U ovoj studiji, galaktan egzopolisaharid (EPS) izCistancheKR780676 procijenjen je zbog njegovog potencijala daublažiti oksidativni streskorištenjem in vitro testova i in vivo studija, saccharomyces cerevisiae (divlji tip) i njegoviantioksidans(sod14, sod24, tsa14, cta2 i ctt12)anti-apoptotik(pep4 i fs14) iprotiv starenja(sod24, tsa1 i ctt12)) izogeni mutanti genske delecije. Galactan je pokazao snažan DPPH iaktivnost hvatanja dušikovog oksidas lCso vrijednošću od 450 odnosno 138 ug/mL. U modelu mutantnog kvasca, oksidativni stres koji stvara H,0. je opsežno uklonjen galaktanom u mediju, što je potvrđeno korištenjem testova na licu mjesta nakon čega je uslijedilo fluorescentno DCF-DA bojenje i mikroskopske studije. Liječenje galactanom rezultiralo je smanjenjem ROS-a stvorenog u mutantnim stanicama kvasca, što je prikazano smanjenim intenzitetom fluorescencije. Nadalje, galaktan je pokazao zaštitu od oksidativnog oštećenja putem inhibicije apoptoze izazvane H,O, u mutantnim sojevima kvasca (pep4 i fs1) ​​što je dovelo do povećane stope preživljavanja neutraliziranjem oksidativnog stresa. U analizi kronološkog životnog vijeka, WT stanice tretirane galactanEPS-om pokazale su 8-postotno povećanje održivosti, dok je sod2 mutant pokazao 10-15-postotno povećanje što ukazuje na izražene učinke protiv starenja. Galaktan iz W. confuse KR780676 ima ogroman potencijal da se koristi kao prirodni antioksidans za nutraceutiku, farmaceutsku i prehrambenu tehnološku primjenu. Prema našim saznanjima, ovo je prvo izvješće o dubinskoj procjeni in vivo antioksidativnih svojstava abakterijskog EPS-a u sustavu modela delecije kvasca.

Kliknite da biste obogatili Cistanche u EPS-u

Oksidacija je bitan proces za održavanje bioloških procesa i također za proizvodnju energije u svim živim organizmima. Radikali reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i reaktivnih dušikovih vrsta (RNS) nastaju normalnim katabolizmom molekula kisika, odnosno dušika. Teški oksidativni stres dovodi do raznih degenerativnih stanja kao što su oštećenje DNK, stanična degeneracija i karcinogeneza. To može dovesti do mnogih zdravstvenih problema, kao što sustarenje, kardiovaskularne bolesti, Rak, ciroza, ateroskleroza, dijabetesi reumatoidni artritis2-6, Antioksidansi su molekule koje hvataju slobodne radikale stvorene u hrani ili životnom sustavu i dovode do prevencije zdravstvenih stanja povezanih s oksidativnim oštećenjima-9. Iako su mnogi sintetski antioksidansi dostupni kao jaki hvatači radikala, neki od njih povezani su s nekim neželjenim nuspojavama. S obzirom na to, došlo je do povećanog interesa i potražnje za prirodnim antioksidansima u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji. Za većinu polisaharida na bazi biljaka i gljiva zabilježeno je da su značajna zaštitna sredstva protiv ROS11-21. Razni mikrobni egzopolisaharidi (EPS), uključujući bakterije mliječne kiseline (LAB), također su prijavljeni zbog svojih značajnih antioksidativnih svojstava. Oni se smatraju sigurnijim alternativama sintetičkim. Posljednjih godina, mnogi EPS iz LAB-a su proučavani zbog njihovog antioksidativnog potencijala i prevencije oksidativnog oštećenja22,23. Antioksidativni potencijal i zaštitna uloga Weissella EPS-a također su prijavljeni za razne EPS-ove izolirane iz Weissella mnogih sojeva kao što su Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 i W. cibaria SJ1424–29. In vivo antioksidativna svojstva mogu se proučavati korištenjem različitih modelnih sustava kao što su stanične linije30, C. elegans31, kvasci32 i miševi33. Prethodno su različiti spojevi ispitani na njihova potencijalna antioksidativna svojstva korištenjem sustava mutantnog modela delecije gena kvasca Saccharomyces cerevisiae32,34-37.

