Dio 1 Učinci ekstrakta Cistanche Tubulosa slični antidepresivima na štakore s kroničnim nepredvidivim stresom kroz obnovu homeostaze crijevne mikrobiote

Yang Li1, Ying Peng1, Ping Ma1, Hanlin Yang1, Haiyan Xiong1, Mengyue Wang1, Chongsheng Peng1, Pengfei Tu2 i Xiaobo Li1*

1 Farmaceutski fakultet, Sveučilište Jiao Tong u Šangaju, Šangaj, Kina, 2 Državni ključni laboratorij prirodnih i biomimetičkih lijekova, Fakultet farmaceutskih znanosti, Pekinško sveučilište, Peking, Kina

Sve više dokaza pokazuje da su neuropsihijatrijski poremećaji, poput depresije, povezani s crijevnim mikrobiomom kroz crijevno-mozaknu osovinu.Cistanches Herbaje dobro poznat za liječenje nedostatka "bubreg-yang" u tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM), a posljednjih se godina koristi za liječenje neurodegenerativnih bolesti. U ovoj studiji uspostavljen je model depresije izazvane kroničnim nepredvidivim stresom (CUS) kako bi se istražio utjecajCistanche tubulosaekstrakt (CTE) na bihevioralne testove, monoaminske neurotransmitere i neurotrofne čimbenike u hipokampusu i debelom crijevu, sastav crijevne mikrobiote i proizvodnju kratkolančanih masnih kiselina (SCFA). Štoviše, korelacijska analiza korištena je za procjenu funkcionalnog odnosa između promijenjene crijevne mikrobiote, promijenjenih neurotransmitera i neurotrofina u hipokampusu i debelom crijevu te poremećene koncentracije SCFA. CTE je značajno poboljšao ponašanja slična depresiji kod štakora pod CUS-om. Razine 5-hidroksitriptamina (5-HT) i neurotrofnog faktora izvedenog iz mozga (BDNF) u mozgu CUS štakora obnovljene su CTE-om. Relativno obilje crijevne mikrobiote i koncentracije acetata i heksanske kiseline također se mogu modulirati CTE tretmanom. Nadalje smo pokazali da je primjena CTE-a kod CUS štakora dovela do jake korelacije između poremećenog sastava crijevne mikrobiote, razina neurotransmitera hipokampusa i proizvodnje neuroaktivnih metabolita SCFA. Sve u svemu, ovi rezultati identificiraju CTE kao potencijalni tretman za simptome depresije obnavljanjem homeostaze crijevne mikrobiote za poremećaje osovine mikrobiota-crijeva-mozak, otvarajući nove puteve u polju neuropsihofarmakologije.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa, antidepresiv, kronični nepredvidivi stres, crijevna mikrobiota, mikrobiota-osovina crijeva-mozak

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima mnoge učinke, kliknite ovdje da biste saznali više

UVOD

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong na kineskom) službeno je zabilježeno kao osušene sočne stabljikeCistanche deserticola(YC Ma) iCistanche tubulosa(Schrenk) u Povjerenstvu za kinesku farmakopeju (2015.). To je dobro poznata tradicionalna kineska medicina (TCM) za liječenje nedostatka bubrega, impotencije, ženske neplodnosti, morbidne leukoreje, obilne metroragije,

i starački zatvor (Komisija kineske farmakopeje, 2015.). Prethodne studije otkrile su nekoliko glavnih kemijskih sastojakaCistanches Herba, uključujući feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide i iridoidne glikozide, lignane, alditole, oligosaharide i polisaharide. Farmakološka analiza pokazala je da Cistanches Herba pokazuje širok raspon neuroprotektivnih, imunomodulatornih, protuupalnih i hepatoprotektivnih aktivnosti (Jiang i Tu, 2009; Fu i sur., 2017). PhG se smatraju glavnim aktivnim sastojcima Cistanches Herba s različitim farmakološkim djelovanjem, poput neuroprotektivnog, imunomodulatornog, protuupalnog, hepatoprotektivnog, antioksidativnog, itd. (Jiang i Tu, 2009; Fu et al., 2017).Cistanches Herbaizvorno je zabilježeno u Classic of Herbal Medicine ("Shennong Bencao Jing" na kineskom), dobro poznatoj knjizi o ljekovitom bilju napisanoj između otprilike 200. i 250. godine naše ere, kao "visoka biljka" koja može regulirati "pet sojeva (viscera) i sedam (prejedanje, ljutnja, vlaga, hladnoća, briga, vjetar i kiša i strah) oštećenja" (Huang, 1982). Danas je Cistanches Herba široko prihvaćena kao biljni tonik za opću slabost (Fu i sur., 2017.).C. tubulosaglikozidne kapsule (Memoregain®) koriste se za liječenje Alzheimerove bolesti (Guo i sur., 2013.). Disfunkcionalni dopaminergički sustav jedna je od ključnih patogeneza monoaminske hipoteze depresije (Duman i sur., 1997.; Krishnan i Nestler, 2008.). Ehinakozid (jedan od PhG) i PhG izCistanche salsaUtvrđeno je da štite dopaminergičke neurone od neurotoksičnosti dopamina (DA) izazvane 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinom (MPTP) koji može povećati DA razine u striatumu C57 miševa (Tian i Pu, 2005; Geng i sur., 2007). Dodatno, katalpol i genipozid dva su reprezentativna iridoida u Cistanches Herba, a utvrđeno je da ublažavaju ponašanje slično depresiji izazvano kroničnim nepredvidivim stresom (CUS) obnavljanjem disfunkcija hipotalamus-hipofizno-nadbubrežne (HPA) osi, a katalpol može poboljšati moždanu regulaciju. ekspresiju izvedenog neurotrofnog faktora (BDNF) (Cai i sur., 2015.; Wang i sur., 2015.). Štoviše, najnovija publikacija daje novi dokaz da je uvarak Cistanches Herba značajno smanjio razdoblje nepokretnosti u testu vješanja repa miša, što snažno sugerira da Cistanches Herba posjeduje potencijalna svojstva slična antidepresivu (WangD. et al., 2017.).

