1. DIO Antioksidativni i antikoagulacijski učinci fenilpropanoidnih glikozida izoliranih iz brnistre (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria i P. Ramosa)

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

Sveučilište u Ło´d´zu, Odsjek za opću biokemiju, Fakultet za biologiju i zaštitu okoliša, 90-236 Ł´od´z, Poljska

b Odjel za biokemiju i kvalitetu usjeva, Institut za znanost o tlu i uzgoj biljaka, Državni istraživački institut, 24-100 Puławy, Poljska

Centar za istraživanje i očuvanje biološke raznolikosti, Odjel za biologiju okoliša, Institut za biologiju, Sveučilište Jan Kochanowski, 25-406 Kielce, Poljska

Sažetak

Holoparazitske biljke Orobanchaceae, uključujućiCistanche, Orobanche i Phelipanche spp, poznati su po svom bogatstvu fenilpropanoidnih glikozida (PPG). Utvrđeno je da mnogi spojevi PPG-a posjeduju širok spektar aktivnosti, poput antimikrobnih, protuupalnih, antioksidativnih i za poboljšanje pamćenja. Kako bismo bolje istražili potencijal bioaktivnosti europskih brnistara (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) i deset pojedinačnih izoliranih fenilpropanoidnih sastojaka, istražili smo njihovo antiradikalsko djelovanje, zaštitni učinak protiv oksidacije u plazmi in vitro sustav , te utjecaj na parametre koagulacije. Testirani ekstrakti pokazali su aktivnost čišćenja od 50-70 posto snage Troloxa. Ekstrakt OC, bogatakteozid, imao je preko 20 posto bolji antiradikalni potencijal od PR ekstrakta koji je jedini sadržavao PPG bez kateholne jedinice B-prstena u acilnoj jedinici. Štoviše, otkriveno je da je samo osam testiranih PPG-ova pokazalo antioksidativni potencijal u ljudskoj plazmi tretiranoj s H2O2/Fe; međutim, tri testirana PPG-a posjeduju antikoagulantni potencijal uz antioksidativna svojstva. Čini se da je struktura PPG-a, posebice prisutnost acilnih i kateholnih dijelova, uglavnom povezana s njihovim antioksidativnim svojstvima. Antikoagulacijski potencijal ovih spojeva također je povezan s njihovom kemijskom strukturom. Odabrani PPG pokazuju potencijal za liječenje kardiovaskularnih bolesti povezanih s oksidativnim stresom.

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanchetubulosa ima mnoge učinke

1. Uvod

Oksidativni stres nadaleko je poznat po svom negativnom utjecaju na zdravlje živih organizama, uključujući ubrzano starenje i neke vrste raka. Pojava oksidativnog stresa povezana je s poremećenom ravnotežom između oksidativnih i antioksidativnih mehanizama (uključujući enzimsku (katalaza, glutation peroksidaza) i neenzimsku (glutation) obranu) u stanicama organizma [1]. Prekomjerna proizvodnja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), uključujući oksidirajuće radikale i vrste zatvorene ljuske, jedan je od glavnih mehanizama koji stoje iza stvaranja oksidativnog stresa. Međutim, biološki učinak uzrokovan ROS-om uvelike ovisi o koncentraciji, vremenu izlaganja i mjestu. U normalnim uvjetima (niska koncentracija), radikali kisika/dušika mogu igrati ulogu sekundarnih glasnika, ali na višoj razini mogu početi reagirati s biološkim strukturama, poput staničnih membrana [2]. Među svim ROS vrstama, hidroksilni radikal (HO.) uzrokuje jedno od najvećih oštećenja bio-makromolekula: proteina, lipida i DNA. Poznato je da oksidativni stres igra važnu ulogu u nizu bolesti, uključujući kardiovaskularne. Poremećaji krvnog sustava povezani su i/ili im prethode promjene u različitim parametrima hemostaze i biomarkera plazme [1,3].