Ova je studija usmjerena naantioksidativni potencijal galaktana EPSproizveden probiotičkim sojem Cistanche KR780676 iz indijske tradicionalne fermentirane hrane (tijesto Idli)38,39. U ovom radu, galaktan EPS je ispitan na in vitro antioksidativni potencijal korištenjem DPPH, dušikovog oksida i testova uklanjanja hidroksilnih radikala i in vivo antioksidansa,anti-apoptotikisvojstva protiv starenjakorištenjem sustava mutantnog modela delecije gena kvasca.

Materijali i metode

Sve kemikalije, uključujući dodatke medijima, nabavljene su od Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd., Indija, i DCF-DA (2,7 diklorodihidrofurorescein diacetat) od Sigme.

Mikrobna kultura.CistancheKR780676 izoliran iz indijske kisele fermentirane hrane (Idli tijesto), za koju se navodi da proizvodi galaktan EPS, korišten je u ovoj studiji 38.

Detekcija proizvodnje EPS-a. Proizvodnja EPS-a W. confusa promatrana je na razini kolonije. Ukratko, soj je uzgojen na MRS agaru (s dodatkom 2 posto saharoze). Nakon 48 sati na 30 stupnjeva, uočena je pojava sluzavih kolonija. Proizvodnja galaktana EPS dodatno je potvrđena analizom skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM).

Ekstrakcija EPS-a. Proces ekstrakcije EPS-a izveden je prema metodi opisanoj u Kavitake et al.38. Svježi inokulum (10 posto) W. confusa dodan je u 2 postotni MRS medij pojačan saharozom na 30 stupnjeva tijekom 48 sati pod statičkim uvjetima. Suspenzija je na ovaj način centrifugirana (12,000×g tijekom 15 minuta) kako bi se izolirala biomasa i dalje tretirana s triklor kiselom kiselinom kako bi se eliminirali proteinski dijelovi. Galaktan-EPS je istaložen upotrebom ledeno hladnog etanola (trostruki volumen), centrifugiran (19,200 x g tijekom 15 minuta) i dobiveni EPS je otopljen u Milli-Q vodi. Sirovi EPS je dijaliziran na 12-14 kDa (48 h, 4 stupnja) i osušen zamrzavanjem liofilizacijom 48 h.

In vitro antioksidativna svojstva galaktan EPS-a. DPPH analiza za galaktan izvršena je prema ranijem izvješću Ye et al.9, a postotak aktivnosti čišćenja (postotak) izračunat je sljedećom jednadžbom.

gdje je Ao i As apsorbancija kontrole (slijepa, bez EPS) odnosno uzorka. Test hvatanja radikala dušikovog oksida (NO) za galaktan proveden je prema Sreejayan et al.40 i izračunat prema sljedećoj jednadžbi,

gdje je Ao apsorbancija kontrole (slijepa proba, bez EPS-a), a As je apsorbancija u prisutnosti EPS-a. Smanjenje aktivnosti snage je izmjereno za galaktan EPS kako su izvijestili Ye et al.9. Apsorpcija je očitana na 700 nm, a redukcijski potencijal je naznačen visokim kapacitetom apsorbancije reakcijske smjese. Kao pozitivna kontrola korištena je askorbinska kiselina (Vc). Aktivnost uklanjanja hidroksilnih radikala galaktan EPS-a procijenjena je kako su opisali Yang et al.41. Apsorpcija je očitana na 536 nm i postotak čišćenja je izračunat kao:

gdje je uzorak apsorbancija uzorka, slijepa proba apsorbancija u odsutnosti uzorka i otopine H2O2, a kontrola je apsorbancija u odsutnosti uzorka

In vivo antioksidativna svojstva galaktan EPS u mutantnim sojevima kvasca.

Kvasac, S. cerevisiae, BY4741 divlji tip (WT) (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆), i genski delecijski mutirani sojevi nabavljeni su od Thermo Fisher Scientific, SAD. Sojevi kvasca uzgajani su u mediju peptonske dekstroze kvasca (YPD) s dodatkom ili bez 200 µg/mL Geneticina (G418 sulfat) za selekciju mutanata. Čvrsti medij YPD pripremljen je dodavanjem 2 posto Bacto agara tekućem mediju YPD42.

