Oksidativni stres, disfunkcionalni energetski metabolizam i destabilizirajući neurotransmiteri izmijenili su cerebralni metabolički profil u štakorskom modelu simuliranog ronjenja Heliox zasićenja na 4.0 MPa Ⅱ

Postupak ekstrakcije tkiva

Postupak ekstrakcije polarnih metabolita iz uzoraka tkiva bio je manja modifikacija kako je objavljeno [18]. Prethodno izvagani uzorci smrznutog tkiva odmrznuti su na ledu i potom podvrgnuti mehaničkoj homogenizaciji u ledeno hladnom sustavu otapala metanol-kloroform-voda stupnja HPLC (400 μL, 400 μL, odnosno 285 μL na 100 mg moždanog tkiva) pomoću homogenizatora tkiva (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Francuska). Rezultirajući homogenati su zadržani na ledu 30 minuta i zatim centrifugirani na 12,000 xg 10 minuta na 4˚C. Supernatant svakog uzorka je zatim uklonjen i liofiliziran kako bi se dobio prah koji sadrži polarne metabolite u sušilici zamrzavanjem (FD-1A-80, BIOCOOL, Kina). Svaki uzorak praha naknadno je rekonstituiran s 550 μL PBS pufera s 0,1 posto TSP, a svi su uzorci zatim temeljito rota-promiješani i centrifugirani na 12,000 xg tijekom 20 minuta na 4˚C. Alikvot od 500 μL supernatanta je zatim prebačen u NMR epruvetu promjera 5,0 mm (Norrel, UK). Princip ekstrakcije proteina u uzorku korteksa bio je kao što je prethodno opisano bez modifikacija. Točna količina uzoraka korteksa izlivena je u pufer za homogenizaciju (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmol/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1 posto Triton X-100, aprotinin, pepstatin A i leupeptin 10 ug/ml svaki) i homogenizirano ručno u ledenoj kupelji. Smjesa je centrifugirana na 1,000 xg tijekom 10 minuta na 4˚C, a supernatant je korišten za kvantificirane koncentracije proteina pomoću Bradfordovog testa.

Kliknite ovdje da saznate Cistancheovu antioksidacijsku funkciju

Biokemijska analiza

Primijenjen je osjetljiv, kompetitivan enzimski imunosorbentni test (ELISA) s testnim setovima za kvantifikaciju metaboličkih enzima Na-KATPaze i AChE i neurotransmitera DA, E, NE, 5HT i GABA. ELISA je također odredila razine SOD, MDA i GPx u kortikalnom tkivu pomoću pribora za ispitivanje prema uputama proizvođača.

NMR mjerenje

Učinkovita kvantifikacija tkivnih metabolita postignuta je korištenjem analitičke platforme koja se temelji na tekućem Bruker Avance-III NMR spektrometru visoke rezolucije opremljenom visokoosjetljivom kriogenom sondom koja radi na frekvenciji od 600. 17 MHz za 1 H promatranje na 298 K. Jednodimenzionalni 1 H ZGPR (TOPSPIN verzija 3.0, Bruker Biospin) impulsni slijed (RD-90˚-ACQ) primijenjen je na dobiti NMR podatke za svaki uzorak. Četiri lažna skeniranja i 128 prijelaznih pojava snimljeno je u vremenskoj domeni od 32 K podatkovnih točaka korištenjem spektralne širine od 20 ppm s odgodom opuštanja od 10,0 s i vremenom prikupljanja od 2,73 s. Eksponencijalna funkcija širenja linije od 0,3 Hz i nulto punjenje do 64 K podatkovnih točaka primijenjeni su na sve padove slobodne indukcije (FID) prije Fourierove transformacije. Dodatne dvodimenzionalne NMR tehnike s korelacijskom spektroskopijom gradijenta pulsirajućeg polja (gCOSY) i 2D homonuklearnom totalnom korelacijskom spektroskopijom (TOCSY) korištene su upotrebom standardnih pulsnih programa na odabranim uzorcima kako bi se potvrdile dodjele kemijskog pomaka. Automatizirani izmjenjivač uzoraka za kontinuiranu isporuku uzoraka korišten je u svim spektrima.

Identifikacija i potvrda metabolita

NMR signali temeljeni na položaju pojedinačnih rezonancija na spektrima identificirani su u programskom paketu Chenomx NMR Suite v. 8.4 (Evaluacijska verzija). Potvrde nekih dodjela metabolita provedene su uzimajući u obzir kemijske pomake, konstante spajanja i obrasce višestrukosti metabolita kao informacije o skalarnim sprezanjima ekstrahirane iz 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, javnih NMR baza podataka kao što su COLMAR i Human Metabolome Baza podataka (HMDB), te literatura [18, 19].

