksiju [2] i atrofiju skeletnih mišića izazvanih glukokortikoidom [3]. Atrofija skeletnog mišića također je uzrokovana dugotrajnom nekorištenjem [4], što može biti posljedica mirovanja [5], primjene odljevaka za liječenje prijeloma ili ozljeda ligamenata [6], ili svemirskog leta [7]. Budući da razne bolesti mogu uzrokovati ovo stanje, ono utječe na veliki postotak populacije.

Odgovarajuće tjelovježbe i prehrambene terapije neophodne su za liječenje atrofije mišića [8]. Osim toga, neke studije su izvijestile da su farmakološke protumjere, uključujući selektivne modulatore androgenih receptora, ljudska monoklonska antitijela protiv miostatina i selektivne agoniste ghrelinskih receptora, učinkovite [9]; međutim, ti pristupi još nisu uspostavljeni.

Gore opisana mišićna atrofička stanja popraćena su pomakom u profilu tipa miofibera i smanjenjem mišićne mase. Nekorištenje mišića uzrokovano gubitkom živčanog utjecaja i mehaničkim istovarom izaziva sporo-brz pomak tipa miofibera i promjenu izoformnog profila teškog lanca miozina (MyHC) [10], signalizirano povećanjem razine ekspresije MyHC IId/IIx [11, 12]. Pomak tipa miofibera koji se brzo usporava umjesto toga izaziva primjena glukokortikoida, cacheksija, sepsa i drugi čimbenici [10].

Cistancheje biljni lijek podrijetlom izCistanche deserticolaY. C. Ma,C. tubulosa(Schenk) Wight, ili C. salsa (C. A. Mey) Beck, prema japanskoj farmakopeji [13]. U tradicionalnoj japanskoj (Kampo) i kineskoj medicini koristi se za liječenje "sindroma deficency bubrega", karakteriziranog neplodnošću, sistemskom slabošću mišića (osobito u leđima i donjim udovima) i slabošću kostiju [14, 15]. Poznato je da sadrži različite sastojke, uključujući akteozid, ehinakozid i izoacteozid [16]. Ekstrakt ove biljke, ili njezinih kemijskih sastojaka, pokazao je kardio-, hepato-i neuroprotektivni učinak; antiaging, antifatigue, vazodilatatorni i afrodizijački učinci; antioksidativno i protuupalno djelovanje; i sposobnost poboljšanja pamćenja i učenja [15, 16]. Ipak, učinkovitost ove biljke za sprječavanje ili liječenje bolesti koje troše mišiće nije potvrđena. Stoga smo u ovoj studiji istraživali učinkeC. tubulosaekstrakt (CTE) kao tretman za atrofiju mišića.

U tu svrhu koristili smo imobilizaciju stražnjeg lijevanog lijeva kako bismo izazvali atrofiju mišića kod miševa, usredotočujući se posebno na materijale koji se koriste u odljevku. Prijavljeni su različiti lijevani sustavi, uključujući žbuku od pariških odljevaka [17], odljeve od stakloplastike [18], cijevi mikrocentrifuge polipropilena [19], uređaje za držanje odijela izrađene od pamuka i čelične mreže [20], plastične pipete s proksimalnom oblogom od spužve [21], odljeve izrađene od ne elastične trake za zavoje i čelične žice obložene vinilom [22], umetanje žice u kombinaciji s metalnim pločama [23], i korištenje kirurške klamerice za kožu [24]. Idealan odljev trebao bi biti minimalno invazivan i netraumatičan kako bi se izbjegle upalne promjene jer upala može izazvati atrofiju mišića [25]. Osim toga, testovi performansi stražnjeg dijela s odljevkom trebali bi biti mogući u završnim fazama eksperimenta. Nadalje, glumačka ekipa trebala bi biti jednostavna za rukovanje bez posebnih znanja ili vještina; trebao bi biti lagan, jeftin, jednostavan za kupnju i ne bi trebao zahtijevati posebne uređaje za primjenu i uklanjanje.