Učinak EPS-a na rast kvasca. Eksponencijalno rastuća kultura divljeg tipa (WT) kvasca (približno 1 × 104 stanice) tretirana je različitim koncentracijama (0-400 ug/mL) EPS-a u ploči s mikrojažicama i konačni volumen je povećan na 200 μL s YPD bujonom. Kultura je inkubirana 18 sati na 30 stupnjeva nakon čega je uslijedilo serijsko razrjeđivanje i nanošenje na YPD agar ploče. Ploče su inkubirane na 30 stupnjeva 2 dana i izbrojane su jedinice koje stvaraju kolonije (CFU) i vitalnost je izražena kao postotak CFU43.

Mjerenje biomarkera oksidativnog stresa. Eksponencijalno rastuće WT stanice kvasca su prethodno tretirane sa ili bez 300 ug/ml EPS-a tijekom 2 sata. Deset stanica je izloženo 1 mM H2O2 1 h na 30 stupnjeva u inkubatoru za mućkanje i obrađeno za mjerenje aktivnosti SOD i razine peroksidacije lipida prema metodi opisanoj u ranijim izvješćima44-46

Antioksidativno svojstvo EPS-a u mutantima s brisanjem gena S. cerevisiae.

Eksponencijalno rastuće kulture WT kvasca i mutantnih sojeva s nedostatkom antioksidansa (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆ i yhb1∆) tretirane su s 300 ug/mL EPS-a tijekom 2 sata, nakon čega su izložene 1 mM H2O2 tijekom 1 sata. Serijski razrijeđene stanice raširene su na ploče YPD agara, inkubirane 2 dana na 30 stupnjeva i izračunata je održivost. Za ispitivanje na licu mjesta, kulture su serijski razrijeđene u 10-naborima, od čega je 4 μL naneseno na ploče YPD agara i inkubirano na 30 stupnjeva 2 dana i fotografirano 43,47. Detekcija i mjerenje ROS. Eksponencijalno rastući WT i mutantni sojevi s nedostatkom antioksidansa (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆ i ctt1∆) prethodno su tretirani s ili bez EPS-a tijekom 2 sata i izloženi 1 mM H2O2 tijekom 1 sata na 30 stupnjeva. Stanični peleti nakon centrifugiranja na 5000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta dvaput su isprani s PBS puferom, ponovno suspendirani u 200 μL PBS-a i inkubirani s 20 μM DCF-DA u mraku 15-20 minuta na sobnoj temperaturi. Neposredno nakon inkubacije, stanice su isprane dva puta s PBS-om, postavljene na stakalce i promatrane pod Olympus Ix71 fluorescentnim mikroskopom pod 40x objektivom koristeći plavi filter. Za kvantifikaciju ROS-a, stanice obojene DCF DA resuspendirane su u 200 µL PBS-a nakon ispiranja, a intenzitet fluorescencije DCF-a izmjeren je pomoću spektrofluorometra pri maksimumu ekscitacije i emisijskim valnim duljinama od 495/529 nm. Jedinice fluorescencije ucrtane su u odnosu na svaku tretiranu i netretiranu kulturu i uspoređene48,49.

Antiapoptotičko djelovanje galaktana.

Spot i CFU testovi. Eksponencijalno uzgojene WT i mutantne stanice s nedostatkom anti-apoptotika (pep4∆ i fs1∆) prethodno su tretirane EPS-om i inkubirane zajedno s odgovarajućim netretiranim kontrolama 2 sata. Za izbrojavanje CFU, kulture su tretirane ili netretirane EPS-om tijekom 2 sata i inkubirane s 0.5 mM H2O2 tijekom 1 sata. Svaka serijski razrijeđena kultura raširena je na ploče YPD agara i inkubirana na 30 stupnjeva 2 dana, a viabilnost stanica predstavljena je kao postotak CFU. Za ispitivanje na licu mjesta, kulture su dopuštene za serijsko razrjeđivanje nakon čega je slijedilo nanošenje na YPD agar ploče sa ili bez 1 mM H2O2. Ploče su inkubirane na 30 stupnjeva 2 dana i fotografirane47.