Multivarijantna statistička analiza

Protokol predprocesiranja korišten za prethodnu obradu svakog 1D 1H NMR spektra bio je isti kao onaj opisan u našem prethodnom radu [20]. 1H NMR spektri su razvrstani i korigirani prema osnovnoj liniji koristeći MestReNova (Mestrelab Research, SL, Španjolska), a spektralna regija svakog metabolita integrirana je u jednu kantu. Rezonancije signala organskog otapala i rezidualnog H2O/HOD signalnog područja uklonjene su u svim 1D 1H NMR spektrima. 0.{{30}}03 Hz bucket postupak i normalizacija na zbroj spektralnog intenziteta pomnoženog s 10000 primijenjeni su u svim spektrima. Za analizu u sljedećem koraku odabrane su samo najveće skupne vrijednosti u jednom vrhu kako bi se izbjeglo pogrešno tumačenje diskriminantnih metabolita zbog preklapajućih signala. Potom su ekstrahirane integralne skupine od 47 metabolita i podvrgnute univarijatnoj i multivarijatnoj analizi podataka. Analiza diskriminacije analizom glavnih komponenti (PCA) i analiza diskriminacije djelomičnom diskriminantnom analizom najmanjih kvadrata (PLS-DA) i diskriminantnom analizom ortogonalnih projekcija na latentne strukture (OPLS-DA) provedena je pomoću programskog paketa SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics , Umeå, Švedska) skalirano na podatke o jediničnoj varijanci. Dijagrami rezultata PCA i PLS-DA ilustrirani su s prvom i drugom glavnom komponentom (t[1], t[2]), dok je dijagram rezultata OPLS-DA korišten t[1] i ortogonalnom komponentom (to[1) ]). Parametri Q2 (cum), R2Y (cum) i R2X (cum) izračunati su kako bi se testirala robusnost diskriminacijskih modela protiv prekomjernog opremanja [21]. Kao što je prethodno opisano, vrijednost procjene kvalitete Q2 � 0,4 smatra se pouzdanim modelom. Strategija sedmerostruke unakrsne provjere i test permutacije 200 puta s prvom komponentom primijenjeni su kako bi se spriječilo prekomjerno opremanje modela i dodatno potvrdila pouzdanost i pouzdanost modela. Ako je Q2 regresijska linija imala negativan presjek i Q2 vrijednosti uklopljene u krajnju lijevu točku bile su veće od svih Q2 vrijednosti desnih točaka u permutiranom testu, uspostavljeni OPLS-DA model bio je robustan [22]. Zadana 10-strategija unakrsnog provjeravanja presavijanja primijenjena je za zaštitu od pretjeranog uklapanja modela. Općenito, statistika procjene kvalitete (Q2) � 0,4 smatra se pouzdanim modelom, kao što je prethodno opisano. Koeficijenti korelacije (r) i VIP vrijednosti izdvojeni iz OPLS-DA modela korišteni su za identifikaciju metabolita koji su značajno pridonijeli razdvajanju između dviju skupina. Dodatno, promjene puta metabolita između skupina izračunate su pomoću funkcije. IA/IB, gdje IA i IB predstavljaju srednje vrijednosti za integral metabolita u skupinama A i B. Toplinska karta i okvirni dijagrami iscrtani su kako bi se olakšalo razumijevanje varijacija metabolita među skupinama.

Univarijatna statistika metabolitskih integrala

Prosjek metabolita u svakoj skupini izražen je kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Univarijatna analiza također je provedena korištenjem ANOVA (analiza varijance). Statistički značajne razlike između skupina procijenjene su nesparenim t-testom dvaju repova nakon pretvorbe logaritama u softveru GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, SAD). Statistički značajne razlike definirane su vrijednostima p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Sustavna statistička metabolička korelacijska analiza i hijerarhijska klaster analiza