Tradicionalna kineska medicina privlači sve veću pozornost kao liječenje depresije zbog svojih relativno umjerenih nuspojava (Sarris i sur., 2011.; Feng i sur., 2016.). Razne vrste TCM-a, kao što su pojedinačni spojevi iz sirove droge (ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg3 i Yuanzhi-1) (Jin i sur., 2015.; Kang i sur., 2017.; Wang GL i sur., 2017. ), pojedinačne kineske ljekovite materijale (korijen Panax ginsenga, rizom Acorus tatarinowii i Morinda officinalis) (Dang i sur., 2009; Han i sur., 2013; Xu i sur., 2016) i dekokcije TCM-a (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan i Xiaochaihutang) (Dai i sur., 2010.; Su i sur., 2011.; Su i sur., 2014.; Yan i sur., 2016.) detaljno su proučeni i prikazani poništiti ili ublažiti simptome slične depresiji. Na primjer, utvrđeno je da Kai-Xin-San značajno ublažava simptome depresije izazvane CUS-om u štakora povećanjem količine neurotransmitera, neurotrofnih čimbenika i njihovih odgovarajućih receptora, te promicanjem ekspresije sinaptotagmina i gustoće dendritičke kralježnice (Yan et al. ., 2016).

Unatoč tome, prethodne studije TKM-a oslanjaju se na rezultate testova ponašanja sličnih depresivima i usredotočuju se na konvencionalni farmakološki mehanizam djelovanja. Veza između antidepresivne učinkovitosti oralno primijenjene TCM i crijevne mikrobiote nije dobro shvaćena. Sve više dokaza podupire da crijevna mikrobiota igra ključnu ulogu u regulaciji funkcija mozga, osobito depresije i drugih poremećaja povezanih sa stresom (Foster i Neufeld, 2013.; Sherwin i sur., 2017.). Na primjer, kronični stres dovodi do disregulacije mikrobne strukture crijeva štakora, sa smanjenjem omjera Firmicutes/Bacteroidetes, točnije, smanjenjem relativnog obilja Lactobacillusa i povećanjem Oscillibactera (Meng i sur., 2017.). Nadalje, fekalna transplantacija disregulirane mikrobiote s pacijenata s depresijom na miševe bez klica dala je fenotip sličan depresiji kod ovih životinja, što ukazuje da disregulirana crijevna mikrobiota uzrokuje bihevioralne i fiziološke simptome depresije i anksioznosti (Kelly i sur., 2016.; Zheng i sur. ., 2016). U pokusima na životinjama utvrđeno je da neki modulatori mikrobiote kao što su probiotici i prebiotici poboljšavaju ponašanje slično depresiji kod miševa pod kroničnim stresom poboljšanjem crijevne mikrobiote (Bravo i sur., 2011.; Bharwani i sur., 2017.; Burokas i sur., 2017.). ).

S obzirom na povezanost između crijevne mikrobiote i razvoja bolesti, kao i plastičnosti strukture crijevne mikrobiote, odlučili smo istražiti učinke crijevne mikrobiote na posredovanje depresije privuklo je našu pozornost i bilo je istraženo (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). Kako bi se to postiglo, provedena je kombinirana metastatska analiza sekvenciranja gena 16S rRNA (White et al., 2009.) kako bi se analizirao sastav crijevne mikrobiote. U ovoj studiji,C. tubulosaodabran je za procjenu njegovih učinaka sličnih antidepresivima jer ima višu razinu PhG-a u usporedbi sC. deserticola. Ustanovljen je model depresije izazvan CUS-om štakora kako bi se istražio utjecajC. tubulosaekstrakt (CTE, koji se sastoji od 48,6 posto PhG-ova, 6,9 posto iridoidnih glikozida i 20.0 posto ukupnih saharida) na testovima ponašanja, monoaminske neurotransmitere i neurotrofne čimbenike u hipokampusu i debelom crijevu, sastav crijevne mikrobiote i kratko- proizvodnju lančanih masnih kiselina (SCFA). Štoviše, funkcionalni odnos između promijenjene crijevne mikrobiote promijenio je neurotransmitere i neurotrofine u hipokampusu i debelom crijevu, a proučavana je i poremećena koncentracija SCFA. Korelacijska analiza korištena je kako bi se potvrdili dokazi da CTE cilja crijevnu mikrobiotu za liječenje depresije moduliranjem osovine mikrobiota-crijeva-mozak.