Detekcija anti-apoptotskog markera EPS-a

korištenjem mutantnih sojeva kvasca. Kako bi se dodatno potvrdilo spasilačko djelovanje EPS-a na stanice kvasca od apoptotičke stanične smrti inducirane vodikovim peroksidom u kvascu, WT i anti-apoptotski deficijentni mutant sojevi (pep4∆ i fs1∆) ispitani su na markere apoptoze. Eksponencijalno rastuće WT, pep4∆ i fs1∆ stanice su tretirane ili netretirane s 300 µg/mL EPS tijekom 2 sata, a zatim su bile izložene 1 mM H2O2 tijekom 1 sata. I tretirane i netretirane stanice obojene su akridin narančastom i etidijevim bromidom (AO/EB) i promatrane su pod fluorescentnim mikroskopom radi kondenzacije kromatina50,51. Za DAPI bojanje, tretirane i netretirane stanice su fiksirane s 4 posto paraformaldehida i inkubirane s 1 ug/mL DAPI 5-10 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Stanice su postavljene na stakalce nakon ispiranja s PBS-om i promatrane pod Olympus IX71 fluorescentnim mikroskopom (UV filter, 40x objektiv) radi fragmentacije jezgre52,53.

Učinak EPS-a protiv starenja kronološkim ispitivanjem životnog vijeka.

Kulture divljeg tipa kvasca i mutantnih kultura s nedostatkom antioksidansa (sod2∆, tsa1∆ i ctt1∆) uzgajane su kako bi postigle stacionarnu fazu i inkubirane sa ili bez EPS-a za analizu kronološkog životnog vijeka (CLS). Preživljavanje svakog soja izračunato je u različitim vremenskim intervalima od 0 do 30 dana. Vijabilnost stanica izražena je kao postotak CFU i za tretirane i za netretirane kulture54,55. Statistička analiza. Svi eksperimenti su provedeni u triplikatu (±SD) i statistički analizirani pomoću softvera IBM SPSS 20 u jednosmjernom ANOVA modelu. Tukeyev HSD usporedni test (str<0.05) was used to measure the significance level. 

Rezultati i rasprava Bakterije mliječne kiseline (BMK) izolirane iz fermentirane hrane izazvale su ogromnu pozornost prehrambenih tehnologa u posljednjih nekoliko godina zbog svojih dokazanih probiotičkih svojstava. Među bakterijama izoliranim iz indijske fermentirane hrane su Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. i manje istraženi Weisella spp. Kao i drugi korisni laboratorijski hranjivi mikroorganizmi, soj Cistanche KR780676 koji je izoliran iz fermentiranog idli tijesta u našem laboratoriju navodno djeluje kao potencijalni kandidat za probiotike39. U ranijim izvješćima, ovaj galaktan je karakteriziran kao linearni homopolisaharid i također je ispitan na njegova fizikalno-kemijska, funkcionalna i emulgirajuća svojstva38,56-58. Također smo izvijestili da su stanice i stanični supernatanti W. confusa KR780676 pokazali snažno antioksidativno djelovanje39. Proizvodnja EPS-a iz W. confusa KR780676 promatrana je na MRS agar ploči obogaćenoj s 2 posto saharoze, inkubirana 48 h (Slika 1A-i), što je otkrilo sluzave kolonije Weissella i to je dodatno potvrđeno na SEM slici (kolonije Weissella) pokazujući prisutnost galaktan EPS zajedno sa stanicama (slika 1A-ii). Proizvodnja EPS-a korak po korak prikazana je slikovnim prikazom na slici 1B.

In vitro antioksidativna svojstva galaktan EPS-a. Kao što je prikazano na slici 2A, uočeno je da aktivnost čišćenja DPPH ovisi o koncentraciji, aktivnost čišćenja raste s koncentracijom galaktana. Polumaksimalna učinkovita koncentracija (IC50) askorbinske kiseline bila je 8,8 µg/mL, dok je EPS galaktana bio 450 µg/mL. 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) je stabilni slobodni radikal koji delokalizira nesparene elektrone na molekulu kao cjelinu, čime se sprječava dimerizacija molekula i rezultira tamnoljubičastom bojom59. Kada se DPPH otopina doda različitim koncentracijama (50 do 500 µg/mL) galaktana, to dovodi do smanjenja ljubičaste boje kako se koncentracija povećava. Antioksidansi kada reagiraju s elektronom DPPH, tamnoljubičasta boja DPPH prelazi u svijetloljubičastu; a intenzitet boje ovisi o antioksidativnom djelovanju supstrata60. Galactan je pokazao 60 postotni potencijal čišćenja DPPH koji je viši od EPS-a iz endofitne bakterije Paenibacillus polymyxa EJS-3 (<45.40%)33.