Zabilježeni su različiti životinjski modeli rasipanja mišića. Istovar stražnjih udova često se koristi [11, 12], ali ima nekoliko problema, uključujući nekrozu repa, koja može izazvati sistemsku upalu [25]; odstupanje tjelesnih tekućina na repnu stranu, što rezultira abnormalnostima u stražnjim krvnim žilama [26]; izvanredna mikrogravitacija na stražnjem dijelu, koja može snažno utjecati na ekspresiju proteina, uključujući i mitohondrijske enzime [27]. Svi ovi čimbenici mogu utjecati na tijek rasipanja mišića. Drugačija metoda izaziva atrofiju mišića lišavanjem mišića neuronskih ulaza (na primjer, transekcijom bedrenog živca) [28]; budući da su mišići podložni trofičkim čimbenicima iz terminalnih neurona [29], ova metoda, koja dovodi do neobičnog gotovo potpunog denervijskog statusa, može promijeniti proces atrofije mišića. Životinje koje su podložne sustavnim perturbacijama koje izazivaju atrofiju mišića, kao što su dijabetes melitus [30], zatajenje bubrega [31], primjena kortikosteroida [32] i starenje ili ubrzana senescencija [33, 34], mogu se koristiti kao modeli ljudskih bolesti; međutim, ovi sustavni uvjeti također mogu ometati proces atrofije mišića.

Tako smo odabrali imobilizaciju stražnjeg lijeva kako bismo izazvali atrofiju mišića i nastojali smo stvoriti novu metodu za izvođenje kod miševa, kojom smo istraživali učinke CTE-a na atrofiju mišića.

CistanchePoslastice s dodacima prehraniBubregBolestiPojačavaSnaga

2. Materijali i metode

2.1. Biljni materijal i ekstrakcija.

CTE je kupljen od Alpe Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Hida, Gifu, Japan).

C. tubulosa mesnate stabljike prikupljene su iz Shinjang ujgurskog Aptonom Rayona, Narodne Republike Kine. Ukupno 193 kg miješanih prahova C. tubulosa uronjeno je u 1.883 l 30% etanola. Smjesa je refluksirana 2 sata na 55–64 °C. Prinos ekstrakta iznosio je 7,2% i sadržavao je 3,36% akteozida i 12,72% ehinakozida.

2.2. Miševi.

Odrasli ddY (stari 12 tjedana) muški miševi (Japan SLC, Shizuoka, Japan) bili su smješteni odvojeno u plastičnim kavezima i održavani na svijetlo/tamnom ciklusu od 12 sati u vivariju reguliranom temperaturom (25 ± 2 ° C). Svim životinjama je omogućen pristup ad libituma vodi i chowu (zalihe Labo MR; Nosan Corporation, Yokohama, Kanagawa, Japan).

Svi pokusi i protokoli na životinjama provedeni su u skladu sa Smjernicama za njegu i uporabu laboratorijskih životinja Kampusa Sugitani Sveučilišta u Toyami. Homologacijski broj za pokuse na životinjama je A2016INM-3. Uloženi su svi napori kako bi se smanjio broj korištenih životinja.

2.3. Indukcija atrofije hindlimbnih mišića i primjene CTE-a.

Miševi su bili podijeljeni u 4 skupine (n 11 po skupini): u drugom danu svi miševi su anestezirani, a kosa im je uklonjena s bedra na gležanj depilatornom kremom (krema Epilat; Kracie, Tokio, Japan). Zatim su 3 od 4 skupine izlivene (+) skupine imobilizirane u skladu sa sljedećim postupkom, kao što je prikazano na slikama 1(a)–1(g):

Korak 1. Izrežite EPDM-ovu traku za brtvljenje gumene pjene (Cemedine Corporation, Tokio, Japan) na 12 8 25 mm (slika 1(a)).

Korak 2. Držite stražnju udnicu u plantarnom položaju gležnja i vrlo nježno je zamotajte na spoj gležnja brtvenom trakom (slika 1(b)).

Korak 3. Izrežite mekanu PVC izolacijsku kapu TIC-22 (Nichifu Corporation, Osaka, Japan) i pokrijte manžetnu brtvene trake. Koristite dvostranu traku (PRO SELF praktično izrezanu dvostranu traku J-1300; Nitoms Inc., Tokio, Japan) kako bi se pridržavali (slika 1(c)).

