Pingping Zou

Pingping Zoua,†, Yuelin Songb,†, Wei Leia, Jun Lib, Pengfei Tua,b,

Yong Jiang,⁎

acetat Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, Kina moderni istraživački centar za tradicionalnu kinesku medicinu, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, Kina

Primljeno 17. svibnja 2017.; revidirano 20. lipnja 2017.; prihvaćeno 17. srpnja 2017

Sažetak: Cistanche deserticola(CD) jedna je od dvije autoritativne izvorne biljkeCistanches Herba, poznata ljekovita biljka. Ovdje je korištena 1H NMR spektroskopija za karakterizaciju kemijskog profila i razlikovanje različitih dijelova, kao i za predlaganje novog radnog tijeka obrade za CD. Dodjela signala postignuta je višestrukim jednodimenzionalnim i dvodimenzionalnim NMR spektroskopskim tehnikama u kombinaciji s dostupnim bazama podataka i autentičnim spojevima. Gornji dijelovi biljke razdvojeni su od donjih dijelova kombiniranjem skupa 1H NMR spektroskopskih podataka s multivarijatnom statističkom analizom. Nova metoda obrade koja spaja parenje sa sušenjem smrzavanjem pokazala se superiornom u odnosu na parenje u kombinaciji sa sušenjem u pećnici ili izravno sušenje smrzavanjem putem holističke metabolomske karakterizacije temeljene na 1H NMR. Feniletanoidni glikozidi, uglavnom ehinakozid iakteozid, odabrani su i potvrđeni kao kemijski markeri odgovorni za iskazivanje superiornosti novog tijeka obrade, dok su serijski primarni metaboliti, posebno ugljikohidrati i metaboliti ciklusa trikarboksilne kiseline, pronađeni kao primarne molekule koje upravljaju razlikovanjem gornjih i donjih dijelova biljka. Zajedno, 1H NMR spektroskopija pokazala se kao višenamjenski analitički alat za karakterizaciju kemijskog profila i za usmjeravanje dubinske eksploatacije CD-a pružanjem sveobuhvatnih kvalitativnih i kvantitativnih informacija.

KLJUČNE RIJEČI:Cistanchedeserticola; Metabolomika zasnovana na 1H NMR; Tijek rada obrade; Razni dijelovi;Feniletanoidni glikozid; Metaboliti ciklusa trikarboksilne kiseline;Ehinakozid; Akteozid

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima mnoge učinke, kliknite ovdje da biste saznali više

1. Uvod

Cistanches Herba(CH, kineski naziv: Roucongrong), prvobitno arhiviran uShen Nongova kineska Materia Medica, opsežno se smatra jednom od najpoznatijih jestivih tonika i ljekovitih biljaka, a čašćen je i kao "pustinjski ginseng"^1,2. Kao jedna od dvije službene izvorne biljke CH,Cistanche deserticola(CD, Orobanchaceae) je holoparazitska biljka i uglavnom rasprostranjena na sjeveru i sjeverozapadu Kine^2,3. U tradicionalnoj kineskoj medicini stoljećima se naširoko koristi za liječenje nedostatka bubrega karakteriziranog impotencijom, bolovima u slabinama i koljenima, ženskim sterilitetom i zatvorom.^3–5. Međutim, divlji izvori CD-a su posljednjih godina na rubu izumiranja zbog pretjeranog branja, a u Kini je naveden kao jedna od biljaka klase II koje trebaju zaštitu¹. Štoviše, CD nudi važan doprinos kontroli pustinje. Stoga je kritično, ali i izazovno učinkovitije koristiti ovaj biljni materijal.

Znanstvene studije oCistanchepostrojenja pokrenuta 1980-ih⁶. Fitokemijska istraživanja otkrila su postojanje različitih kemijskih tipova,e.g., feniletanoidni glikozidi (PhGs), iridoidi, lignani, masne kiseline, alditoli i ugljikohidrati, unutar CD-a⁷. Među njima se najčešće spominju PhG zbog njihovog širokog spektra bioloških aktivnosti, uključujući antioksidaciju, starenje, umor, upalu, jačanje tjelesnog imuniteta, poboljšanje učenja i pamćenja miševa s Alzheimerovom bolešću itd.¹. U posljednje vrijeme PhG privlače sve veću pozornost kao potencijalni novi kandidati za lijekove za liječenje neurodegenerativnih poremećaja. Konkretno, amalgamacija ukupnih PhG pronađenih u CH razvijena je kao novi lijek, registriran kao ukupniCistancheglikozidkapsula (Memoregain^®) za liječenje vaskularne demencije⁸. Ehinakozid, najobilniji i najučinkovitiji sastojak ukupnog PhG-a, pokazuje anti-apoptotske učinke na neuronske stanice SHSY5Y nakon apoptoze izazvane TNF-om i poništava nedostatke kod miševa s Parkinsonovom bolešću⁹. Štoviše, drugi primarni aktivni spoj, akteozid (također poznat kao verbaskozid) može antagonizirati apoptozu u neuronima¹⁰za obranu od neurotoksičnosti u PC12 stanicama izazvane 1-metil-4-fenilpiridijumom ili glutamatom¹¹i za poboljšanje nedostataka pamćenja izazvanih skopolaminom².