Pearsonov izračun koeficijenta korelacije i hijerarhijska analiza klastera provedeni su na temelju relativnih integrala metabolita u R Studio (verzija 1.4.1717) s malim skriptama. Za svaki par skupina, korelacijska matrica je prikazana u pikselskoj mapi kako je opisano u literaturi [21]. Ukratko, za svaku varijablu u jednoj skupini, korelacije s p vrijednostima manjim od 0.05 smatrane su značajnim statističkim korelacijama i zadržane su za konstruiranje konačne mreže korelacija za ilustraciju latentnih odnosa metabolita unutar skupina i poremećeni metabolički odnosi među skupinama. Crveniji kvadrati označavaju značajniju pozitivnu korelaciju. Plaviji kvadrati označavaju značajniju pozitivnu korelaciju. Bijeli kvadratići označavaju korelaciju bez značaja. Analiza najrelevantnijih cerebralnih metaboličkih putova i mreža pozvanih kao ispitanici u HSD-u provedena je pomoću alata MetaboAnalyst 3.0. Za izvršenu analizu topologije puta odabrana je biblioteka puta sisavaca Rattus norvegicus (štakor). Ovaj pristup također je korišten za pružanje procjena utjecaja puta, stope lažnog otkrivanja (FDR) i p vrijednosti.

Rezultati Kortikalni biokemijski indeksi iz HSD i CON skupina

Kako bi se potvrdili učinci metaboličke promjene HSD-a na moždana tkiva, biokemijski parametri, uključujući metaboličke enzimske aktivnosti Na-KATP, AChE i LDH povezane s energetskim metabolizmom, neurotransmitere DA, E, NE, 5HT i GABA, i theproteini povezani s oksidativnim stresomodTRAVNJAK, MDAi Gpx u tkivima ipsilateralnog korteksa HSD i CON štakora također su određeni (Tablica 1). U usporedbi s kontrolnom skupinom, razine DA, E, NE i MDA značajno su povećane, dok su sadržaji Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD i Gpx smanjeni u HSD modelu. Granica detekcije kompleta testova korištenih u ovom radu navedena je u tablici S3 u datoteci dopunskih materijala.

Tablica 1. Kvantifikacija biokemijskih parametara mjerena je u korteksnom tkivu CON i HSD životinja pomoću ELISA testa s priborom za ispitivanje. (srednja vrijednost ± SD). ukazuje na statističku značajnost.

Metaboliti identificirani u 1H NMR spektrima uzoraka moždanog tkiva

Slika 3 prikazuje tri reprezentativna 1H NMR spektra iz korteksa (Slika 3A), hipokampusa (Slika 3B) i strijatuma (Slika 3C) HSD štakora. Širok raspon istaknutih metabolita identificiran je prema 1H NMR podacima uzoraka moždanog tkiva, a radi se o anionima organskih kiselina (laktat (Lac), malonat (Maln), sukcinat (Suc), malat (Mal), fumarat (FMA) ), 2-hidroksibutirat (2-HB), acetat (Ace), format (For), taurin (Tau), askorbat (Asc), 2-hidroksibutirat (2HIB)), aminokiseline (leucin (Leu), izoleucin (Ile), valin (Val), alanin (Ala), glicin (Gly), tirozin (Tyr), fenilalanin (Phe), aspartat (Asp), glutamin (Gln), glutamat (Glu) , treonin (Thr), serin (Ser), lizin (Lys), asparagin (Asn)), neurotransmiteri (-aminobutirat (GABA)), metaboliti povezani s energijom (kreatin (Cre), adenozin trifosfat (ATP), adenozin monofosfat ( AMP)), metaboliti povezani s fosfolipidima (ofosfoetanolamin (PEA), O-fosfokolin (Pcho), sn-glicero-3-fosfokolin (GPC)) i drugi (mio-inozitol (MI), nikotinamid adenin dinukleotid (NAD plus) ), nikotinska kiselina (Nic), N-acetilaspartat (NAA), nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfat (NADP plus), UDP-N-galaktoza (UDPGa), uridin (Uri), uracil (Ura), cistidin (Cyt) , uridin 5'-monofosfat (UMP), inozin 5'-monofosfat (IMP), inozin (Ino), kolin (Cho), karnitin (Car), glutation (GSH). Tablica S1 prikazuje detaljne informacije o dodjeli metabolita.