Dušikov oksid nastaje kada se natrijev nitroprusid razgradi u vodenoj otopini pri pH 7,2. Nitrat i nitrit nastaju u aerobnim uvjetima kada se dušikov oksid veže s kisikom61. Kao što je prikazano na slici 2B, galaktan ima potencijal smanjiti stvaranje dušikovog oksida iz natrijeva nitroprusida budući da je polumaksimalna učinkovita koncentracija (IC50) 138 µg/mL, dok je standardna askorbinska kiselina bila 11 µg/mL. Kao što je prikazano na slici 2C, aktivnost reducirajuće snage EPS-a je u pozitivnoj korelaciji s njegovom koncentracijom u rastućem redoslijedu. Standard (askorbinska kiselina) pokazao je veći redukcijski kapacitet od galaktan EPS-a, što je u skladu s Ye et al.9. Smanjenje energetske aktivnosti galaktana ukazuje na potencijalno antioksidativno djelovanje. Kada se kalijev fericijanid [K3Fe (CN)6] doda u galaktan EPS, antioksidansi prisutni u njemu reduciraju se u kalijev fericijanid [K4Fe(CN)6]

Slika 2. In vitro antioksidativna svojstva galaktana. (A) Aktivnost hvatanja DPPH radikala, (B) Test dušikovog oksida, (C) Test redukcijske snage i (D) Aktivnost hvatanja hidroksilnih radikala galaktan EPS.

Aktivnost hvatanja hidroksilnih radikala galaktana prikazana je na slici 2D. Galactan je pokazao 41,93 posto kao najveću aktivnost, dok 58,10 posto prema standardu pri istoj koncentraciji (1 mg/mL). Trend rezultata u skladu je s prethodnim izvješćima za EPS iz Lactobacillus plantarum C88 (85,21 posto za koncentraciju EPS-a od 4 mg/mL)62 i Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68,55 posto za koncentraciju EPS-a od 1 mg/mL)63. U usporedbi sa standardima, galaktan je pokazao učinkovitost od 72,16 posto, dok je EPS iz Lactobacillus plantarum C8862 i Paenibacillus polymyxa EJS-363 pokazao učinkovitost od 95,19 odnosno 68,55 posto.

In vivo antioksidativna svojstva galaktan EPS-a u modelu kvasca. Ranija izvješća pokazala su različita biološka svojstva koja promiču zdravlje kao što su antiproliferativna, anti-ulkusna, snižavajuća kolesterola, antioksidativna, protuupalna i imunomodulirajuća svojstva EPS-a izvedenog iz LAB64. S tog stajališta, postaje važno detaljno procijeniti antioksidativni učinak EPS-a koji bi mogao podržati njihov prebiotički i/ili probiotski potencijal, uglavnom za održavanje homeostaze crijeva ublažavanjem oksidativnog stresa. Stanični antioksidacijski mehanizam igra ključnu ulogu u ublažavanju neizbježnog ROS-a koji se stvara kroz ključne stanične metaboličke putove. Neravnoteža između stanične urođene antioksidativne obrane i generiranog ROS-a može biti vrlo štetna za stanice. Teški oksidativni stres uzrokuje potencijalno oštećenje staničnih vitalnih komponenti, proteina, nukleinskih kiselina i lipidnih molekula što zauzvrat utječe na mnoge bitne signalne putove i inducira apoptozu. Pokazalo se da unos antioksidansa hranom smanjuje učestalost markera staničnih oštećenja kao što su razine ROS-a, oštećenje DNK posredovano ROS-om, apoptoza i stanična transformacija što dodatno rezultira smanjenom učestalošću poremećaja povezanih sa starenjem65 Mikrobni EPS poput ksantana i levana. pokazali su antioksidativno djelovanje u in vitro testovima (DPPH i testovi hidroksilnih radikala)5 odnosno protiv stanica raka želuca čovjeka BGC-82366. Prethodno smo u ovoj studiji procijenili antioksidativne, antiapoptotičke i učinke protiv starenja koje ima galaktan EPS izoliran iz W. confusa KR780676 koristeći kvasac Saccharomyces cerevisiae BY4741 kao model organizma.