SličnoCordycepsiGinseng, CD se intenzivno konzumira i cijeni kao zdrava hrana. Stvarne i percipirane dobrobiti CD-a vjerojatno će igrati odlučujuću ulogu u cijeni sirovog lijeka. S obzirom na veliku količinu sirove droge CD-a, kriške su popularnije na tržištu. Općenito, enzimska inaktivacija i uskraćivanje vode dva su ključna koraka tijekom obrade medicinskih rezova. Konvencionalne metode sušenja CD-a uključuju izolaciju, sušenje u pećnici, soljenje i skladištenje u podrumu. Međutim, proizvodi iz ovih procesa obično pate od lošeg izgleda i niskog sadržaja PhG-a, što otežava široku primjenu i potrošnju CD-a. Godine 2007. naša je grupa predložila novu tehniku ​​obrade CD-a koja je dramatično očuvala sadržaj ehinakozida iakteozidu kriškama¹⁴. Međutim, budući da proizvodi iz ovog procesa još uvijek imaju neugodan izgled, trenutno opisujemo metodologiju obrade za poboljšanje izgleda i daljnje očuvanje sadržaja PhG-a u obrađenim materijalima.

Serijski analitički alati do sada su se primjenjivali za kemijsku analizu CD-a, uključujući tankoslojnu kromatografiju, tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti (HPLC) u kombinaciji s različitim detektorima, kao što je detektor niza dioda (DAD), detektor raspršenja svjetlosti isparavanjem (ELSD), detektor zahvata elektrona (ECD) i tandem maseni spektrometar (MS/MS). PhG, posebice ehinakozid i akteozid, najčešće su prihvaćeni kao markeri kvalitete¹. Otisak prsta ove biljne droge također je razvijen pomoću HPLC-DAD i HPLC-DAD-MS/MS^15,16. Unatoč tome, ostaje izazov procijeniti kvalitetu CD-a zbog njegovog izuzetno složenog kemijskog profila. Općenito govoreći, pristupi koji ciljaju na nekoliko analita ne mogu ponuditi holistički kemijski pogled na sirove ekstrakte, iako se iz LC−MS/MS može dobiti obilje kvalitativnih i kvantitativnih informacija. Štoviše, analitičke strategije vezane uz HPLC mogu biti ograničene velikim količinama otapala, zamornom pripremom uzorka i/ili dugotrajnim postupcima. Stoga je za optimalnu kemijsku analizu potreban novi analitički alat koji odgovara namjeni i može dati sveobuhvatne informacije o skupu spojeva. srećom,¹H NMR spektroskopija se točno pokazala kao atraktivan alat "sve u jednom" koji može ponuditi ne samo kvalitativni skup podataka, već i kvantitativne informacije za širok raspon primarnih i sekundarnih metabolita uz jednostavnu pripremu uzorka i brzo prikupljanje.^17–20. Do sada, široke primjene¹Pokrenuta je H NMR spektroskopija za istovremeno određivanje, kemijsko profiliranje i metabolomiku složenih matrica.

Iako je provedeno nekoliko istraživanja za ovaj dragocjeni biljni lijek, njegov globalni kemijski profil uglavnom je nepoznat. Budući da je CD parazitska biljka, donji dijelovi bi trebali biti odgovorni za prijenos hranjivih tvari, uglavnom primarnih metabolita, od domaćina prema gornjim dijelovima, dok se snažan energetski metabolizam, poput cvjetanja, obično događa u gornjim dijelovima. Stoga je razumno pretpostaviti da postoje razlike u metabolomima različitih dijelova. Stoga, u trenutnoj studiji, cilj nam je 1) sveobuhvatno okarakterizirati kemijski profil CD-a koristeći¹H NMR spektroskopija povezana s različitim dvodimenzionalnim (2D) NMR mjerenjima; 2) razjasniti razlike između gornjeg i donjeg dijela i 3) predložiti novi radni tijek obrade kroz¹Metabolomska studija temeljena na H NMR. Očekuje se da će dobiveni nalazi dati čvrste smjernice za daljnje bolje iskorištavanje ove ljekovite biljke, posebice za primjenu različitih dijelova i tehnika prerade.