Cistanchemože ojačati imunitet

MATERIJALI I METODE

Materijali

Fluoksetin (FLX) je kupljen od Aladdin Industrial Inc. (Shanghai, Kina). 5-Hidroksitriptamin (5-HT), norepinefrin (NE) i BDNF ELISA kompleti kupljeni su od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). HPLC-grade acetonitril je kupljen od Mercka (Darmstadt, Njemačka). Deionizirana voda pripremljena je iz destilirane vode korištenjem Milli-Q sustava za pročišćavanje vode (Millipore, Bedford, MA, Sjedinjene Države). Svi ostali korišteni reagensi i kemikalije bili su analitičke kvalitete.

Osušene stabljikeC. tubulosaprikupljeni su iz okruga Hetian (Xinjiang, Kina). Uzorke uzoraka vaučera ovjerio je prof. Xiaobo Li i pohranio ih je u herbarij Farmaceutskog fakulteta šangajskog sveučilišta Jiao Tong (Šangaj, Kina). Homogeno u prahuC. tubulosastabljike su suspendirane u deseterostruko 70 postotnom etanolu i zagrijavane uz refluks tri puta, svaki 1 sat na 100 stupnjeva. Ekstrakti su filtrirani pomoću gaze, upareni pod vakuumom na 65 stupnjeva i liofilizirani. Uzorak je ponovno otopljen i zatim odvojen makroporoznom smolom D101. Nakon adsorpcije, frakcija eluirana vodom je odbačena. CTE je dobiven nakon eluiranja s 40 postotnim etanolom, zatim uparen pod vakuumom na 65 stupnjeva i liofiliziran.

Analiza kemijskog sastava CTE

Relativni sadržaj PhG u CTE određen je UV spektrofotometrijom na 330 nm uz korištenje ehinakozida kao standarda. Relativni sadržaj iridoida i iridoidnih glikozida mjeren je UV spektrofotometrijom metodom dvostrukih valnih duljina kako bi se izbjegla spektralna interferencija od PhG (237 nm korišteno je za spektroskopsku kvantifikaciju, izosbestična točka 280 nm korištena je za referentnu valnu duljinu), genipozid je korišten kao standard. Ukupni sadržaj ugljikohidrata u CTE određen je kolorimetrijskom metodom fenol-sumporne kiseline s glukozom kao standardom (Chow i Landhausser, 2004.).

Glavni kemijski sastojci CTE karakterizirani su UPLC-Q-TOF-MS. UPLC-Q-TOF-MS analiza provedena je na Waters ACQUITY UPLC sustavu (Waters Corp., Milford, MA, Sjedinjene Države) s ACQUITY UPLC BEH C18 kolonom (100 mm x 2,1 mm id, 1,7 段m, Waters Corp., Sjedinjene Države) gradijentnom elucijom upotrebom 0.1 posto acetonitrila mravlje kiseline (A) i 0.1 posto mravlje kiseline u vodi (B) na protok od 0,4 ml/min. Profil gradijenta bio je: 0-5 min (A: 5-20 posto), 5-7,5 min (A: 20-30 posto), 7.5-10 min ( A: 30-70 posto ), 10-11 min (A: 70-100 posto ), i držano 1,5 min. Gradijent je recikliran natrag na 5 posto u 0,5 min i držan 2,5 min za sljedeći ciklus. Volumen injekcije bio je 3 [il. Temperatura peći na stupcu je postavljena na 35 stupnjeva.

Masena spektrometrija je provedena korištenjem Waters Vion IMS masenog spektrometra (Waters Corp., Milford, MA, Sjedinjene Države). Ionizacija je provedena u načinu negativnog elektrospreja (ESI). Parametri MS bili su sljedeći: kapilarni napon, 2.0 kV; konusni napon, 20 V; temperatura izvora, 120 stupnjeva; temperatura desolvatacije, 500 stupnjeva ; protok plina konusa i desolvatacije, 50 odnosno 1,000 L/h. Za točno mjerenje mase, leucin-enkefalin je korišten kao masa zaključavanja za stvaranje [MH]- iona (m/z 554,2615). Eksperiment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) u dvije funkcije skeniranja proveden je kako slijedi: funkcija 1 (niska energija): m/z 50-1,000, 0,25 s vrijeme skeniranja, 0,02 s odgoda između skeniranja , 6 eV energija sudara; funkcija 2 (visoka energija): m/z 50-1,000, 0,25 s vrijeme skeniranja, 0,02 s kašnjenje između skeniranja, rampa energije sudara od 20-45 eV. Podaci su obrađeni pomoću softvera UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, Sjedinjene Države).

Pokusi na životinjama

Muški štakori Sprague-Dawley (200 土 20 g) nabavljeni su od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Kina) i smješteni u Laboratory Animal Center Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina). Životinje su bile smještene u skupinama na kontroliranoj sobnoj temperaturi (25 ± 2 stupnja, 55 ± 10 posto relativne vlažnosti) s ciklusom svjetlo-mrak od 12:12 h. Štakorima je dopušten slobodan pristup redovitoj hrani za laboratorijske štakore i vodi tijekom 1 tjedna. Objekte i protokole za životinje odobrio je Odbor za etiku životinja šangajskog sveučilišta Jiao Tong (Šangaj, Kina).