Promjene metaboličkog profila otkrivene metabolomičkom analizom

PCA, istraživački i nepristrani pristup analizi 1H NMR spektara iz svih ekstrakata mozga u različitim regijama mozga, prvi je put napravljen kako bi otkrio glavne metaboličke trendove potaknute hiperbaričnom izloženošću 400 msw okolina heliox saturation. Dijagram raspršenja PC1 u odnosu na PC2 dobiven iz PCA (S1A–S1C slika) integralnih skupnih podataka otkrio je određenu diskriminaciju s određenim preklapanjem između dviju klasifikacija. Nadzirana istraživanja modela PLS-DA (S1A'–S1C' Slika) i OPLS-DA (Slika 4A–4C) pokazala su jasnu klasnu diskriminaciju metaboličkih profila između skupina. Slika 4 prikazuje bodovne dijagrame OPLS-DA modela za regiju korteksa (A), regiju hipokampusa (B) i regiju strijatuma (C), pokazujući jasnu diskriminaciju između HSD skupina i kontrola. Visoka objašnjena varijacija i dobrota predviđanja koja se ogleda u vrijednostima R2X i Q2 (S1A'–S1C' Slika, Slika 4A–4C) i dijagramima ispitivanja permutacije (Slika 4'-4C'A) ukazali su na robusnost generiranih nadziranih modela. Koeficijent korelacije (r) izdvojen iz dijagrama S-linije, važnost varijable u projekciji (VIP) i p-vrijednost iz neparametarskih univarijatnih testova prikupljeni su za procjenu značajnih metabolita odgovornih za uzorke razlikovanja klase. Stoga, ispunjavajući bilo koji od tri kriterija (apsolutna vrijednost r veća od 0.50, vrijednost VIP veća od 1,0, zajedno s p vrijednošću manjom od 0,05), odabrali smo panel statistički značajnih metabolita (Tablica 1) odgovoran za odvajanje između CON i HSD skupina. U tablici 1, vrijednosti promjene puta veće od 1 označavaju povećanu razinu u HSD skupini, dok vrijednosti promjene puta manje od 1 označavaju smanjenu razinu u skupini HSD. Srednje SD vrijednosti diskriminativnih metabolita navedene su u tablici S2. Koristeći hijerarhijsku klaster analizu metabolita i metodu prosječnog povezivanja, generirana toplinska karta (Slika 5A–5C) s dendrogramima omogućuje bolju vizualizaciju metaboličkih promjena tri regije mozga uzrokovanih hiperbaričnom izloženošću u okolišu zasićenom kisikom helijem.

Metabolički poremećaji opaženi u različitim regijama mozga HSD štakora

Gore spomenuta multivarijatna analiza i univarijatna analiza korištenjem visine metabolita u različitim skupinama pružila je sjajnu radnu cijev za identifikaciju diskriminativnih metabolita otkrivajući potencijalne neurološke metaboličke promjene povezane s HSD događajima. Povišeni AMP, FMA, Nic i Phe te smanjenje Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura i Uri pronađeni su u tkivu korteksa HSD-a. skupini u usporedbi sa skupinom CON (Slika 5A, Tablica 1). U međuvremenu, u hipokampusu su se Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr i Ura također smanjili, a AMP je porastao u HSD skupini, kao što je bio slučaj u korteksu. Štoviše, pojačani Thr i smanjeni Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc i DMA eksprimirani su u ekstraktima hipokampusa HSD skupine u odnosu na kontrole (Slika 5B, 5D, Tablica 1). U usporedbi s CONS skupinom, sadržaj Cyt, GABA, Ura, Cho i Thr također se smanjio kao iu korteksu i hipokampusu. Dodatno, povećane razine aminokiselina razgranatog lanca (BCAA, uključujući Leu, Ile, Val) i Lys i smanjene razine Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, niz metabolita ATP-a, Tau, IMP, i Suc, koji se također smanjio u hipokampusu, i druga dva metabolita, Ino i Pcho, koji su također smanjeni u korteksu, primijećeni su u tkivima striatuma štakora iz skupine HSD (Slika 5C, 5D, Tablica 1). Tako mnogo metabolita uvijek ukazuje na implicirane molekularne putove sa složenošću i raznolikošću. Kvantificirane su integralne vrijednosti diskriminantnih metabolita, a statistički značajne višestruke promjene njihovih koncentracija između heliox-zasićene-hiperbarične izloženosti i kontrolnih skupina sažete su u S2 tablici i tablici 2 za tri regije mozga.

Slika 4. Dijagrami rezultata ortogonalne parcijalne diskriminantne analize najmanjih kvadrata (OPLS-DA) i dijagrami testa permutacije koji razlikuju učinak izloženosti zasićenosti helioxom od 400 msw na 1H NMR spektre kontrolnih skupina u korteksu (CONC, n=8, HSDC, n=8, A i A') (R2X=0.38; Q2=0.46), hipokampus (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B i B') (R2X=0.37; Q2=0.43) i strijatum (CONS, n=8, HSDS, n=8, C i C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Vrijednosti parametra Q2 u dijagramima rezultata OPLS-DA, koje su bile jednake ili veće od 0,40, zajedno s Q2 vrijednostima krajnje lijeve točke u permutiranim modelima bile su veće od svih prilagođenih Q2 vrijednosti desnih točaka (permutacija testirati 80 puta), što ukazuje da su utvrđeni OPLS-DA modeli bili valjani.