2. Eksperimentalni

2.1. Biljni materijali

Dvanaest serija svježeg materijala (CD1 – CD12, tablica S1, dodatne informacije) prikupljeno je iz autonomnih regija Unutrašnje Mongolije, Xinjianga i Ningxia u Kini. Botaničko podrijetlo svih sirovih materijala potvrđeno je kao

Metabolomika zasnovana na 1H NMRCistanche deserticola 649C. deserticolajednog od autora, prof. Pengfei Tu. Svi uzorci kupona pohranjeni su u herbariju Modernog istraživačkog centra za tradicionalnu kinesku medicinu, Pekinško sveučilište (Peking, Kina).

2.2. Kemikalije i reagensi

Metanol-d4 (CD3OD, sadržaj deuterija, 99,8 atomskih postotaka D), deuterirana voda (D2O, sadržaj deuterija, 99,8 atomskih postotaka D) i natrijev 3-trimetilsilil [2,2,3,3-d4 ] propionat (TSP-d4) dobiveni su od Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, SAD). Metanol analitičke čistoće nabavljen je od Beijing Chemical Works (Peking, Kina).

Autentični spojevi, uključujući ehinakozid, akteozid i manitol, prethodno su pročišćeni iz CD-a u našem laboratoriju14, a saharozu, -galaktozu, zajedno s -glukozom isporučila je Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, SAD). HPLC-UV i 1H NMR analizama utvrđeno je da je čistoća svih referenci veća od 98 posto.

2.3. Priprema uzorka

Svi sirovi materijali (CD1–CD11) osim CD12 nasjeckani su na gornje dijelove (GU) i donje dijelove (GD) na sredini cijele stabljike, a svi dijelovi su narezani na tanke kriške (otprilike 6- mm -debela svaka). Potom su sve kriške CD1–CD12 uzastopno kuhane na pari 10 min i sušene u pećnici na 6{{40}} stupnjeva 48 h kako bi se dobili uzorci tipa a. Dvije druge metode obrade, uključujući izravno sušenje smrzavanjem i 10-minutno parenje nakon čega slijedi sekvencijalno sušenje smrzavanjem, provedene su za neke odabrane uzorke, uključujući CD1-GU, CD4-GU, CD4-GD, CD11-GD i CD12, kako bi se omogućila dva dodatna skupa obrađenih uzoraka (uzorci tipa b i c). Detaljni opisi svih uzoraka ilustrirani su u tablici S1. Prije ekstrakcije, sve obrađene kriške usitnjene su u prah mlinom za uzorke (model YF102, Ruian Yongli Pharmacy Machinery, Kina) i prosijane kroz sito od 80 mesh. Usitnjeni biljni materijali su zatim precizno izvagani (otprilike 200 mg za svaki) i ekstrahirani s 50- puta 50 posto vodenog metanola (w/v) u ultrazvučnoj vodenoj kupelji (25 stupnjeva) tijekom 40 minuta. Nakon toga je dodan 50 posto vodeni metanol kako bi se nadoknadio gubitak težine tijekom ekstrakcije. Svaki ekstrakt je centrifugiran na 10,000×g na 10 stupnjeva tijekom 10 minuta i filtriran kroz membranu od 0,22 μm. Alikvoti (2 mL) supernatanta su potom ispareni i dalje isušeni korištenjem vakuumskog sušenja na 30 stupnjeva tijekom 30 minuta. Osušeni ostaci svakog uzorka rekonstituirani su korištenjem 0,5 mL mješavine (1:1, v/v) CD3OD i fosfatnog pufera u D2O koji sadrži 0,05 posto TSP-d4 (pH 7,4), a otopina je zatim prebačena u 5 mm (id) NMR epruveta (Norell ST500-7) za NMR testove. Svaki uzorak je analiziran u tri primjerka.

2.4. NMR mjerenja

Svi 1H NMR, 13C NMR i 2D NMR spektri snimljeni su na spektrometru Varian Unity Plus 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, SAD) na protonskoj frekvenciji od 499,91 MHz opremljenom TCI kriosonda i sustav Z-gradijenta. Identični parametri primijenjeni su i za ekstrakte i za referentne spojeve kako bi se dobili usporedivi spektri. Za 1H NMR mjerenja, dobiveno je 256 skeniranja sa sljedećim parametrima: širina spektra, 8012,6 Hz (16 ppm); širina impulsa, 11,05 μs (kut preokreta 90 stupnjeva); vrijeme prikupljanja, 2,04 s; odgoda opuštanja (d1), 2 s; i temperatura, 298 K. CD3OD je korišten za zaključavanje frekvencije polja, a kemijski pomaci svih spektara su usklađeni pomoću signala iz TSP-d4 na δ 0.00. Usvojen je mokri postupak za suzbijanje intenziteta H2O signala koji se nalazio oko δ 3,3021. Primijenjena je eksponencijalna funkcija s faktorom širenja linije (LB) od 0,3 Hz, a podaci su popunjeni nulom kako bi se dobilo najmanje pet podatkovnih točaka iznad poluširine za svaku rezonanciju kako bi se zajamčila precizna i pouzdana integracija. Signali opadanja slobodne indukcije (FID) su Fourier transformirani (FT), a svi spektri su ručno fazni i korigirani korištenjem automatiziranog polinomskog osnovnog programa.