Nakon 1 tjedna privikavanja, 40 naivnih štakora podvrgnuto je razdoblju od 72 h saharoznog treninga i osnovnom testiranju saharoze. Štakori su podijeljeni u pet skupina (n=8) na temelju njihove preferencije saharoze u osnovnom testu saharoze (dodatna slika S1). Kontrolna skupina i CUS skupina dobile su fiziološku otopinu (10 ml/kg). Za ostale tri skupine, CTE pri visokoj dozi (CTEH) (400 mg/kg), niskoj dozi (CTEL) (200 mg/kg) i FLX (10 mg/kg) primijenjeni su intragastrično 1 sat prije CUS postupka (8:00 do 9:00 ujutro) tijekom 4 tjedna.

Kronični nepredvidljivi stres razvijen je kao što je prethodno opisano (Willner, 1997; Xue et al., 2013), osim za kontrolnu skupinu koja nije bila pod stresom, na štakore je primijenjen niz stresora: stroboskopsko osvjetljenje niskog intenziteta preko noći (120 bljeskova/ min), bijeli šum (100 dB) 1 h, uskraćivanje vode 24 h, prazne boce vode 1 h (nakon uskraćivanja vode), uskraćivanje hrane 24 h, prisilno plivanje (5 min), fizičko sputavanje ({{11 }} h), zaprljani kavez 24 h (200 ml vode u 100 g podloge od piljevine), štipanje repa (1 min), naginjanje kaveza od 45 stupnjeva 24 h, šok 30 min i osvjetljenje preko noći (12 h). Stresori su primjenjivani kontinuirano i nasumično tijekom 4 tjedna, a detalji su opisani u Dodatnoj tablici S1. Hrana i voda bile su slobodno dostupne kontrolnim štakorima bez stresa, koji su ostali neometani u drugoj prostoriji, osim 14-satnog perioda uskraćivanja prije svakog testa saharoze. Jedan je štakor uginuo tijekom CUS postupka. Nakon toga proveden je test prisilnog plivanja (FST).

Nakon 4 dana akutne primjene i nakon 28 dana stresa, proveden je test preferiranja saharoze (SPT) (29. dan), test otvorenog polja (OFT) (31. dan) i test hranjenja sa suzbijanjem novotarija (NSFT) (33. dan). Nacrt dizajna za CUS i testove ponašanja prikazan je na dodatnoj slici S2.

Test prisilnog plivanja proveden je kao što je prethodno opisano (Porsolt et al., 1978). Postupak se sastojao od predtestiranja i testa, korištenjem iste opreme i uvjeta (promjer 20 cm, visina 45 cm, sa 25 cm vode održavane na 26 stupnjeva). Tijekom predtestiranja, štakori su bili prisiljeni plivati ​​15 minuta; 24 sata kasnije, štakori su stavljeni u isti aparat za 5 minuta testa plivanja. Ponašanje unutar plivanja

5 min promatrano je video kamerom, te je mjereno i analizirano trajanje nepokretnosti.

Za SPT, štakori su prvo trenirani da konzumiraju 1 posto (v/v) otopine saharoze 72 sata prije SPT. Osnovni test saharoze prije CUS postupka i SPT na kraju CUS-a provedeni su kako je prethodno opisano (Xue et al., 2013.).

Test otvorenog polja proveden je na kraju CUS postupka, aparatura i metoda bili su isti kao što je prethodno opisano (Xue et al., 2013.). Za bilježenje ukupne prijeđene udaljenosti korišten je sustav za video praćenje (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.).

Test hranjenja s potiskivanjem novotarija procijenjen je kao što je prethodno opisano (Xue et al., 2013.) i zabilježena je i analizirana latencija za početak jela unutar 5 minuta.

Mjerenje neurotransmitera i neurotrofnih čimbenika

Nakon testova ponašanja, najmanje četiri fekalne kuglice dobivene su od svakog štakora, stavljene u sterilne stožaste epruvete i odmah zamrznute na -80°C za analizu mikrobne zajednice i SCFA. Nakon toga su žrtvovani štakori; hipokampus i debelo crijevo su izolirani i odmah izvagani. Uzorci tkiva isprani su fiziološkom otopinom, brzo zamrznuti u tekućem dušiku i čuvani na -80°C radi skladištenja. Nakon uzastopnog odmrzavanja na -20°C i 4°C, uzorci tkiva su homogenizirani u slanoj otopini i centrifugirani 25 minuta na 2500 okretaja u minuti/4°C. Rezultirajući supernatant je sakupljen i pohranjen na 4°C do upotrebe. Razine 5-HT u hipokampusu i debelom crijevu, NE u hipokampusu i BDNF u hipokampusu određene su komercijalnim ELISA kitovima prema protokolima proizvođača (Hou et al., 2017.).

