Nanovlakna oleanolne kiseline umanjuju oksidativni stres u keratinocitima izazvan česticama

Kontaktirajte oscar.xiao@wecistanche.com za više informacija

Sažetak:Čestice u zraku (PM) jedan su od pokazatelja onečišćenja zraka, a ujedno i glavni čimbenik koji uzrokuje oksidativni stres u koži. Oleanolna kiselina (OA), prirodni terpenoidni spoj, učinkovito inhibira starenje kože izazvano PM-om; međutim, OA ima slabu topljivost u vodi i upijanje kožom, što ograničava njegovu primjenu u lijekovima i kozmetici. Cilj ovog istraživanja bio je pripremiti nanovlakna oleanolne kiseline (OAnf) i procijeniti učinke OA i OAnf u keratinocitima tretiranim PM-om. Rezultati su pokazali da (OA otopljen u otopljenom u dimetil sulfoksidu (DMSO) smanjuje prekomjernu produkciju reaktivnih oksigernih vrsta izazvanu PM-om, aktivaciju protein kinaze/Jun-amino-terminalne kinaze (SAPK/JNK) aktiviranu stresom i ekspresije upalnih i kožnih -proteini povezani sa starenjem. Osim toga, proces nanovlakana OA učinkovito je poboljšao topljivost OA u vodi više od 99,000-puta kroz promjenu njegovih fizikalno-kemijskih svojstava, uključujući povećanje površine, smanjenje veličine čestica, amorfnu transformaciju i stvaranje vodikovih veza s pomoćnim tvarima. Sposobnost prodiranja OAnf-a u kožu bila je dosljedno više od 10-puta veća od one OA-a. Štoviše, kada se otopi u PBS-u, OAnf je pokazao superiorne antioksidativne, protuupalne aktivnosti i aktivnosti protiv starenja kože u PM -tretiranih keratinocita nego OA. Zaključno, naša otkrića sugeriraju da bi OAnf mogao biti topikalna formulacija antioksidansa za ublažavanje kožnih problema uzrokovanih PM-om.

Ključne riječi:čestice; oleanolna kiselina; nalno vlakno; antioksidans; protuupalno; protiv starenja

1. Uvod

Zagađenje zraka sada je javnozdravstveni problem u cijelom svijetu. Razvojem tehnologije razne štetne tvari, uključujući plinove, kemijske tvari, biološke zagađivače i čestice, nakupljaju se u atmosferi i ozbiljno utječu na živote i zdravlje ljudi. Čestice (PM), indikator zagađivača zraka, kombinacija su različitih organskih spojeva, biološki dobivenih materijala i čestica ugljikovih jezgri [1]. PM udisanjem ulazi u pluća i ulazi u krvotok uzrokujući sustavne zdravstvene opasnosti kao što su upale organa te kardiovaskularne i respiratorne bolesti [2,3]. Osim toga, PM može proći kroz kožnu barijeru i akumulirati u folikulima dlake te čak prodrijeti u dermis uz ponovljeni kontakt; stoga je prekomjerno izlaganje kože PM-u povezano s vanjskim starenjem kože, promjenama pigmentacije, atopijskim dermatitisom, aknama i psorijazom [2,4]. Produljeni kontakt s PM-om izaziva prekomjernu proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) u keratinocitima, što pokreće nekoliko signalnih putova uključujući put apoptoze, puteve protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) i upalu. U keratinocitima izloženim PM. Štoviše, PM također aktivira matrične metaloproteinaze (MMP) i dovodi do gubitka elastičnosti kože i starenja [5].

Kliknite ovdje da saznate više

Prirodni proizvodi odavno se koriste kao učinkoviti kozmeceutski sastojci. Oleanolična kiselina (OA, 3 -hydroxyolean-12-en-28-oicacid), triterpenoidni spoj s pet prstenova, široko je prisutan u biljkama, voću i povrću [6]. OA je dobro poznat po svojim zaštitnim učincima na jetru kao što je smanjenje akutnog oštećenja jetre izazvanog kemikalijama i fibroze/ciroze kod kroničnih bolesti jetre [6,7]. Osim toga, prethodne studije su otkrile da OA ima antioksidativne, antikancerogene, protuupalne, antidijabetičke i antimikrobne učinke [8] Kim et al. otkrili su da OA može smanjiti ekspresiju proupalnih citokina (TNF-a,IL-6) i proteina starenja kože (MP-1) u keratinocitima tretiranim PM-om [9]. Međutim, fizikalno-kemijska svojstva OA otežavaju otapanje u vodi, što ograničava njegovu primjenu u lijekovima, hrani i kozmetici.