Kako bi se pomoglo kemijskoj karakterizaciji i dodjeli signala,

13C NMR i razne 2D NMR analize, kao što je 1H–1H

korelacijska spektroskopija (1H–1H COSY), heteronuklearna jednostruka kvantna koherentna spektroskopija (HSQC) i heteronuklearna korelacijska spektroskopija višestrukih veza (HMBC) također su dobivene za reprezentativni uzorak (CD1-GUI) korištenjem tih zadanih programa. Spektralna širina za COSY bila je δ 0.5–10.0 u obje dimenzije i 128t1 inkremenata za svaki t1. Dodano je šesnaest prijelaznih pojava koje koriste odgodu opuštanja od 1.00 s 822 složena podatka.

Optimalne konstante heteronuklearnog spajanja s jednom vezom i n-vezom za HSQC i HMBC bile su 146 odnosno 8 Hz. Rasponi su postavljeni na –0.5–10.0 ppm u dimenziji F2 odnosno 0–200 ppm u dimenziji F1.

2.5. Multivarijatna statistička analiza skupa NMR spektroskopskih podataka

1H NMR spektri obrađeni su pomoću softvera MestReNova (verzija 5.2.5, Mestrelab Research, Santiago de Compostella, Španjolska). Svaki spektar skaliran je na ukupni intenzitet i smanjen na integrirana područja jednake širine (0.02 ppm) u području od δ 0,50–9,50 nakon isključivanja područja od δ 4,70–

5.02 i δ 3,26–3,36 kako bi se izostavili rezidualni signali vode i metanola. Analiza glavnih komponenti (PCA) s Pareto (Par) skaliranjem kao i ortogonalna djelomična diskriminantna analiza najmanjih kvadrata (OPLS-DA) sa skaliranjem jedinične varijance (UV) provedene su sa softverom SIMCA-P 12.0 (Umetrics, Umeå, Švedska).

2.6. Istodobno određivanje ehinakozida i akteozida pomoću HPLC-UV

Za unakrsnu validaciju nalaza za tri tehnike obrade, HPLC sustav serije Agilent 1260 koji se sastoji od uređaja za otplinjavanje, kvaternarne pumpe, uređaja za automatsko uzorkovanje, peći u stupcu i detektora s nizom dioda (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, SAD) korišteni su za istovremeno određivanje ehinakozida i akteozida u svim uzorcima tipa a, b i c. Kolona Agilent Zorbax SB-C18 (250 mm × 4,6 mm, veličina čestica 5 μm, Agilent Technologies) zaštićena odgovarajućom zaštitnom kolonom (10 mm × 4,6 mm, veličina čestica 5 μm) odabrana je za provođenje kromatografskih odvajanja. Protokol pripreme uzorka, mobilna faza i program eluiranja slijedili su opise arhivirane u Kineskoj farmakopeji (izdanje 2010.)3 s manjim izmjenama. Ukratko, ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom izvedena je 30 minuta korištenjem 50 posto vodene otopine metanola; 30-postotni vodeni metanol je usvojen kao mobilna faza za izokratsko eluiranje pri brzini protoka od 1,0 mL/min, a peć na koloni je održavana na

30 stupnjeva. Valna duljina detekcije postavljena je na 330 nm, a volumen injekcije postavljen je na 10 μL.

3. Rezultati i rasprava

3.1. Optimizacija ekstrakcijskih i spektroskopskih parametara

Kako bi se dobili visokokvalitetni 1H NMR spektri za sve uzorke, različiti parametri pažljivo su optimizirani korištenjem reprezentativnog uzorka (CD1-GUI). Najprije je odabrano otapalo za ekstrakciju između 30 posto vodenog metanola, 50 posto vodenog metanola i metanola. Rezultati su pokazali da je veći ukupni odgovor dao 50-postotni vodeni metanol u odnosu na druga dva, što se dobro slaže s protokolom ekstrakcije potvrđenim u Kineskoj farmakopeji (izdanje iz 2015.)3. Ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom odabrana je zbog prikladnog rada pri prinosima usporedivim s ekstrakcijom vrućim refluksom i Soxhlet ekstrakcijom (podaci nisu prikazani). Nakon toga, trajanje potpomognuto ultrazvukom uspoređeno je između 40 i 60 minuta, a 60 minuta ultrazvučnog kupanja u vodi nije pokazalo veću snagu ekstrakcije od 40 minuta; stoga je 40 minuta postavljeno za ultrazvučni aparat radi uštede vremena.