Učinak EPS-a na rast kvasca. Stanice divljeg tipa kvasca tretirane različitim koncentracijama EPS-a nisu pokazale nikakve defekte u rastu, što potvrđuje da galaktan nije inducirao nikakvu citotoksičnost ili defekte u rastu ni pri jednoj od koncentracija u rasponu od 0 do 400 ug/mL (Slika 3A ). Stanice tretirane s 300 ug/mL ili višom koncentracijom galaktana pokazale su značajno veći rast što ukazuje da je galaktan imao aktivnost stimulacije rasta kvasca.

Koncentracija galaktana od 300 ug/mL koristi se za naknadne pokuse sa sojevima kvasca. Galaktan smanjuje aktivnost enzima SOD. Nakon snažne in vitro antioksidativne aktivnosti koju je pokazao galaktan EPS, dodatno je podvrgnut provjeri njegovog učinka na aktivnost SOD u WT stanicama kvasca. Naši rezultati (Sl. 3B) pokazuju da je oksidativni stres izazvan tretmanom s H2O2 izazvao nagli porast aktivnosti SOD u H2O2-tretiranim WT stanicama u usporedbi s netretiranim stanicama. Nasuprot tome, prethodna obrada WT stanica galaktanom praćena izlaganjem H2O2 rezultirala je dvostrukim smanjenjem aktivnosti SOD u usporedbi s onom kod stanica tretiranih samo H2O2, što ukazuje da galaktan pomaže stanicama kvasca u upravljanju oksidacijom izazvanom superoksidnim radikalima. stres47,67.

Oksidativni stresizazvan tretmanom peroksidom aktivira enzim superoksid i promjena u razini aktivnosti SOD izravna je mjera razine staničnog oksidativnog stresa. U ovoj studiji korištena je metoda redukcije NBT, gdje je NBT pokazatelj proizvodnje superoksidnog radikala. Inhibicija smanjenja NBT izravna je mjera SOD. Budući da se SOD natječe s NBT-om za superoksidne radikale koji nastaju izlaganjem riboflavina vidljivom svjetlu u prisutnosti kisika i metionina, koji je donor elektrona. Superoksid reducira NBT u proizvod plave boje, formazan, koji se može kolorimetrijski mjeriti na 560 nm.

Prethodni izvještaji pokazuju da je LAB EPS pokazao antioksidativni učinak na način ovisan o koncentraciji u in vitro testovima, te u staničnoj liniji raka debelog crijeva i in vivo modelima. Sposobnost EPS-a da čisti ROS može se pripisati njihovim različitim kemijskim skupinama68. Pokazalo se da ostali EPS (500 µg/ml) iz Bacillus amyl liquefacient uvelike utječu na aktivnost SOD i štite HepG2 stanice od oksidativnog stresa izazvanog H2O2 68. Slično tome, EPS iz L. plantarum pokazao je učinak ovisan o koncentraciji na aktivnost SOD u Caco2 stanicama protiv oksidativnog stresa izazvanog H2O2-69. Naši rezultati, u skladu s ovim izvješćima, pokazuju da prethodna obrada galactan EPS-om uklanja superoksidne radikale inducirane H2O2 obradom u WT stanicama kvasca.

EPS smanjuje peroksidaciju staničnih lipida. Malondialdehid (MDA) je najproučavaniji biomarker stanične lipidne peroksidacije koji ukazuje na razinu oksidativnog stresa. MDA je kemijski stabilan, visoko reaktivan dialdehid i može se lako vezati za proteine, nukleinske kiseline i lipoproteine. Vrlo je mutagen i može uvelike utjecati na biokemijska svojstva ovih biomolekula što je štetno za različite signalne putove70. Povećanje razine MDA pokazatelj je oštećenja tkiva izazvanog ROS-om, a njegove povećane razine otkrivene su u nekoliko ljudskih patologija46. U ovoj studiji, kako bi se ispitalo kako prethodni tretman EPS-om utječe na peroksidaciju lipida induciranu H2O2 u WT stanicama kvasca, procijenjene su razine MDA. Rezultati su pokazali smanjenje od približno 1.5- puta razine MDA u stanicama prethodno tretiranim EPS-om, u usporedbi s onima koje su bile izložene samo H2O2, kao što je prikazano na slici 3C.