S druge strane, mnoge prirodne tvari, poput polifenola i višestruko nezasićenih masnih kiselina, identificirane su kao moćni antioksidansi koji mogu spriječiti stvaranje i/ili smanjiti reaktivne kisikove vrste. Spojevi s takvim svojstvima nalaze se u mnogim prehrambenim proizvodima i farmaceutskim pripravcima biljnog podrijetla. Prehrana obogaćena svježim povrćem i voćem te antioksidativne terapije temeljene na prirodnim antioksidansima stoga se široko preporučuju jer mogu smanjiti razinu oksidativnog stresa i spriječiti različite patofiziološke procese [4,5]. Biljni polifenoli raznolika su skupina sekundarnih metabolita, među kojima fenolne kiseline zauzimaju važno mjesto, jer su široko rasprostranjene i pokazuju niz bioloških učinaka, poput antimikrobnih, antioksidativnih i protuupalnih. Fenilpropanoidni glikozidi (PPG) su esterski srodnici hidroksicimetne kiseline i glavna su/jedina klasa sekundarnih metabolita prisutnih u holoparazitskim biljkama Orobanchaceae, uključujućiCistanche, Orobanche i Phelipanche spp. Nekoliko vrsta iz ove porodice su ozbiljni štetnici usjeva kojih se poljoprivrednici žele riješiti na poljima (primjer Phelipanche ramosa), malo ih se koristi u farmakologiji, dok je većina od malog značaja za ljude. HerbaCistanchese intenzivno koristi u azijskoj tradicionalnoj medicini u liječenju nedostatka bubrega i kao sredstvo za jačanje imuniteta i pamćenja, protiv starenja i umora [6]. Fitokemijske analize različitih istraživačkih grupa pokazale su da su fenilpropanoidni glikozidi, kao što su acetonid, ehinakozid i podium side, jedan od glavnih aktivnih sastojaka Herba Cistanche [7]. Nedavna studija Jedrejeka et al. o nekoliko vrsta brnistre koju su u Poljskoj pronašli. [8] pokazalo je da je ovaj biljni materijal sličnog kvalitativnog sastava (dominacija PPG-a), štoviše jednak ili čak veći odCistanchespp. u pogledu sadržaja aktivnih tvari [8].

Cistanche deserticola ima mnoge učinke, kliknite ovdje da biste saznali više

Ovo istraživanje imalo je za cilj procijeniti antiradikalni i antioksidativni potencijal, kao i utjecaj na parametre hemostaze triju ekstrakta brnistre (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA i P. ramosa – PR) bogatih različitim fenilima. -

prostanoidi, kao i njihovi pojedinačni PPG sastojci. Kapacitet antiradikala mjeren je korištenjem 2,2'-azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sulfonske kiseline/Trolox ekvivalenta (ABTS/TE) i 2,2-difenil-1-pikrilhibrazila (DPPH ) testovi. Oksidativni stres u plazma test sustavu induciran je pomoću hidroksilnog radikala (H2O2/Fe), zatim lipidne peroksidacije (thiobarbituric acid-reactive species (TBARS) test), te je izmjerena razina proteinskih karbonilnih i tiolnih skupina. Među utvrđenim parametrima hemostaze bili su: aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTT), protrombinsko vrijeme (PT) i trombinsko vrijeme (TT).

2. Materijali i metode

2.1. Kemikalije

2,2-difenil-1-pikrilhidrazilni radikal (DPPH), 2,2'-azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina (ABTS), kalijev persulfat, {{9 }}hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kiselina (Trolox), dimetilsulfoksid (DMSO), tiobarbiturna kiselina (TBA), mravlja kiselina (LC-MS stupanj), i H2O2 kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Metanol (HPLC gradijent stupnja) i acetonitril (LC-MS stupanj) nabavljeni su od Mercka (Darmstadt, Njemačka). Deset fenil-