Pcho, koji se također smanjio u korteksu, primijećen je u tkivima striatuma štakora HSD skupine (Slika 5C, 5D, Tablica 1). Tako mnogo metabolita uvijek ukazuje na implicirane molekularne putove sa složenošću i raznolikošću. Kvantificirane su integralne vrijednosti diskriminantnih metabolita, a statistički značajne višestruke promjene njihovih koncentracija između heliox-zasićene-hiperbarične izloženosti i kontrolnih skupina sažete su u S2 tablici i tablici 2 za tri regije mozga.

Slika 5. Toplinska karta i grafikoni statističke korelacije izvedeni iz skupnih vrijednosti diskriminirajućih metabolita iz korteksa (A, A', uzorci HSDC nalaze se na gornjoj ploči, a CONC na donjoj ploči), hipokampusa (B, B', HSDH skupina leži na gornjoj ploči, a CONH na donjoj ploči), i striatum (C, C', HSDS uzorci leže na gornjoj ploči, a CONS leži na donjoj ploči) tkiva HSD i CON štakora. Metaboliti na toplinskoj karti organizirani su hijerarhijskim grupiranjem na temelju ukupne sličnosti u obrascima razina. Vennov dijagram (D) koji prikazuje preklapanje metabolita među usporedbama HSDC-CONC, HSDH-CONH i HSDS-CONS.

Analiza korelacije metabolita

Odnos između metabolita bio je toliko složen na slici 5A'-5C'. Za energetske metabolite, pozitivne korelacije za Lac naspram Ala u HSDC, AMP naspram IMP u HSDH, ATP naspram Pcho u HSDS, Suc naspram GABA/Gln/Tyr/NAA u HSDS, i negativne korelacije za Lac naspram Thr i GSH naspram Suc u HSDH, Suc naspram Val u HSDS bili su prisutni u dijagramima korelacije metabolita. Za neurotransmitere, pozitivne korelacije za GABA u odnosu na Car u HSDC, GABA u odnosu na Cho u CONH i GABA u odnosu na Suc/Ino/Gln u HSDS bile su prisutne u dijagramima korelacije metabolita. Negativne korelacije za GABA naspram FMA u CONC i GABA naspram NAA/Ura/NADP plus u CONS bile su prisutne u dijagramima korelacije metabolita. Za metabolite koji se odnose naoksidativni stres, thepozitivne korelacijeza GSH vs Asn u HSDC i CONC, Tau vs Lac u HSDH, Tau vs Suc/Ala u CONH, negativne korelacije za GSH vs Suc u HSDH, Tau vs Thr u HSDH bile su prisutne u korelaciji metabolita parcele.

Analiza metabolomičkog puta

Kvantitativna analiza puta koja se sastoji od analize obogaćivanja puta i utjecaja puta iz topologije puta otkrila je visoko statistički značajne modulacije izazvane HSD-om na niz metaboličkih putova. Rezultati utjecaja puta, zajedno sa stopom lažnog otkrivanja (FDR) i p vrijednostima, opisani su na slici 6. Putovi su se smatrali značajno obogaćenima ako su p vrijednosti bile niže od 0.05; profilirani metaboliti (pogoci) u odnosu na ukupne metabolite puta (status podudaranja) bili su viši od 1; i rezultati utjecaja (koji ukazuju na utjecaj značajno pogođenih metabolita u putu na temelju mjere topologije mreže relativne centralnosti između) bili su viši od 0. Putovi u korteksu (Slika 6A) s najvećom vrijednošću metaboličkog utjecaja bili sufenilalanin, tirozin, ibiosinteza triptofana>metabolizam fenilalanina> metabolizam pirimidina > metabolizam alanina, aspartata i glutamata. Putovi u hipokampusu (Slika 6B) s najvećim metaboličkim utjecajem bili su biosinteza fenilalanina, tirozina i triptofana > metabolizam glutationa > metabolizam glicina, serina i treonina > metabolizam purina > metabolizam pirimidina > metabolizam alanina, aspartata i glutamata > metabolizam butanoata . Putovi u striatumu (Slika 6C) s najvećim metaboličkim utjecajem bili su metabolizam alanina, aspartata i glutamata > metabolizam nikotinata i nikotinamida > metabolizam purina.

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950