Korak 4. Skupite izrezane krajeve kapice; izrezati vodootpornu ljepljivu traku visokih performansi (energetska traka; Asahipen Corporation, Osaka, Japan) do približno 4 veličine 48 mm i fiksiranje prikupljenih krajeva (slika 1(d)).

Korak 5. Stavite mali komad (približno 5 30 mm) aluminijske folijske trake (AL-30; Korporacija Nichiban, Tokio, Japan) na prednjoj strani gornjeg dijela gornjeg dijela gornje granice (slika 1(e)).

Korak 6. Izrežite plastičnu traku (vinilna električna izolacijska traka br. 21; Nitto Denko Corporation, Osaka, Japan) na približno 19 × 40 mm i omotajte poklopac (slika 1(f)).

Korak 7. Izvedite isti postupak na kontralateralnom stražnjem dijelu (slika 1(g)).

Razdoblje imobilizacije korišteno u ovoj studiji bilo je 13 dana, a odljevci su zamijenjeni ako se dogodi jedno ili više sljedećih uvjeta: teški edem papučice, nekroza stražnjeg dijela, teške ulceracije kože, otpuštanje odljeva zbog uništenja ili lijevanje dislokacije iz gležnja. Na preostaloj skupini izvršena je samo depilacija (lažni postupak), a vozilo (fiziološka fiziološka fiziološka otopina) primijenjeno je 13 dana od dana nakon depilacije (2. dan). Među 3 skupine odljevaka (+), 2 su primijenjena CTE (50 i 100 mg/kg/dan; lijevana (+)/CTE-50 skupina i lijevana (+)/CTE-100 skupina), a jedna je upravljana vozilom (lijevana (+)/skupina vozila), također od 2. dana. CTE je otopljen u fiziološku fiziološku otopinu i svakodnevno se primjenjuje oralnim mjeračem tijekom 13 dana.

2.4. Procjena funkcije stražnjeg umba i snage stražnjeg mišića.

14. dana miševi glumačke (+) skupine ponovno su anestezirani nakon primjene CTE-a, a odljevi su uklonjeni. Sljedećeg dana (15. dan) svi miševi testirani su na funkciju stražnjeg dijela i snagu mišića, koristeći sljedeća dva testa:

2.4.1. Mjerenje brzine hoda.

Kvadratna drvena platforma širine 15 mm održavana je vodoravno otprilike 50 cm od tla. Miš je zatim postavljen na platformu, a brzina hoda procijenjena je jer je životinja prešla platformu ručnim snimanjem pomoću štoperice vrijeme za hodanje na udaljenosti od 50 cm. Prije toga, svaki miš bio je naviknut na platformu tako što ju je dvaput prešao kao trening.

2.4.2. Test greške stopala.

Da bismo procijenili snagu mišića stražnjeg dijela, proveli smo "test greške stopala", u kojem je svaki miš ponovno postavljen na platformu, a broj stražnjih klizanja s platforme bio je tabeliran. Ovaj test je modificirana verzija testa statičke šipke, u kojoj se zračne šipke fiksiraju pomoću G-stezaljke, a miševi su napravljeni da ih pređu [35]. Testiranje uboda stopala provedeno je tri puta, a zabilježen je srednji broj koraka tijekom tri sesije. Postojao je interval odmora od najmanje 15 minuta između sesija.

2.5. Histološke i morfometrijske analize mišića Triceps Surae.

Nakon procjene funkcije stražnjeg dijela, miševi su duboko anestezirani i eutanatizirani fiziološkom fiziološkom perfuzijom fiziološke otopine. Zatim su mišići triceps surae (TS) izvađeni s obje strane stražnjih udova; uzorci iz lijevog stražnjeg dijela učvršćeni su u 4% paraformaldehidu u PBS otopini za 24 sata, zatim preneseni u 30% otopinu saharoze u PBS-u i inkubirani za krioprotekciju i kriosekciju. Nakon toga, dijelovi debljine 12-μm izrezani su duž manje osi iz područja srednjeg trbuha svakog mišića pomoću kriostata (Leica 3050S; Leica systems, Nußloch, Njemačka). Sedam do deset uzastopnih dijelova montirano je na staklene tobogane presvučene antistripom (MAS- GP Type A, Matsunami Glass Industry, Osaka, Japan), odmah osušene pomoću sušila za kosu, pohranjene na 30 ° C i obojene hematoksilinom-eozinom (bojenje H-E, ScyTek Laboratories, Logan, Utah, Sjedinjene Američke Države). Odabran je jedan reprezentativni presjek po životinji, u kojem je jasno vidljiva kriška kratke osi svakog miofibera, a njegovo područje poprečnog presjeka (CSA) mjereno je pomoću slike J (Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, Maryland, Sjedinjene Države).