propanoični spojevi ispitani u ovom radu, uključujući 2'-O-acetilakteozid (97 posto), 2'-O-acetilpoliumozid (98 posto), 3-O-metilpoliumozid (96 posto), acetonid (99 posto), arena iznutra (97 posto), krenatozid (98 posto), tenipozid (99 posto), poliumozid (99 posto), tubulozid A (96 posto) i wiedemanioside D (96 posto) prethodno smo izolirali iz dolje navedenog biljnog materijala [ 8]. Čistoća spojeva procijenjena je pomoću UHPLC-PDA-MS analize. Ultra čista voda pripremljena je u tvrtki koristeći Milli-Q sustav za pročišćavanje vode (Millipore Co.). Ostali reagensi bili su analitičke kvalitete i osigurani od domaćih komercijalnih dobavljača.

2.2. Biljni materijal

Prof. Renata Piwowarczyk (Sveučilište Jan Kochanowski, Kielce, Poljska) i prikupljeni iz prirodnog izvora u Poljskoj.

Uzorci vaučera (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), kserotermni travnjaci, parazitiraju na Galium boreale, svibanj 2014.; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), psamomazni i lovni travnjaci ugar, parazitira na Artemisia campestris, lipanj 2014.;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), polje, parazitira Solanum Lycopersicum, rujan 2014.) pohranjeni su u Herbariju Sveučilišta Jan Kochanowski u Kielceu (KTC). Biljni materijal je liofiliziran i fino samljeven prije ekstrakcije.

2.3. Priprema ekstrakata brnistre

Biljni materijal u prahu (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g i P. ramosa (PR) – 3 g) ekstrahiran je s 80 posto MeOH na 40 ◦C i 1500 psi (tlak otapala ) koristeći ubrzani ASE 200

ekstraktor otapala (Dionex, Sunnyvale, CA, SAD). Ekstrakti su ispareni i osušeni zamrzavanjem (Gamma 2–16 LSC zamrzivač, Christ, Njemačka). Učinkovitost ekstrakcije za OC, PA i PR bila je 55 posto, 37 posto, odnosno 43 posto po težini biljnog materijala. Zbog visokog sadržaja ugljikohidrata (podaci nisu prikazani), sirovi ekstrakti su dalje pročišćeni ekstrakcijom na čvrstoj fazi (SPE) na mikrokoloni Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, SAD). Šećeri su uklonjeni s 1 posto MeOH, zatim su spojevi od interesa isprani s 80 posto MeOH. Nakon uklanjanja otapala, OC, PA i PR ekstrakti su liofilizirani (Gamma 2-16 LSC zamrzivač za sušenje), a prinosi SPE pročišćavanja bili su 53 posto (OC), 67 posto (PA) i 51 posto (PR) .

2.4. Fitokemijska svojstva ekstrakata brnistre

Kvalitativne i kvantitativne analize ekstrakata brnistre provedene su pomoću sustava ACQUITY UPLC (Waters) spojenog na fotodiodni niz detektora (PDA) i tandem kvadrupolnog masenog spektrometra (TQD-MS/MS). Zamrzavanjem osušeni ekstrakti OC, PA i PR otopljeni su u 50 posto metanola u koncentraciji od 0,50 mg/mL, a zatim

kromatografirano na BEH C18 koloni (100 x 2,1 mm, 1,7 µm, Waters). Kromatografski uvjeti su bili sljedeći: temperatura pećnice – 25 ◦C,

linearni gradijent 10→25 posto mobilne faze B (0.1 posto mravlje kiseline u acetonitrilu) u mobilnoj fazi A (0.1 posto mravlje kiseline u H2O) tijekom 12 min, brzina protoka – 0,4 mL/min, volumen injekcije – 2 μL, UV raspon – 190–490 nm (rezolucija 3,6 nm). MS analiza provedena je u načinu rada s negativnim ionima s ionizacijom elektrosprejom (ESI), koristeći sljedeće postavke: raspon skeniranja 100–1200 m/z; kapilarni napon 2,8 kV; napon konusa 35 V;

temperatura izvora 150 ◦C; temperatura desolvatacije 450 ◦C; opustošenje

protok plina 900 L/h, a konusni protok plina 100 L/h. Prikupljanje i obrada podataka provedena je korištenjem softvera Waters MassLynx 4.1.