Cistanchemože ublažitibubregbolest

Analiza profila sastava crijevne mikrobiote

Ukupna DNK crijevne mikrobiote iz fekalnih uzoraka ekstrahirana je kako je prethodno opisano (Wei et al., 20{{20}}4). Svaki fekalni uzorak (0.2 g) je umiješan u 1 ml PBS-a, i potpuno homogeniziran dva puta, zatim centrifugiran na 200 g tijekom 6 minuta. Supernatant je dodan s 20 ± 20 posto PVP i centrifugiran na 300 g tijekom 6 minuta. Rezultirajući supernatant je zatim centrifugiran na 12,000 g tijekom 6 minuta i sakupljeni su talozi stanica. Stanične pelete su isprane PBS-om i zatim su resuspendirane u 300 µl lizata I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA・Na2・2H2., pH 8.0). Suspenzija je pomiješana sa 100 µl otopine lizozima (100 mg/ml) i 20 µ 1 posto RNaze, zagrijavana na 37°C tijekom 30 minuta, zatim je dodano 300 µl lizata II (100 mM NaCl, 500 mM Tris baza, pH 8,0) . Suspenzija stanica je nježno pomiješana s 50 ± 20 posto SDS-a, okupana u ledu 5 minuta. DNK je zatim pročišćena sekvencijalnom ekstrakcijom s 1 posto PVP-a, tris-ekvilibriranim fenolom i kloroform-izoamil alkoholom (vol/vol/vol/vol, 3,125:25:24:1), i kloroform-izoamil alkoholom (vol/vol, 24 :1) nakon čega slijedi taloženje na -20°C tijekom 2 sata s dva volumena etanola i 50 ul 3 M NaAc. DNA je sakupljena centrifugiranjem, osušena na zraku i otopljena u 100 ul sterilne deionizirane vode. Čistoća nukleinske kiseline testirana je uporabom spektrofotometra NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Sjedinjene Države). Ukupna genomska DNA zatim je podvrgnuta PCR amplifikaciji pomoću početnica specifičnih za V3-V4 regije gena 16S rRNA: prednje početnice 338F (5'-ACTCTACGGGAGGCAGCA-3') i obrnute početnice 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). PCR amplikoni su pročišćeni Agencourt AMPure zrncima (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Sjedinjene Države) i kvantificirani korištenjem PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, Sjedinjene Države). Nakon pojedinačnog koraka kvantifikacije, amplikoni su skupljeni u jednakim količinama, a sekvenciranje na kraju para 2 x 300 bp izvedeno je pomoću platforme Illumina MiSeq s kompletom reagensa MiSeq v3 u Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Šangaj, Kina). Očitavanja parnih krajeva sastavljena su korištenjem softvera FLASH (verzija 1.2.7), očitanja neobrađenih sekvenci kvalitetno su dotjerana pomoću softvera QIIME (verzija 1.8.0) kako bi se uklonili nepodudarni crtični kodovi i sekvence ispod pragova duljine. Nakon toga, filtrirane sekvence grupirane su u operativne taksonomske jedinice (OTU) s pragom od 97 posto sličnosti sekvence koristeći QIIME s UCLUST-om. Beta raznolikost je provedena na QIIME za težinsku analizu glavnih koordinata UniFrac (PCoA). Konačno, softver Meta stats korišten je za usporedbu razlika u taksonomskom sastavu crijevnih mikroba među različitim skupinama.

Analiza koncentracije SCFA

Koncentracija SCFA (uključujući acetat, propionat, butirat, izobutirat, valerijansku kiselinu, izovalerijansku kiselinu i heksansku kiselinu) u uzorcima izmeta štakora određena je plinskim kromatografom GC{{0}} (Shimadzu, Japan), opremljenim s DB-FFAP stupcem (30 mx 0.25 mm x {{10}}.25 cm, Agilent, Sjedinjene Države). Standardne otopine acetata, propionata, butirata, izobutirata, valerijanske kiseline, izovalerijanske kiseline i heksanske kiseline pripremljene su na 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0.01, odnosno 0,005 mg/ml s eterom (uključujući 2- metil valerijansku kiselinu 0,1 mg/ml kao interni standard). Svaki fekalni uzorak (0,2 g) umiješan je u 0,8 ml deionizirane vode vorteksiranjem i centrifugiranjem na 5,000 okretaja u minuti tijekom 20 minuta na 4°C, 450 il supernatanta dodano je 50 il 50 posto H2SO4 i 500 il internog standarda otopine, vorteksirajući 1 minutu i centrifugirajući na 12,000 okretaja u minuti 10 minuta, zatim je smjesa stavljena na 4°C 30 minuta. Supernatant je uzet za GC analizu. Analiza SCFA provedena je kako je prethodno opisano (Wang et al., 2016.).

Statistička analiza

Svi podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti 土 SEM. Statistička analiza provedena je pomoću softvera SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Sjedinjene Američke Države) s jednosmjernom ANOVA praćenom Dunnettovim testom ili Studentovim t-testom. Podaci su isključeni iz analiza ako su veće od dvije standardne devijacije od srednje vrijednosti. Vrijednosti p < 0.05="" smatrane="" su="" statistički="" značajnim.="" pearsonova="" korelacijska="" analiza="" korištena="" je="" za="" procjenu="" povezanosti="" između="" relativne="" zastupljenosti="" crijevne="" mikrobiote,="" scfa,="" hipokampusnih="" 5-ht,="" ne="" i="" razina="" bdnf-a="" i="" 5-ht="" debelog="">

Cistanchemože ojačati imunitet i sniziti krvni tlak

REZULTATI

Analiza kemijskog sastava CTE

Kemijski sastav CTE-a prvi je sveobuhvatno analiziran. Kao što je prikazano u tablici 1, PhG su bili glavna komponenta CTE, s relativnim sadržajem od 48,6 posto, iridoidi i iridoidni glikozidi bili su 6,9 posto, a ukupni saharidi bili su 20,0 posto. ove

komponente CTE su zatim karakterizirane pomoću UPLC-Q-TOF-MS. Ukupno je otkriveno i identificirano 27 sastojaka, uključujući 20 sastojaka PhG-a, pet iridoida i iridoidnih glikozida te dva oligosaharida. Detaljne informacije uključujući vrijeme zadržavanja, točnu MS i MS/MS fragmente iona navedene su u Dodatnim informacijama (dodatna tablica S2). UPLC-Q-TOF-MS ukupni ionski kromatogram (TIC) CTE prikazan je na dodatnoj slici S3.