Prethodno se pokazalo da EPS iz L. plantarum C88 smanjuje razine MDA izazvane tretmanom s H2O2, na način ovisan o dozi (50-200 ug/ml) u Caco2 stanicama, što ukazuje da je peroksidom inducirano oštećenje membrane crijevnih stanica može se ublažiti dodatkom EPS69 (zhang 2013). Nadalje, 500 ug/mL EPS-a iz B. amyloliquefaciens značajno je smanjilo H2O2-inducirani MDA u stanicama HepG271. Naši rezultati o H2O2-induciranim razinama MDA u stanicama kvasca i njegovom značajnom smanjenju nakon prethodnog tretmana stanica galaktan EPS-om pokazuju da tretman galaktan EPS-om smanjuje staničnu peroksidaciju lipida izazvanu ROS-om i zauzvrat može zaštititi stanice od oštećenja tkiva uzrokovanih peroksidnim radikalima i pomaže u održavanju stanične cjelovitosti

eksperimenti. * predstavlja P<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

Galactan štiti mutante antioksidativnog gena kvasca pod oksidativnim stresom. Kako bi se procijenila antioksidacijska sposobnost galaktana, različiti mutanti kvasca s nedostatkom gena antioksidansa (kojima nedostaju različiti geni odgovora na oksidativni stres) tretirani su galaktanom i zatim izloženi subletalnoj dozi H2O2 42. SOD (sod1∆ i sod2∆), katalaza (cta1∆ i ctt1∆), tioredoksin peroksidaza (tsa1∆), glutation reduktaza (glr1∆) i dušikov oksid oksidoreduktaza (yhb1∆) mutanti kada se tretiraju s H2O2. pokazalo je nisko preživljavanje (sod1∆ 10,8 posto, sod2∆ 13,17 posto, tsa1∆ 13,55 posto, cta1∆ 15,34 posto, ctt1∆ 17,06 posto, glr1∆ 27,37 posto i yhb1∆ 33,87 posto) u odnosu na WT. Nasuprot tome, s predtretmanom galaktanom, tolerancija na oksidativni stres se povećala u svim mutantima s nedostatkom gena antioksidansa i njihova održivost se značajno povećala (sod1∆ 78,43 posto, sod2∆ 59,96 posto, cta1∆ 87 posto, ctt1∆ 87 posto, tsa1 ∆ 72,73 posto, glr1∆ 75,26 posto i yhb1∆ 82,41 posto ) kao što je prikazano na slici 4A. Ovi rezultati sugeriraju da galaktan može učinkovito ukloniti slobodne radikale inducirane H2O2 u mutantima kojima nedostaju specifični geni odgovora na oksidativni stres i štiti stanice od oksidativnog stresa. Slična zaštita primijećena je u testu na licu mjesta, gdje je galaktan spasio mutante od oksidativnog stresa i povećao održivost kao što je prikazano na slici 4B.