Vrhovi fenilpropanoidnog glikozida (PPG) identificirani su usporedbom dobivenih LC-MS podataka s onima prethodno izoliranih spojeva [8]. Kvantifikacija PPG-ova u ekstraktima brnaste repice temeljila se na UPLC-UV metodi s detekcijom na 330 nm i kalibracijom vanjskog standarda pomoćuakteozid(Sigma-Aldrich, 99 posto, HPLC) kao

grupni standard. Linearna kalibracijska krivulja pripremljena je u šest koncentracija unutar raspona od 1-200 ug/mL i pokazala je dobru linearnost (R2

0.999). Kvantitativni rezultati predstavljaju srednju SD vrijednost triju injekcija i izraženi su u miligramimaakteozidekvivalenti (eq) po gramu ekstrakta (mgakteozideq/g).

2.5. Antiradikalna aktivnost in vitro

2.5.1. ABTS analiza uklanjanja radikala

ABTS antiradikalni test proveden je pomoću metode koju su opisali Kontek i sur. [9], uz male modifikacije kako slijedi: 20 posto MeOH korišteno je za pripremu reagensa (7 mM ABTS i 4,9 mM kalija po

sulfat); s 50 posto MeOH. Omjer uzorka i ABTS radne otopine bio je 1:25 (v/v). Apsorbancija na 734 nm izmjerena je nakon 30 min inkubacije

u mraku pomoću UV-vis spektrofotometra (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD).

Inhibicija apsorbancije (postotak) izračunata je kako slijedi: [(Absecon-

trol–Absuzorak)/Abskontrola] ×100.

Izračunati su Trolox ekvivalenti (TE) ekstrakata brnistre

pomoću formule TE=msample/mstandard, gdje je m nagib ravnine

linijske krivulje (inhibicija apsorpcije u odnosu na koncentraciju). Vrijednost TE od

uzorak opisuje svoju normaliziranu aktivnost protiv Troloxa (TEstandard =

1.0). Vrijednosti IC50 za OC, PA i PR ekstrakte i Trolox bile su

postignuti eksperimentalno, zatim su izračunati iz njihove ravne linije

krivulje (inhibicija apsorpcije u odnosu na koncentraciju) i izražene su u

ug/mL.

Test je izveden u tri primjerka, a rezultati su prikazani

kao srednje vrijednosti ± standardne devijacije (SD).

2.5.2. DPPH analiza uklanjanja radikala

DPPH antiradikalni test proveden je metodom koju su opisali Jedrejek i sur. [8] i Brand-Williams et al. [10], s malim izmjenama kako slijedi: otopine ekstrakata OC, PA i PR, na četiri razine koncentracije u rasponu od 50▽ 250 ug/mL, i otopine Troloxa, na šest razina koncentracije u rasponu od 10▽ 250 ug/mL, pripremljeni su s 50 posto MeOH. Omjer uzorka prema DPPH bio je 1:19 (v/v). Apsorpcija na 517 nm izmjerena je nakon 30 minuta inkubacije u mraku pomoću UV-vis spektrofotometra (Evolution 260 Bio). Inhibicija apsorbancije (postotak) izračunata je na sljedeći način: [(Absecontroll–Absuzorak)/Absecontrol] ×100. Trolox ekvivalent (TE) i IC50 vrijednosti ispitnih uzoraka izračunate su na isti način kao u ABTS testu (odjeljak 2.5.1). Test je izveden u tri primjerka, a rezultati su prikazani kao srednje vrijednosti ± SD.