S druge strane, {{0}}.5 mL CD3OD–fosfatnog pufera u D2O (1:1, pH 7,4) uspoređeno je s 0.5 mL CD3OD–D2O (1: 1), a rezultati su pokazali da bi obogaćivanje fosfatnim puferom moglo spriječiti varijacije i migraciju spektralnog profila. Alikvot od 2,0 mL ekstrakta je uzastopno koncentriran, rekonstituiran i podvrgnut NMR analizi kako bi se dobio odgovarajući odgovor za većinu signala. Nadalje, primijećeno je da je mokra metoda bolja od programa predzasićenja za smanjenje vršnog intenziteta zaostale vode (oko δ 4,8) u spektru. Također smo otkrili da je povećanje broja skeniranja bilo korisno za poboljšanje omjera signal-šum (S/N) što je bilo od velike pomoći za osjetljivu detekciju (osobito za one komponenti u tragovima). Međutim, budući da je ovaj pristup bio štetan za brzo mjerenje, u konačnici je primijenjeno 256 skeniranja za svaki 1H NMR test kako bi se postigla prihvatljiva osjetljivost.

3.2. Dodjeljivanje signala 1H NMR spektra

Identifikacija kemijskih komponenti u CD-u postignuta je zajedničkom analizom 1H NMR, 13C NMR i 2D NMR spektara (Slika 1 i Dodatne informacije, Slike S1-S10) i usporedbom s uzorcima autentičnih spojeva, kao i upućivanjem na dostupne baze podataka, kao što je MMCD . Vjerodostojna dodjela signala u 1H NMR dana je na slici 1. Vrijednosti kemijskog pomaka za pretpostavljene identitete sažete su u tablici S2 (dodatne informacije).

Strukturne karakteristike PhG u rodu Cistanche opisane su u literaturi1. Zbog velike strukturne sličnosti među PhG-ovima, npr. ehinakozid naspram akteozida, protonski signali feniletanoidnih dijelova uvelike su se preklapali u 1H NMR spektru. Ovo preklapanje predstavljalo je izazovan analitički problem za pouzdano razlikovanje ovih signala. U trenutnoj studiji, signali koji pripadaju ehinakozidu i akteozidu, koji su primarni sastojci izvorne biljke, nedvosmisleno su dodijeljeni uz pomoć referentnih spojeva i različitih NMR spektara (Tablica S2, Slika 1 i Slike S1-S6). Dijagnostički signal na δ 7,73 (d, J 16.0 Hz) pokazao je distribuciju Castano-

strana B/D ili drugi feruloil supstituirani PhG-ovi (tablica S2 i slika 1)22. Štoviše, cis-tip PhG (cis-tip kumaroil ili kafeoil supstituirani PhG) također su primijećeni u ekstraktu na temelju prisutnosti δ 6,95 (d, J 12.0 Hz) u spektru (Tablica S2 i Slika 1).

Nekoliko očitih signala otkriveno je u području δ 8.0–9,5. Signali na δ 9,15, 8,88 i 8,09 provizorno su pripisani nikotinamidu (tablica S2 i slika 1) i 13C NMR kao i 2D

