1. DIO: Ekstrakti Cistanche ublažavaju neurotoksičnost izazvanu vodikovim peroksidom u novim mutantnim DJ-1-transficiranim staničnim modelima neuroblastoma

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

1. UVOD

Glavne neurodegenerativne bolesti uključujuAlzheimerova bolestbolest, Parkinsonova bolest (PD), Huntingtonova bolest i druge. Među ovim poremećajima, stopa incidencije PD(Parkinsonova bolest) druga je u svijetu i postiže 1-2 posto kod osoba starijih od 60 godina (Burke & O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen & Ji, 2013). Kao glavna neurološka karakteristika PD-a, dopaminergički neuroni u substantia nigra pars compacta progresivno su degenerativni (Glizer & MacDonald, 2016.), što je popraćeno pojavom ‐sinukleinskih inkluzija nazvanih Lewyjeva tjelešca (Zhang, An, Zhang i Pu , 2010). U patogenezi PB-a, drhtanje u mirovanju, rigidnost, bradikinezija i posturalne abnormalnosti dijagnosticiraju se kao glavni simptomi PB-a u klinici. Iako točni progresivni degenerativni mehanizmi dopaminergičkih neurona nisu razumljivi, bilo uzroci iz okoliša uključujući izloženost insekticidima, neurotoksičnim agensima i teškim metalima, ili genetski uzroci kao što su mutacije Parkina (Kitada et al., 1998), ‐sinukleina (Polymeropoulos et al. al., 1997) i DJ‐1 (Biosa i sur., 2017; Bonifati i sur., 2003), vjeruje se da dovode do pojave PD-a. Do danas, broj missense mutacija, mutacija pomaka okvira i velikih delecija fragmenata uzrokovanih mutacijama gena DJ-1 premašuje 10 (Andres-Mateos i sur., 2007.; Bonifati i sur., 2003.; Hague i sur., 2003.). Unutar DJ-1 proteina, supstitucija Leucine166Proline (L166P) ističe se kao važna. Osim toga, također je pokazano da se oksidativni stres javlja kod PB-a (Dexter i sur., 1989., 1994.; Nikam, Nikam, Ahaley i Sontakke, 2009.) i da je uključen u njenu patogenezu (Hague i sur., 2003.).

Gen DJ-1 koji sadrži osam egzona raspoređenih preko 24 kb, nalazi se na kromosomu 1p36 kod ljudi (Bonifati i sur., 2003.) i kodira visoko konzervirani protein koji sadrži 189 aminokiselina. Protein je pripadao obitelji ThiJ/PfpI, postoji u homodimernom obliku. Glijalne stanice unutar korteksa i substancije nigre i striatuma uglavnom se nalaze u područjima DJ-1 proteina (Olzmann et al., 2007.). U tim stanicama DJ-1 igra sljedeće uloge, kao što je onkogen (Nagakubo et al., 1997), regulacija transkripcije (Kim et al., 2005; Niki, Takahashi- Niki, Taira, Iguchi-Ariga i Agria, 2003 ), antioksidativni stres (Taira et al., 2004; Zhou & Freed, 2005), šaperon (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete i Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko i Fink, 2006) i proteaza (Abou-Sleiman, Healy, Quinn, Lees i Wood, 2003.).

Liječenje neurodegenerativnih bolesti: ekstrakt cistanke

Cistancheje tradicionalna kineska medicina i uglavnom se koristi za liječenje androloških bolesti kroz stoljeća. Glavni aktivni sastojciCistanchesu fenil glikozidi uključujući 34 spoja, kao što su akteozid, ehinakozid, itd. Farmakološki učinciEkstrakti cistančeuključuju poboljšanje seksualne funkcije, zaustavljanje starenja, povećanje sposobnosti učenja i pamćenja, neuroprotekciju, imunomodulaciju, antifatigue, antiishemiju i zaštitu jetre (Tu et al., 2011). Kafeinska kiselina jedan je od glavnih metabolita Cistanche (Yan, 2018).