2.6. Osnovne otopine ispitanih biljnih spojeva i ekstrakata za pokuse s ljudskom plazmom

Osnovne otopine ispitivanih spojeva i biljnih ekstrakata pripremljene su u 50 postotnom DMSO. Konačna koncentracija DMSO-a u ispitivanim uzorcima bila je niža od 0,05 posto, a njegovi su učinci utvrđeni u svim pokusima.

2.7. Izolacija ljudske plazme

Ljudska krv ili plazma dobivena je od šest redovnih darivatelja (muškaraca i žena nepušača) u banku krvi (Lodz, Poljska) i medicinski centar (Lodz, Poljska). Krv je prikupljena kao CPD otopina (citrat/fosfat/dekstroza; 9:1; v/v krv/CPD) ili CPDA otopina (citrat/fosfat/dekstroza/adenin; 8,5:1; v/v; krv/CPDA). Donatori nisu uzimali nikakve lijekove ili tvari koje izazivaju ovisnost (uključujući duhan, alkohol i dodatke antioksidansima) najmanje dva tjedna prije darivanja. Naša analiza uzoraka krvi obavljena je u skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije za istraživanje na ljudima i odobrena od strane Odbora za etiku istraživanja u pokusima na ljudima na Sveučilištu u Lodzu. Plazma je pripremljena centrifugiranjem svježe ljudske krvi na 4500x g tijekom 25 minuta na sobnoj temperaturi. Koncentracija proteina izračunata je mjerenjem apsorbancije ispitivanih uzoraka na 280 nm, prema postupku Whitakera i Granuma [11].

2.8. Markeri oksidativnog stresa u ljudskoj plazmi

2.8.1. Mjerenje peroksidacije lipida

Peroksidacija lipida u plazmi kvantificirana je mjerenjem koncentracije reaktivnih tvari tiobarbiturne kiseline (TBARS). Koncentracija TBARS izračunata je pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije (ε=156, 000 M 1 cm 1). Metoda je detaljnije opisana u [12,13]. 2.8.2. Mjerenje karbonilnih skupina Razina karbonilnih skupina izračunata je pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije (ε=22, 000 M 1 cm 1 ) i izražena je kao nmol karbonilnih skupina/mg proteina plazme, prema Bartoszu [ 13] i Levine et al. [14]. 2.8.3. Određivanje tiolne skupine Sadržaj tiolne skupine u proteinima plazme mjeren je spektrofotometrijski pomoću SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Njemačka) apsorbancijom na 412 nm s 5,5'-ditiol-bis-(2- nitrobenzojevom kiselinom). Metoda je detaljnije opisana drugdje [15-17].

2.9. Parametri hemostaze

2.9.1. Mjerenje protrombinskog vremena (PT)

PT je određen koagulometrijski pomoću optičke koagulacije

Slova označavaju rezultate Tukeyeva testa (p < 0.05), vrijednosti s istim

slovo unutar retka nije značajno drugačije.

2.9.2. Mjerenje trombinskog vremena (TT)

TT je određen koagulometrijski pomoću optičkog koagulacijskog analizatora (model K-3002, Kselmed, Grudziadz, Poljska), prema metodi koju su opisali Malinowska et al. [18].

2.9.3. Mjerenje aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (APTT)

APTT je određen koagulometrijski pomoću K-3002 optičkog koagulacijskog analizatora (Kselmed, Grudziadz, Poljska) prema Mali now ska et al. [18].

2.10. Analiza podataka Q-Dixon test je proveden kako bi se eliminirali nesigurni podaci.

Podaci su testirani na normalnu distribuciju Shapiro-Wilkovim testom i jednakost varijance s Leveneovim testom. Statistički značajne razlike identificirane su korištenjem ANOVA-e, praćene Tukeyevim testom višestrukih usporedbi ili Kruskal-Wallisovim testom. Usporedbe su se smatrale značajnima pri p < 0.05.="" vrijednosti="" su="" prikazane="" kao="" srednje="" vrijednosti="" ±="">