2.6. Zapadno nadutostavanje.

Ukupni protein iz desnog TS-a ekstrahiran je sljedećom metodom. Desni TS mljeven je škarama i odmah zamrznut u tekućem dušiku, pohranjen na 30 ° C, a kasnije homogeniziran kako bi se napravio lizat tkiva. Odmrznuti mišići inkubirani su ledeno hladni 30 minuta u otopini ekstrakta proteina sisavaca M-PER od 2 mL (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, SAD), a zatim homogenizirani. Homogenati su zatim centrifirani na 4°C i 4000 g tijekom 10 minuta, a prikupljeni su i supernacionalni materijali.

10 μg ukupnog proteina u svakom mišićnom lizatu opterećeno je i odvojeno elektroforezom natrijevog dodecil sulfata-poliakrilamida (SDS-PAGE), nakon čega je elektrotransfer na nitroceluloznu membranu (0,2 μm, #1620112, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija, Sjedinjene Američke Države). Nespecifično vezivanje bilo je blokirano s 5% nemasnog suhog mlijeka (obrano mlijeko u prahu, 190-12865, FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) u salini s tris-puferiranom fiziološkom otopinom s 0,05% Tween 20 (TBS-T). Membrane su zatim inkubirane preko noći na 4 °C s primarnim antitijelima otopljenim u otopini pojačivača imunoreakcije Can Get Signal 1 (Toyobo, Osaka, Japan). Nakon miješanja i ispiranja TBS-T-om, membrane su inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi s hrenskom peroksidazom- (HRP-) konjugiranim sekundarnim antitijelima razrijeđenim u otopini pojačivača imunoreakcije Can Get Signal 2 (Toyobo, Osaka, Japan). Signali na membranama otkriveni su elektrokemiluminiscencijom pomoću luminola. Zatim je provedena denzitometrijska analiza pomoću softvera CS Analyzer (Atto, Tokio, Japan). Antitijela su odabrana i razrijeđena na sljedeći način: mišji anti- MyHC IId/IIx monoklonsko protutijelo (1 : 1000, klon A4.1025, #05-716, Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, Sjedinjene Američke Države), mišja anti-GAPDH kontrola utovara monoklonsko protutijelo (1: 3500, G041 ABM, Vancouver, Kanada) i HRP-konjugirana kozja antimousa IgG poli-klonska sekundarna antitijela H&L (1: 2000, Abcam, Cam- bridge, Ujedinjeno Kraljevstvo).

2.7. Statističke analize.

Svi rezultati izražavaju se kao srednja ± standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM). Statistička značajnost usporedbi među skupinama provjerena je jednosmjernim ANOVA-om i post hoc Dunnettovim testovima ili Tukeyjevim HSD testom; Kruskal-Wallis test i post hoc Dunnovi testovi; ili dvosmjerna ANOVA s ponovljenim mjerama i post hoc Dunnettovim testom. Smirnov-Grubbov test korišten je za isključivanje vanserijskih sredstava. Za sve statističke procjene, p vrijednosti manje od 0,05 smatrane su statistički značajnima, a sve analize provedene su pomoću GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornija, Sjedinjene Američke Države).

CistancheDodaci prehrani protiv starenja i jačaju snagu

3. Rezultati

3.1. Zdravlje životinja i učinak CTE-a na tjelesnu težinu.

U vizualnom izgledu, stražnji udovi lijevano-imobiliziranih miševa bili su atrofični, u usporedbi s onima miševa skupine lijeva ( )/vozila. Imobilizacija lijevanja rezultirala je značajnim gubitkom tjelesne težine do kraja faze istraživanja. Nasuprot tome, promjene tjelesne težine nisu bile značajne kod miševa skupine odljeva ( )/vozila. Dvije skupine odljevaka (+)/CTE nisu pokazale značajne promjene u tjelesnoj težini u usporedbi s grupom lijevanih (+)/vozila (slika 2.).