Često korišteni stanični modeli PD-a uključuju PC12 stanice inducirane 1-metil-4-fenil piridinijevim ionom (Abou-Sleiman et al., 2003.) i stanice neuroblastoma (SH-SY5Y) inducirane vodikovim peroksidom (H2O2) (Zhang et al. ., 2009). Međutim, tipične patološke značajke PD-a nisu prisutne u ovim modelima. Kako bismo razvili fiziološki relevantniji stanični model PD-a, u ovoj smo studiji uspostavili H2O2 inducirane L166P i C106S DJ-1-transficirane SH-SY5Y stanice i istražili učinkeEkstrakti cistančei ključne bioaktivne spojeve, uključujući akteozid, ehinakozid, kavenu kiselinu iCistanche ukupni glikozidina ova dva modela, po prvi put.

Ekstrakt cistanke protiv neurodegenerativnih bolesti

2. MATERIJALI I METODE

2.1|Plazmidi, lijekovi, kemikalije i stanice

FLAG-L166P DJ-1, FLAG-C106S DJ-1 plazmide i anti-DJ-1 poliklonska antitijela ljubazno je dostavio dr. Hiroyoshi Ariga, Fakultet farmaceutskih znanosti, Sveučilište Hokkaido. Dehidrirani minimalni esencijalni medij (MEM) i F-12 medij kupljeni su od Gibca. Lipofectin je bio od Invitrogena. FastDigest Xho I i FastDigest EcoR I bili su iz Fermentasa. Komplet za pripremu plazmida bez endotoksina bio je iz biotehnologije. Stanična linija SH‐SY5Y bila je iz Banke stanica Kineske akademije medicinskih znanosti. Komplet reagensa za analizu BCA proteina bio je od Piercea. PVDF membrane su bile od Millipore. Anti-FLAG poliklonsko antitijelo bilo je iz GeneTex-a.Ekstrakti cistanče, uključujući acteoside, echinacoside, caffeic acid i Cistanche total glicosides, isporučeno je od strane Odsjeka za prirodne lijekove, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University.

2.2|Amplifikacija, ekstrakcija i pročišćavanje plazmida

Nakon uzgoja stanica Escherichia coli JM109 u tekućem mediju LB do OD600=0.5, kompetentne stanice su pripremljene metodom kalcijevog klorida. Kompetentna E. coli je zatim transformirana s plazmidnom DNA korištenjem metode toplinskog šoka, nakon čega su transformanti uzgajani na LB pločama koje sadrže ampicilin 16-24 sata na 37 stupnjeva. Uspješno transformirana monoklonska kolonija je zatim odabrana i uzgajana u LB tekućem mediju koji sadrži 50 ug/mL ampicilina dodatnih 12 sati na 37 stupnjeva. Plazmidi su ekstrahirani i pročišćeni pomoću kompleta za pripremu plazmida bez endotoksina prema uputama proizvođača.

2.3|Identifikacija plazmida

Ekstrahirani plazmidi su podvrgnuti enzimatskoj digestiji, nakon čega su plazmidi i digestirani fragmenti ispitani elektroforezom na 1 postotnom agaroznom gelu. Dobiveni gel je obojen u EB otopini 20-25 minuta na sobnoj temperaturi i fotografiran.

2.4|Transfekcija plazmida u SH-SY5Y stanice

Pročišćena plazmidna DNA transficirana je u SH-SY5Y stanice uzgojene u mediju MEM/F-12 koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma. Transficirane stanice su zatim odabrane u mediju koji je sadržavao 400 ug/mL G418, nakon čega je korišteno 200 ug/mL G418 za održavanje stabilne transficirane stanične linije.

2.5|Identifikacija transfektiranih stanica Western blotom

Transficirane SH-SY5Y stanice su lizirane u RIPA puferu. Nakon centrifugiranja lizata, ukupna koncentracija proteina u supernatantu je određena korištenjem kompleta reagensa za analizu proteina BCA. Jednake količine proteinskog ekstrakta zatim su podvrgnute elektroforezi u 12,5 postotnom SDS-poliakrilamidnom gelu i prenesene na PVDF membranu. PVDF membrana je blokirana s 5 posto nemasnog suhog mlijeka u TBST otopini i obrađena za imunodetekciju. Anti-FLAG i anti-DJ-1 korišteni su kao primarna antitijela, a HRP-konjugirani IgG bio je sekundarno antitijelo. Za detekciju ciljanih proteina primijenjen je poboljšani sustav detekcije kemiluminiscencije.