CTE je poboljšao depresivno ponašanje kod CUS štakora

U CUS štakora, ukupno vrijeme nepokretnosti u FST-u i latencija za jelo u NSFT-u značajno su smanjeni CTE tretmanom, a preferencija saharoze u SPT-u i ukupna prijeđena udaljenost u OFT-u su povećane.

Slika 1A ilustrira akutne učinke CTE-a na vrijeme nepokretnosti u FST-u kod CUS štakora. U usporedbi sa skupinom CUS modela, 3--dnevna akutna oralna primjena CTE-a značajno je smanjila ukupno vrijeme nepokretnosti u FST [jednosmjerna ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Daljnja posthoc analiza otkrila je da administracija

TABLICA 1|kemijski sastav ekstrakta C. tubulosa CTE sa skupinom s visokom dozom (Dunnettov test, p < 0.05)="" i="" skupinom="" s="" niskom="" dozom="" (dunnettov="" test,="" p="">< 0,05)="" pokazalo="" je="" značajno="" smanjenje="" u="" ukupno="" vrijeme="" nepokretnosti="" u="">

Učinci CTE na preferenciju saharoze u SPT kod CUS štakora prikazani su na slici 1B. Dvadesetosmodnevni postupak stresa uzrokovao je značajno smanjenje sklonosti saharozi u skupini CUS modela u usporedbi s kontrolnim štakorima koji nisu bili pod stresom [jednosmjerna ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; Dunnettov test, p < 0,05],="" što="" ukazuje="" da="" je="" cus="" model="" uspješno="" razvijen.="" kao="" pozitivna="" kontrola,="" flx="" skupina="" značajno="" je="" povećala="" preferenciju="" saharoze="" u="" cus="" štakora="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,05],="" koji="" pokazuje="" prediktivnu="" valjanost="" cus="" modela.="" kronična="" oralna="" primjena="" cte-a="" u="" skupini="" s="" visokim="" dozama="" pokazala="" je="" ključne="" učinke="" na="" preferenciju="" saharoze="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,01],="" koji="" ga="" je="" vratio="" na="" normalne="" razine="" u="" cus="" štakora.="" cte="" sa="" skupinom="" s="" niskom="" dozom="" pokazao="" je="" rastući="" trend,="" ali="" učinak="" nije="" bio="" statistički="" značajan="" (dunnettov="" test,="" p="">

Kao što je prikazano na slici 1C, ukupna udaljenost prijeđena u OFT također je korištena za procjenu učinaka CTE na CUS štakore. U usporedbi sa štakorima bez stresa, skupina CUS modela pokazala je puno kraću ukupnu udaljenost [jednosmjerna ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; Dunnettov test, p < 0.001]="" nakon="" 4-tjednog="" izlaganja="" cus-u="" i="" pozitivnom="" kontrolom="" flx="" tretmana="" povećao="" je="" ukupnu="" udaljenost="" kod="" cus="" štakora="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,05].="" dnevna="" oralna="" primjena="" cte-a="" s="" visokom="" i="" niskom="" dozom="" pokazala="" je="" evidentan="" učinak="" na="" ukupnu="" udaljenost="" u="" cus="" štakora="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" dunnettov="" test,="" p="">< 0,01="" za="" skupinu="" s="" visokom="" dozom,="" p="">< 0,001="" za="" skupinu="" s="" niskom="" dozom].="" dodatna="" slika="" s4="" prikazuje="" mapu="" staze="" aktivnosti="" u="">

Slika 1D prikazuje učinke CTE-a na latenciju jela u NSFT-u kod CUS štakora. Dvadesetosmodnevni postupak stresa izazvao je značajno povećanje latencije za početak jela u skupini CUS modela u usporedbi s kontrolnim štakorima koji nisu bili pod stresom [jednosmjerna ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; Dunnettov test, p < 0,05],="" što="" ukazuje="" da="" je="" cus="" model="" uspješno="" razvijen.="" dugotrajna="" oralna="" primjena="" cte-a="" s="" visokom="" dozom="" pokazala="" je="" evidentne="" učinke="" na="" latenciju="" za="" početak="" jela="" u="" usporedbi="" s="" cus="" grupom="" (studentov="" t-test,="" t="2.759," p="">< 0,05),="" dok="" je="" niska="" doza="" cte-a="" pokazala="" bez="">

CTE je vratio razinu neurotransmitera i neurotrofnih faktora u CUS štakora

Učinci CTE na {{{{10}}}}HT i NE razine u hipokampusu CUS štakora prikazani su na slikama 2A,B. Četverotjedni postupak stresa uzrokovao je značajno smanjenje 5-HT [jednosmjerna ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; Dunnettov test, p < 0,001]="" i="" ne="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,001]="" koncentracija="" u="" hipokampusu="" cus="" štakora="" u="" usporedbi="" s="" onom="" u="" kontrolnoj="" skupini,="" a="" antidepresiv="" flx="" značajno="" je="" obnovio="" 5-razine="" ht="" u="" hipokampusu="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" str="0.0001;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,001].="" nakon="" oralne="" primjene="" cte="" u="" skupini="" s="" visokim="" dozama,="" primijećeno="" je="" značajno="" povećanje="" razine="" 5-ht="">

ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; Dunnettov test, p < 0.001]="" dok="" se="" koncentracije="" ne="" nisu="" mijenjale.="" slično,="" ekspresija="" bdnf="" bila="" je="" značajno="" smanjena="" u="" skupini="" cus="" modela="" u="" usporedbi="" sa="" štakorima="" koji="" nisu="" bili="" pod="" stresom="" (studentov="" t-test,="" t="4.171," p="">< 0,01)="" (slika="" 2c).="" i="" dugotrajna="" oralna="" primjena="" cte-a="" s="" visokom="" dozom="" (studentov="" t-test,="" t="2.548," p="">< 0.05)="" i="" flx="" (studentov="" t-test,="" t="2.263," p="">< 0.05="" )="" povećana="" ekspresija="" bdnf="" u="" usporedbi="" s="" cus="" model="" grupom.="" cte="" s="" niskom="" dozom="" nije="" pokazao="" značajan="" učinak="" na="" ekspresiju="">

Razina {{0}}HT u debelom crijevu CUS štakora bila je drugačija od one u hipokampusu, a 4-tjedni postupak stresa nije imao utjecaja na 5-HT debelog crijeva (Slika 2D ). Nasuprot tome, oralna primjena CTE-a s visokom dozom stimulirala je razine 5-HT u debelom crijevu u usporedbi sa skupinom modela CUS (Studentov t-test, t=2.173, p < 0,05).="" cte="" s="" niskom="" dozom="" nije="" pokazao="" učinak="" na="" razinu="" 5-ht="" u="" debelom="">

CTE je regulirao mikrobni sastav crijeva CUS štakora

Učinak CTE na mikrobni sastav crijeva CUS štakora procijenjen je metodom koja se temelji na sekvencioniranju gena 16S rRNA. Utvrđeno je da je 28 dana oralne primjene CTE-a promijenilo mikrobni sastav crijeva CUS štakora i utjecalo na razne

mikrobne taksonomske razine među skupinama štakora (razina klase 1, razina reda 1, razina obitelji 1, razina roda 8 i razina vrste 2). Ovo sugerira da bi zajednica crijevnih mikroba mogla igrati ulogu u antidepresivnim učincima CTE-a. Detaljne informacije o značajno promijenjenim svojtama crijevnih mikroba na različitim taksonomskim razinama prikazane su u tablici 2.

MiSeq sekvenciranje dalo je ukupno 2.132.980 neobrađenih čitanja, nakon kontrole kvalitete, uklanjanja šuma i procesa uklanjanja himere. Zatim su očitanja grupirana u OTU-ove, koji su dodijeljeni taksonima od vrste do razine vrste. Studija analize beta raznolikosti provedena je kako bi se istražila sličnost obrazaca bakterijske zajednice među pet skupina štakora. PCoA temeljen na ponderiranim UniFrac udaljenostima crijevne mikrobiote iz pet ispitivanih grupa štakora prikazan je na slici 3A. Beta analiza raznolikosti pomoću PCoA pokazala je jasno odvajanje mikrobne zajednice od kontrolne skupine i skupine s CUS modelom, dok je CTE s visokom dozom skupine bio bliži kontrolnoj skupini u usporedbi s CUS skupinom.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 posto . Kao što je prikazano na dopunskim slikama S5A, B, 4-tjedni postupak stresa uzrokovao je neznačajan trend prema povećanju razine Firmicutes i neznačajno smanjenje Bacteroidesa u skupini modela CUS u usporedbi s kontrolnom skupinom. Nakon dnevne primjene CTE s visokom i niskom dozom, relativna brojnost Firmicutes i Bacteroidetes vratila se na slične razine kontrolne skupine, iako bez statističke značajnosti. Iako su slične promjene primijećene za omjer Firmicutes/Bacteroidetes među skupinama štakora, nisu prikazane statističke razlike (dodatna slika S5C). Neznačajan trend prema smanjenoj razini vrste cijanobakterija pronađen je u CUS modelnoj skupini u usporedbi s kontrolnim štakorima koji nisu bili pod stresom; dok je primjena CTE-a s visokom dozom rezultirala značajnim povećanjem relativnog broja cijanobakterija u usporedbi s CUS skupinom (dodatna slika S5D).

Na razini roda, Bacteroides i Ruminococcus bile su dvije najzastupljenije mikrobne taksone koje su činile približno 30 posto relativne brojnosti u svih pet skupina štakora. Četverotjedni postupak stresa uzrokovao je značajno smanjenje relativnog obilja Bacteroidesa i značajno povećanje Ruminococcusa u skupini CUS modela u usporedbi s kontrolnim štakorima koji nisu bili pod stresom (Slike 4A, B). Dugotrajna primjena CTE rezultirala je značajnim povećanjem obilja Bacteroides kao i značajnim smanjenjem Ruminococcus u usporedbi sa štakorima CUS. Osim toga, šest rodova Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus i Brachybacterium pokazalo je statistički značajne razlike između skupine CUS modela i kontrolne skupine (slike 4C-H). Nakon 28 dana liječenja CTE-a, relativna brojnost gore navedenih šest rodova je promijenjena na razine slične onima u kontrolnoj skupini.

Niska brojnost Deinococcusa na različitim taksonomskim razinama, uključujući razinu klase (Deinococci), razinu reda (Deinococcales), razinu porodice (Deinococcaceae) i razinu roda (Deinococcus) otkrivena je u CUS skupini štakora, dok nije otkrivena u kontrolnoj skupini. skupina i administrativne skupine (slike 5A-D).