Teške komplikacije u stražnjim udovima imobiliziranih miševa, kao što su nekroza kože ili gangrena, nisu uočene niti je bilo abnormalno ponašanje u vivariju. Međutim, blage komplikacije, uključujući edem stopala, površinske ulceracije na koži i rubor stražnjih udova, uočene su kod svih miševa imobiliziranih glumaca (slika 1(h)). Otpuštanje i dislokacija odljeva, što je dovelo do zamjene lijevanog lijeva, također su uočeni u većini slučajeva.

3.2. Učinak CTE-a na snagu mišića i performanse mišića.

Skupina odljevaka (+)/vozila pokazala je znatno povećan broj stražnjih klizanja u testu kvara stopala (slika 3.(a)), a brzina hoda bila je znatno sporija od brzine u gipsu ()/skupini vozila (slika 3.(b)).

CTE liječenje rezultiralo je tendencijom ovisnom o dozi prema smanjenim klizanjima stražnjeg dijela. U skupini odljeva (+)/CTE-100 obrada je imala tendenciju smanjenja (p 0,0604) klizanja stražnjeg dijela u usporedbi s grupom lijevanog (+)/vozila (slika 3(a)). Što se tiče brzine hoda, i lijevane (+)/CTE-50 i lijevane (+)/CTE-100 skupine nisu pokazale značajne razlike u brzini hoda u usporedbi s grupom lijevanog (+)/vozila, iako je postojao blagi, beznačajni trend koji ovisi o dozi prema većoj brzini (slika 3( b)).

3.3. Mokra težina TS-a i Myofiber CSA.

Mokra težina TS-a značajno je smanjena imobilizacijom lijevanog lijeva u usporedbi s gipsom ( )/skupinom vozila (slika 4(a)). CTE administracija nije utjecala na TS mokru težinu.

Također je analiziran srednji CSA miofibera u svakoj skupini. U skupini lijevanih (+)/vozila utvrđeno je značajno smanjenje CSA miofibera u usporedbi s gipsom ()/skupinom vozila (slika 4. točka (b)). Myofiber CSA dodatno je klasificiran i analiziran frekvencijskom raspodjelom, kao što je prikazano na slici 4(c). Najčešća klasa CSA u skupini odljevaka ( )/vozila bila je veća od one u skupini lijevanih (+)/vozila; postotak miofibera u CSA klasi od 1350 do 2250 μm2 bio je ili je bio znatno veći u skupini odljeva ()/vozila nego u skupini lijevanih (+)/vozila, a suprotan trend bio je vidljiv u skupinama CSA klase 0 900 μm2 (slika 4.c)). Na distribuciju CSA nije utjecala administracija CTE-a u dvama skupinama odljevaka (+)/CTE, u usporedbi s grupom lijevanih (+)/vozila (slika 4.c.). Reprezentativne slike miofibera prikazane su na slici 4(d).

3.4. Učinak CTE-a na razine ekspresije MyHC IId/IIx u TS-u.

Zapadna nadutost provedena je u šest reprezentativnih uzoraka iz svake skupine (slika 5(a)). Ti su uzorci odabrani na temelju njihovog izvođenja životinja koje su pokazale učinkovitost ispitivanja greške stopala najbližu srednjim vrijednostima za svoje skupine.

U skupini odljeva (+)/vozila, MyHC IId/IIx je sig- neificentno povećan u usporedbi s grupom lijevanog ( )/vozila. Ovo povećanje je ovisno o dozi potisnuto od strane CTE administracije. U skupini odljeva (+)/CTE-100 izraz MyHC IId/IIx smanjivao se u usporedbi s grupom lijevanog (+)/vozila (p 0,0810) (slika 5(b)). IZRAZ GAPDH, koji se koristio kao unutarnja kontrola, nije se značajno razlikovao među skupinama (slika 5(c)).

Cistanchetubulosa ima mnogo učinaka