2.6|Imunocitokemijska identifikacija transfektiranih stanica

Transficirane SH-SY5Y stanice fiksirane su s 4-postotnom otopinom paraformaldehida, permeabilizirane s 0.3-postotnom otopinom Triton X-100 i blokirane s 10-postotnim kozjim serumom. Blokirane stanice su zatim inkubirane najprije s anti-FLAG i anti-DJ-1 poliklonalnim protutijelima, a zatim s FITC-konjugiranim kozjim antizečjim sekundarnim protutijelima. Stanične jezgre su obojene Hoechstom 33342, a stanice su vizualizirane pod invertnim fluorescentnim mikroskopom (IX-71, Olympus).

2.7| Test viabilnosti stanica

Netransficirane i transficirane SH-SY5Y stanice su stavljene u 96 ekstrakata, uključujući akteozid, ehinakozid, kavenu kiselinu i ukupne glikozide Cistanche (svi 10, 20, odnosno 40 ug/mL), dodani su i stanice su inkubirane 6 sati prije tretmana s 0,2 mM H2O2 dodatnih 1 sat. Medij je odbačen, a viabilnost stanica ispitana je korištenjem MTT kao što je gore opisano.

2.8|Učinci ekstrakata Cistanche na vitalnost stanica

dodani su ekstrakti, uključujući akteozid, ehinakozid, kavenu kiselinu i ukupne glikozide Cistanche (svi 10, 20 i 40 ug/mL) i stanice su inkubirane 6 sati prije tretmana s 0,2 mM H2O2 za dodatnih 1 sat. Medij je odbačen, a viabilnost stanica ispitana je korištenjem MTT kao što je gore opisano.

2.9|Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD tri neovisna eksperimenta. Razlike između skupina analizirane su pomoću jednosmjerne ANOVA-e i LSD metode sa softverom SPSS 22.0. Vrijednosti p < 0.05="" smatrane="" su="">

Cistanchebiljka

3|REZULTATI

3.1|Plazmidi su uspješno transformirani i pročišćeni. Nakon odvojene ekspresije u E. coli JM109, plazmidi su ekstrahirani i ispitani elektroforezom u 1-postotnom agaroznom gelu nakon digestije restrikcijskim enzimom (Slika 1). Plazmidi od 6,2 kb cijepani su na linearne fragmente DNA od 5,4 i 0,8 kb, što je potvrdilo da su plazmidi L166P i C106S DJ-1 uspješno eksprimirani i pročišćeni.

3.2|Identifikacija transfektiranih stanica Western blotom. Kao što je prikazano na slici 2, detektirali smo trake FLAG-L166P DJ-1 i FLAG-C106S DJ-1 na oko 70 kDa. Visoke razine FLAG-označenog proteina u transficiranim SH-SY5Y stanicama pokazuju da su mutanti L166P i C106S DJ-1 bili snažno eksprimirani u svojim transfektantima.

3.3|Imunocitokemijska identifikacija transfektiranih stanica. Prikazuje snažne fluorescentne signale iz transficiranih SH-SY5Y stanica nakon inkubacije s anti-DJ-1 ili anti-FLAG protutijelima. Ovo potvrđuje visoke razine L166P i C106S DJ‐1 izraženih u transfektantima.

3.4|Transficirane stanice bile su osjetljivije na H2O2 od netransficiranih stanica. Nakon inkubacije od 1 sata u prisutnosti stupnjevanih koncentracija H2O2 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} }.5, odnosno 1 mM), vitalnost stanica SH-SY5Y transficiranih s L166P ili C106S DJ-1 smanjena je ovisno o dozi u usporedbi s netransfeciranim stanicama

3.5|Ekstrakti Cistanche inhibirali su H2O2-inducirana smanjenja Viabilnost SH-SY5Y stanica ovisno o dozi inhibirana tretmanom sEkstrakti cistančeuključujući akteozid, ehinakozid, kavenu kiselinu i ukupne glikozide Cistanche (svi 10, 20 i 40 ug/mL).

Cistanche