Na razini vrste, Weissella beninensis bila je mnogo niža u CUS skupini nego u kontrolnoj skupini, a značajno povećanje relativnog broja uočeno je nakon primjene CTE s visokom dozom (Slika 5E). Suprotno tome, primjena CTE-a poništila je značajno povećanje relativnog obilja konglomerata Brachybacterium uočeno u CUS štakorima (Slika 5F).

CTE modulirani SCFA u CUS štakora

Koncentracije SCFA (uključujući acetat, propionat, butirat, izobutirat, valerijansku kiselinu, izovalerijansku kiselinu i heksansku kiselinu) u uzorcima izmeta štakora analizirane su pomoću GC i prikazane su na slici 6. Razine acetata [jednosmjerna ANOVA, F( 4,32)=2.721, str=0.0467; Dunnettov test, p < 0.05]="" i="" heksanska="" kiselina="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" dunnettov="" test,="" p="">< 0,05]="" bili="" su="" značajno="" povećani="" u="" štakora="" skupine="" cus="" modela="" u="" usporedbi="" s="" kontrolnom="" skupinom.="" nakon="" dugotrajne="" primjene="" cte="" s="" visokom="" dozom,="" acetat="" (studentov="" t-test,="" t="2.182," p="">< 0,05)="" i="" heksanska="" kiselina="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" str="0.0328;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,05]="" koncentracije="" su="" pretežno="" smanjene="" u="" usporedbi="" s="" cus="" skupinom,="" što="" ukazuje="" da="" bi="" cte="" mogao="" ispoljavati="" svoju="" antidepresivnu="" aktivnost="" putem="" moduliranja="" poremećenih="" neuroaktivnih="" metabolita="" scfa.="" primjena="" cte-a="" s="" niskom="" dozom="" skupine="" pokazala="" je="" trend="" pada,="" ali="" bez="" značajnog="" učinka="" na="" koncentracije="" acetata="" i="" heksanske="">

Korelacijska analiza crijevne mikrobiote, neurotransmitera i neurotrofina u hipokampusu, 5-HT u debelom crijevu i SCFA

Kako bi se istražio funkcionalni odnos promijenjene crijevne mikrobiote na razini roda, promijenjenih neurotransmitera i neurotrofina u hipokampusu i debelom crijevu te uznemirujuće koncentracije SCFA, razvijeni su Pearsonovi koeficijenti korelacije (Meng et al., 2017). Korelacije između njih (r > 0.4 ili r < -0.4,="" p="">< 0.05)="" prikazane="" su="" na="" slici="" 7.="" koeficijenti="" su="" pokazali="" jake="" korelacije="" između="" promijenjenog="" sastava="" crijevne="" mikrobiote="" na="" razini="" roda,="" koncentracije="" sedam="" tipova="" scfa="" i="" monoaminskih="" neurotransmitera="" povezanih="" s="" depresijom="" (5-ht="" i="" ne).="" obilje="" ruminococcus-a="" pokazalo="" je="" značajnu="" negativnu="" korelaciju="" s="" 5-ht="" koncentracijom="" u="" hipokampusu,="" što="" znači="" da="" cus="" postupak="" dovodi="" do="" povećanja="" relativnog="" obilja="" ruminococcus-a="" i="" smanjenja="" 5-ht="" koncentracija.="" nakon="" tretmana="" s="" cte,="" relativna="" brojnost="" ruminococcus="" smanjena="" je="" na="" razinu="" kontrolne="" skupine,="" a="" utvrđeno="" je="" da="" su="" se="" razine="" 5-ht="" poboljšale.="" nadalje,="" relativna="" zastupljenost="" bacteroidesa="" bila="" je="" u="" pozitivnoj="" korelaciji="" s="" 5-ht="" razinom="" u="" hipokampusu,="" a="" negativno="" povezana="" s="" koncentracijom="" butirata,="" izobutirata,="" valerijanske="" kiseline,="" izovalerijanske="" kiseline="" i="" heksanske="" kiseline;="" obilje="" parabacteroides="" pokazalo="" je="" značajnu="" pozitivnu="" korelaciju="" s="" 5-ht="" razinom="" u="" hipokampusu="" i="" koncentracijom="" propionata,="" dok="" je="" pokazalo="" negativnu="" korelaciju="" s="" koncentracijama="" izobutirata="" i="" izovalerijanske="" kiseline;="" također="" je="" primijećena="" značajno="" pozitivna="" povezanost="" između="" relativne="" količine="" butyricimonas="" i="" razine="" ne="" u="" hipokampusu,="" a="" relativna="" brojnost="" deinococcusa="" bila="" je="" u="" pozitivnoj="" korelaciji="" s="" koncentracijom="" acetata.="" ovo="" je="" pokazalo="" da="" bi="" cte="" mogao="" ispoljavati="" svoju="" antidepresivnu="" aktivnost="" mijenjanjem="" sastava="" crijevne="" mikrobiote,="" remećenjem="" razina="" neurotransmitera="" u="" hipokampusu="" i="" vraćanjem="" neuroaktivnih="" metabolita="" scfa.="" detaljni="" podaci="" korelacijske="" analize="" prikazani="" su="" u="" dodatnoj="" tablici="">