NMR spektri (Slike S4-S6) također podržavaju ovu dodjelu. Signal na δ 8,48 vjerojatno je pripisan mravljoj kiselini, dok su signali na δ 8,13 i 8,11 generirani iz adenozina, odnosno adenina (Tablica S2 i Slika 1). Signali ugljikohidrata obično se nalaze u području između δ 3.00 i 5,50. Očito je da je saharoza bila najzastupljeniji disaharid u CD-u, pokazujući značajne rezonancije na δ 4.04, 4,18 i 5,41 (tablica S2 i slike 1 i S7). Očigledni signali koji pripadaju anomernim protonima -galaktoze, -glukoze i -glukoze rezonirali su na δ 5,24, 5,20, odnosno 4,60 (tablica S2, slike 1 i S8, S9). Pojava manitola otkrivena je promatranjem signala na δ 4.00 kao i usporedbom s referentnim spojem (Tablica S2, Slike 1 i S10). Dijagnostički signal 1-O-etil-glukozida opažen je pri 1,16 ppm upućivanjem na HMDB. Aminokiseline, uključujući leucin (0,93 ppm), izoleucin/valin (0,98 ppm), treonin (1,27 ppm), alanin (1,49 ppm), lizin (1,71 ppm), glutamin (2,30 ppm), asparaginsku kiselinu (2,96 ppm), prolin (4,09 ppm), tirozin (7,12 ppm) i fenilalanin (7,33 ppm) provizorno su dodijeljeni usporedbom njihovih odgovarajućih dijagnostičkih spektroskopskih ponašanja s onima arhiviranima u HMDB (Tablica S2 i Slika 1). Iridoidi i lignani su prije spomenuti kao važni kemijski homolozi u CD-u. U reprezentativnom 1H NMR spektru (slika 1), signali siringarezinola (derivat lignana) i 8-epiloganske kiseline (derivat iridoida) uočeni su na δ 7,02 odnosno 0,98. Štoviše, signali multipleta u rasponu od δ 6,56–6,64 mogli bi se uvjetno pripisati citrus A, alaschanioside A ili dehideodiconiferil alkohol glukozidu (svi derivati ​​lignana), dok bi signale između δ 6,18–6,33 također mogli generirati iridoidi (Tablica S2 i Sl. 1). Štoviše, pojavljivanje nekih alifatskih karboksilnih kiselina u CD-u, uključujući fumarnu kiselinu, maleinsku kiselinu, jabučnu kiselinu, izocitričnu kiselinu, limunsku kiselinu, ketoglutarnu kiselinu, pirogrožđanu kiselinu, jantarnu kiselinu, octenu kiselinu i drugu masnu kiselinu, provizorno je okarakterizirano promatranje dijagnostičkih signala na δ 6,54, 6,02, 4,27, 3,04, 2,73, 2,52, 2,49, 2,42, 1,97 i 1,33, sekvencijalno (Tablica S2 i Slika 1). Dodatno, neki signali, poput multipletnog signala oko 3,80 ppm i singletnog kod 1,97 ppm22, smatrani su karakteristikama za metoksi odnosno acetilne skupine (tablica S2 i slika 1), koje su uobičajene zamjene za fenilne derivate , posebno PhG u ovom slučaju. U međuvremenu, signal od 1,06 ppm mogao bi se uvjetno pripisati ostatku ramnoze. Dobro je poznato da 1H NMR spektroskopija može pružiti izravne kvantitativne informacije jer je intenzitet protonskog signala proporcionalan molarnoj koncentraciji analita19. Stoga bi se preliminarna kvantitativna usporedba mogla izvršiti za sastojke u CD-u. Očito je da su ugljikohidrati, posebice saharoza, dali najveće odgovore u reprezentativnom spektru (slika 1). Kao holoparazitska biljka koja raste pod zemljom tijekom gotovo cijelog životnog ciklusa, fotosinteza nije potrebna i nije dostupna za CD; stoga nije iznenađujuće da nijedan primarni metabolit uključen u fotosintezu, kao što je sudionik Kelvinovog ciklusa (također poznat kao C3 ciklus), nije pronađen u spektru23. Naprotiv, otkriveno je mnoštvo molekula koje sudjeluju u ciklusu trikarboksilne kiseline (TCA ciklus, također poznat kao ciklus limunske kiseline i Krebsov ciklus), kao što su limunska kiselina, ketoglutarna kiselina, pirogrožđana kiselina i jantarna kiselina, što ukazuje na snažnu središnju metabolizam ugljika (CCM) događa se u izvornoj biljci. S druge strane, PhG-ovi su promatrani kao dominantna kemijska obitelj među raznim sekundarnim metabolitima, dok su lignani i iridoidi samo dali manji doprinos cjelokupnom spektralnom profilu.

3.3. Određivanje preciznosti 1H NMR spektroskopije

Spektroskopska preciznost igra ključnu ulogu u pouzdanosti metabolomičke karakterizacije. U trenutnoj studiji, preciznost cjelokupne metodologije ispitana je pripremom reprezentativnog uzorka (CD1-GUI) u pet primjeraka i njegovom naknadnom analizom u dva uzastopna dana. Dobiveni spektri pokazali su veliku ukupnu sličnost prekrivajući sve spektre, sugerirajući da su protokol pripreme uzorka i 1H NMR mjerenja bili ponovljivi i da je uzorak mogao ostati stabilan najmanje dva dana.