Stanice su evoluirale s enzimskim antioksidativnim obrambenim sustavima kako bi izdržale endogeni oksidativni stres uzrokovan ROS-om koji nastaje kroz razne fiziološke reakcije, a koje bi inače imale štetne učinke na dobrobit stanice. Prethodna izvješća i naši rezultati u ovoj studiji sugeriraju da EPS može očistiti ROS i poboljšati održivost stanica. Naši rezultati s mutiranim sojevima kvasca koji reagiraju na oksidativni stres upućuju na to da liječenje galaktan EPS-om uklanja i citosolne i mitohondrijske superoksidne radikale inducirane tretmanom s H2O2, što je dokazano povećanom održivošću sod1∆ i sod2∆ mutantnih sojeva kvasca. SOD su primarna enzimska antioksidativna obrana u stanicama protiv endogenog i egzogenog oksidativnog stresa, a mutacije u tim genima su uključene u rak i degenerativne poremećaje. Isto tako, antioksidativno spašavanje cta1∆ i ctt1∆ (mutanti katalaze) tretmanom EPS-om ukazuje da tretman galaktan EPS-om pruža zaštitu od peroksisomalnog i citosolnog oksidativnog stresa izazvanog H2O2. Katalaza je odgovorna za staničnu detoksikaciju vodikovog peroksida i njezin nedostatak povezan je s pojavom poremećaja povezanih sa starenjem. TSA1, tioredoksin peroksidaza je i ribosomski povezan i slobodni citoplazmatski protein koji oslobađa stanice od stresa vodikovog peroksida. Izvješća sugeriraju da TSA1 također ima ulogu u popravljanju oksidativnih oštećenja DNK. Naši rezultati sugeriraju da liječenje EPS-om spašava tsa1∆ stanice kvasca od stresa izazvanog peroksidom. Peroksiredoksini sisavaca imaju pozitivan učinak na rast stanica, metabolizam i imunološke funkcije. Njihov nedostatak rezultira povišenim staničnim oksidativnim stresom koji utječe na ključne signalne putove i uključen je u neurodegenerativne poremećaje, maligne bolesti i upalne bolesti 72. Glutation antioksidativni mehanizam još je jedan enzimski antioksidativni obrambeni sustav prve linije prisutan u stanicama za prevladavanje oksidativnog stresa. GLR1 je kvasčev homolog glutation reduktaze sisavaca, lokaliziran i na citosol i na mitohondrije73. Glr reducira oksidirani glutation (GSSH) u reducirani glutation (GSH) i igra ulogu u održavanju razine GSH u stanicama koje zauzvrat detoksificiraju superoksidne i hidroksidne radikale, štiteći tako stanice od oksidativnog stresa74. Naši rezultati pokazuju visoku osjetljivost glr1∆ kvasca na H2O2 koja je ublažena prethodnim tretmanom galaktan EPS-om što sugerira da bi galaktan EPS mogao zaštititi stanice koje imaju manjak GLR1 od oksidativnog stresa. Zanimljivo je da je nedostatak glutation reduktaze upleten u starenje i metaboličke, degenerativne i kardiovaskularne poremećaje povezane sa starenjem75,76. Kao što je prikazano na slici 4A, yhb1∆ je također bio zaštićen galaktan EPS-om od H2O2 stresa, što sugerira da galaktan EPS štiti stanice koje imaju manjak YHB1 od oksidativnog stresa. YHB1 kvasca omiljeni je hemoglobin za koji se navodi da štiti stanice od stresa dušikovog oksida77 i oksidativnog stresa78. Dokazi sugeriraju da se čini da ljudski homolog YHB1 spašava stanice od toksičnosti alfa-sinukleina koji je biomarker Parkinsonove bolesti79. Ovi prethodni nalazi i naši rezultati sugeriraju da EPS može pospješiti preživljavanje stanica protiv razvoja degenerativnih poremećaja.

Kako bi se procijenila razina ROS-a u mutantima kvasca s prisutnošću i odsutnošću galaktana pod H2O2 stresom, stanice kvasca promatrane su pod fluorescentnim mikroskopom, a razina unutarstanične oksidacije izračunata je spektrofluorometrom47,48. Mutanti kvasca tretirani samo H2O2 pokazali su više zelenih fluorescentnih stanica u usporedbi s onima prethodno tretiranim galaktanom. (Slika 4C). Intenzitet fluorescencije DCF-a povećao se za približno 60 posto, dok se s predtretmanom galaktanom smanjio na približno 30 posto u mutantima kvasca tretiranim s H2O2- u usporedbi s WT i odgovarajućom kontrolom (Slika 4D). I mikroskopski i spektrofotometrijski rezultati ukazuju na povećanu razinu ROS-a u stanicama kojima nedostaju specifični antioksidativni geni u usporedbi s odgovarajućim kontrolama. Kulture prethodno tretirane galaktanom, a potom izložene H2O2, pokazale su smanjenu fluorescenciju u usporedbi s onima bez prethodnog tretmana galaktanom, što sugerira da je galaktan smanjio izloženost H2O2 indukciji ROS-a u mutantnim stanicama kvasca i potiče preživljavanje stanica. U svim gore navedenim eksperimentima, kada su stanice isprane prije dodatka H2O2 nije bilo značajnog spašavanja (dodatni podaci) što ukazuje da je uklanjanje ROS-a galaktanom posljedica izravnog čišćenja u mediju, a ne unutarstaničnog djelovanja.