3.4. Razlikovanje gornjeg i donjeg dijela biljke

Do sada nije bilo dokaza da su gornji dijelovi CD-a ekvivalentni donjim dijelovima u pogledu kemijskog profila i farmakoloških svojstava. Kako bi se razjasnilo je li došlo do nakupljanja primarnih ili sekundarnih metabolita u određenim dijelovima CD-a, cijele sukulentne stabljike su prerezane na gornji i donji dio, koji su potom obrađeni, ekstrahirani i izmjereni 1H NMR spektroskopijom. Slika 2 prikazuje reprezentativne spektre oba dijela. Sve u svemu, većina signala u donjim dijelovima bila je viša od onih u gornjim dijelovima. U rasponu od δ 6.0–9,5, nijedan jedinstveni signal nije mogao biti pronađen ni u jednom dijelu; međutim, ukupni intenzitet tih signala u donjim dijelovima bio je nešto veći od onih u gornjim dijelovima, što sugerira da bi aromatski derivati ​​mogli biti obogaćeni u domeni blizu parazitske točke23. Donji dijelovi također su bili bogati masnim kiselinama, određenim aminokiselinama i nekim drugim tvarima za skladištenje energije jer je ukupni odgovor signala alifatske regije (δ 0.5–3.{{10} }) u donjim dijelovima bila viša nego u gornjim dijelovima. Štoviše, neke očite razlike mogu se uočiti unutar područja šećera (δ 3.0–5.0), a većina signala nalazi se u rasponu od δ 3.0– 5.0 jer su gornji dijelovi bili viši od onih u donjim dijelovima, što ukazuje da su se ugljikohidrati, značajni oligosaharidi, mogli akumulirati u gornjim dijelovima. Kako bi se istaknule razlike između gornjih i donjih dijelova te identificirali primarni suradnici zaduženi za njihovu diskriminaciju, primijenjena je multivarijatna analiza podataka za obradu spektroskopskog skupa podataka različitih dijelova. Nenadzirani pristup nazvan PCA, koji koristi samo informacije iz jedne matrice, prvobitno je primijenjen kako bi se svi uzorci klasificirali prema karakterističnim 1H NMR spektrima. Međutim, došlo je do opsežnog preklapanja za ova dva različita dijela (podaci nisu prikazani). Nakon toga, pokrenut je OPLS-DA, nadzirani pristup, kako bi se izoštrilo razdvajanje između različitih grupa, kao i za razumijevanje varijabli koje nose informacije o razdvajanju klasa. OPLS-DA postigao je dobro odvajanje za različite dijelove CD-a. Slika 3A i B prikazuju bodovni dijagram odnosno S-ploču OPLS-DA. I ukupna dobrota pristajanja (R2Y={{30}}.910) i ukupni koeficijent unakrsne provjere (Q2Y=0.981) bili su blizu 1,0. Stoga je izvorni model odvajanja bio statistički ispravan s visokom predvidljivošću. Očito je da su se gornji dijelovi mogli razlikovati od donjih dijelova kada su uzorci bili označeni s dvije skupine, a S-plota je dala signale koji su potencijalno pridonijeli diferencijaciji. Sveukupno, više točaka raspoređeno je u području koje odgovara nižim dijelovima na S-grafikonu, gdje su raspoređeni viši sadržaji masnih kiselina (δ 1,32–1,35) i TCA faktora ciklusa (kao što je jantarna kiselina na δ 2,42); međutim, gornji dio (desni klaster na slici 3A) bio je bogat ugljikohidratima (uglavnom δ 3,70–4,10, slika 3B). Potencijalni biomarkeri dobiveni S-grafikonom bili su snažno u skladu s usporedbom spektara dvaju dijelova izravnim promatranjem i preklapanjem. Dobro je definirano da se metaboliti sintetiziraju na načine specifične za tkiva, organe i razvoj pomoću specifičnih enzima biosinteze i zatim pohranjuju, ponekad u visokim sadržajima u proizvodnim domenama, u skladu s njihovim različitim funkcijama za cijelu biljku. Na primjer, obje vrste i sadržaj ginsenozida pokazuju značajne varijacije među rizomima, korijenjem, lišćem i sljedbenicima Panax notoginseng24. Što se tiče CD-a, s kvalitativnog gledišta, profili sekundarnih metabolita pokazali su veliku sličnost između gornjih i donjih dijelova. Budući da niži dijelovi cijele biljke imaju ulogu prijenosa hranjivih tvari, od kojih su većina primarni metaboliti, npr. ugljikohidrati, od domaćina, Haloxylon ammodendron do točaka snažnog metabolizma, što ukazuje da bi se obilniji primarni metaboliti trebali pojaviti u donji dijelovi. Štoviše, ekstenzivna hidroliza polisaharida u oligosaharide i potom u monosaharide, koji bi se konačno mogli biološki prenijeti u neke alifatske karboksilne kiseline, trebala bi se ekstenzivno dogoditi u gornjim dijelovima. Budući da je 50-postotni vodeni metanol korišten za ekstrakciju u ovoj studiji i bio je sposoban ekstrahirati hidrofilne niske molekule umjesto makromolekula (npr. polisaharide), nije iznenađujuće primijetiti da je akumulacija faktora TCA ciklusa i masnih kiselina dokazana u nižim dijelovi. Međutim, otkriveno je da su neki oligosaharidi, hidrolitički produkti polisaharida, obogaćeni u gornjim dijelovima. S druge strane, uočene su manje razlike za PhG između različitih dijelova s ​​kvantitativnog gledišta, a sveukupno, blago nakupljanje PhG uočeno je na nižim dijelovima23,25. Objavljeno je da je haustorium floem vjerojatno sekundarni sintetski organ za PhG u CD23; prema tome, niži dijelovi, koji su blizu parazitske točke, trebali bi biti bogati PhG-ima.

3.5. Prijedlog nove metode obrade CD-a

Očito je da su ljekovite kriške koje pripadaju uzorcima c-tipa bile superiorne u smislu dobrog izgleda, prljavo bijele boje, svijetle i oštre teksture. Slika 4 prikazuje reprezentativne 1H NMR spektre za ta tri tipa uzoraka. Međutim, nakon paralelnih mjerenja dobiveni su različiti spektralni profili za te obrađene medicinske rezove. Izravnim promatranjem i preklapanjem mogle su se uočiti očite razlike. Prvo, u području δ 6.00–8.00, gdje su uglavnom uključeni signali koji pripadaju PhG-ovima i nekim drugim fenolnim derivatima, odgovori uzoraka c-tipa (Sl. 4C) bili su dosta viši od druge dvije vrste. Drugo, odgovori većine ugljikohidrata i sudionika TCA u uzorcima b-tipa (Slika 4B) bili su gotovo jednaki onima u uzorcima c-tipa (Slika 4C), ali mnogo viši od onih u uzorcima a-tipa (Slika 4A) . Treće, sadržaji glukoze (δ 5,20 za -glukozu i δ 4,60 za -glukozu) u uzorcima b-tipa (Slika 4B) bili su nešto viši od onih u uzorcima c-tipa (Slika 4C). Konačno, više masnih kiselina otkriveno je u uzorcima tipa a i c nego u uzorcima tipa b (slika 4). Iznad svega, najzastupljeniji derivati ​​fenola, poput ovog, koji se naširoko smatraju učinkovitim sastojcima CD-a, pronađeni su u uzorcima obrađenim novom metodom (c-tip uzorci), u usporedbi a-i b- tipski uzorci. Štoviše, obilje primarnih metabolita, poput ugljikohidrata, sudionika TCA i masnih kiselina također je pronađeno u uzorcima c-tipa. Nakon toga, provedene su usporedbe svih uzoraka kroz analizu podataka s više varijacija s ciljem isticanja sličnosti, ali i razlika između te tri vrste ljekovitih rezova. PCA s Par skaliranjem i OPLS-DA s UV skaliranjem su izvedeni za obradu skupa NMR spektroskopskih podataka, sukcesivno (podaci nisu prikazani). Značajno razdvajanje nije postignuto uporabom PCA; međutim, grafikoni rezultata OPLS-DA za ove tri skupine (zelene, plave i crvene točke na slici 5A) pokazali su jasnu klasifikaciju, što ukazuje da su ove tri grupe uzoraka značajno različite u pogledu svojih metaboličkih profila. The

degradacija PhG-a koju pokreću ili enzimi u izvornoj biljci ili skladištenje na visokoj temperaturi. Kao posljedica toga, obrađene kriške (uzorci c-tipa) novom metodom imale su prednost i zbog ugodnog izgleda i većeg efektivnog sadržaja spoja. Za unakrsnu provjeru gore navedenih rezultata za tri tehnike obrade, korištena je HPLC-UV metoda koja je dobro razvijena i potvrđena u Kineskoj farmakopeji (izdanje iz 2015.)3 za istovremeno određivanje sadržaja ehinakozida i akteozida, koji su igrali važnu ulogu u razlikovati gornje tri vrste prerađenih proizvoda. Srednji sadržaji ehinakozida u uzorcima a-, b- i c-tipa bili su 8,33, 4,10, odnosno 16,19 mg/g, dok su sadržaji akteozida bili 1,57, 1,14 i 3,66 mg/g. Očito je da je sadržaj PhG-a u materijalima c-tipa bio 2-4 puta veći od onih u uzorcima a-i b-tipa, što se dobro slaže s metabolomičkim rezultatima 1H NMR-a. Među dostupnim analitičkim tehnikama koje se općenito koriste u studijama metabolomike, NMR i metode temeljene na MS obično se smatraju povoljnim alternativama. NMR spektroskopija, posebno 1H NMR, posjeduje nenadmašnu superiornost u odnosu na druge tehnike, kao što je neselektivnost, prikladna priprema uzorka i jednostavnost istovremenog otkrivanja različitih skupina metabolita u relativno kratkom vremenu mjerenja. Do sada se metabolomika temeljena na 1H NMR-u koristila za provjeru autentičnosti biljaka17 za usporedbu analognih biljaka18, razlikovanje staništa26 i karakteriziranje degradacije biljaka26. Ovdje je 1H NMR primijenjen za razlikovanje različitih dijelova CD-a, kao i za predlaganje novog tijeka procesa, što ukazuje da je 1H NMR spektroskopija fleksibilan i robustan analitički alat koji nudi smislene smjernice za iskorištavanje CD-a, kao i nekih drugih biljne lijekove pružajući sveobuhvatne kvalitativne i kvantitativne informacije kompliciranih matrica ekstrakata.