Oblikovanje formulacije za isporuku lijeka kao što su nanonosači na bazi polimera, li. posomi, a nanovlakna se obično koriste za poboljšanje fizikalno-kemijskih svojstava aktivnih sastojaka. Inkapsulacija aktivnih sastojaka s pomoćnim tvarima u ovim farmaceutskim formulacijama mogla bi povećati njihovu topljivost u vodi i upijanje kožom te smanjiti potencijalnu toksičnost i iritaciju kože. Među njima, nanovlakna su formula nano veličine u nastajanju, s velikom površinom, malom gustoćom i velikim volumenom pora, i već se široko koriste u biomedicini, što može smanjiti volumen oralnih lijekova, povećati stabilnost aktivnih sastojaka, kontrolu oslobađanje, poboljšanje bioraspoloživosti i stvaranje umjetnih tkiva [10]. Elektropredenje je uobičajena tehnologija koja se koristi za proizvodnju nanovlakana i vrlo je kompatibilna s masovnom proizvodnjom [1]. Stoga, priprema nanovlakana pomoću procesa elektropredenja može istovremeno poboljšati bioraspoloživost. nost i učinkovitost proizvodnje aktivnog sastojka sa slabom topljivošću u vodi. Polivinil pirolidon (PVPK90) i 2-hidroksipropil- -ciklodekstrin (HPBCD) su spojevi koje je odobrila FDA za otapanje i isporuku hidrofobnih aktivnih farmaceutskih sastojaka ljudima.cistanche kolesterolPrethodne studije pokazale su da su nanovlakna pripremljena s HPBCD i PVPK90 značajno poboljšala topljivost u vodi i prodiranje resveratrola [12] i plai ulja [13] u kožu. Stoga je cilj ove studije bio koristiti PVPK90 i HPBCD kao prijenosnike za pripremu nanovlakana oleanolne kiseline (OAnf) i procijeniti učinke OA i OAnf u keratinocitima tretiranim PM-om.

Cistanche može spriječiti starenje

Cilj ovog istraživanja bio je procijeniti biološki učinak OA otopljenog u DMSO na oštećenje keratinocita izazvano PM-om. Kako bismo prevladali slabu topljivost OA u vodi, upotrijebili smo PVPK90 i HPBCD kao nosače za isporuku za pripremu nanovlakana oleanolne kiseline (OAnf) postupkom elektropredenja, a zatim odredili promjene fizikalno-kemijskih svojstava između sirovog OA i OAnf kako bismo razjasnili poboljšanje topljivosti u vodi i prodiranje kože. Za usporedbu biološkog učinka nakon procesa nanovlakna OA, korišten je model oštećenja keratinocita izazvan PM za procjenu antioksidativne, protuupalne aktivnosti i aktivnosti protiv starenja OAnf i OA.

2. Materijali i metode

2.1.Materijali

Hidrat oleanolne kiseline (OA) kupljen je od Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokio, Japan). Polivinil pirolidon (Luviskol" K90 prah, PVP) je kupljen od Wei Ming Pharmaceutical Mfg. Co., Ltd. Taipei, Tajvan). Hidroksipropil-beta-ciklodekstrin (HPBCD) je dobiven od Zibo Qianhui (Zibo, Kina). Metanol i dimetil sulfoksida (DMSO) kupljene su od Aencore Chemical (Surrey Hills, Australija).Sve kemikalije ili reagensi za stanične kulture bile su biološke čistoće, a druge kemikalije za fizičko-kemijsko određivanje bile su kvalitete tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC).

2.2. Ispitivanje vitalnosti stanica

Određivanje stanične vitalnosti aktivnog sastojka uobičajena je metoda koja se koristi za odabir odgovarajućih raspona koncentracija za aktivne sastojke za procjenu njihove biološke aktivnosti. HaCaT keratinociti su kupljeni od Istituto Zooprofilattico Sperimen-tale della Lombardia edell'Emilia Romagna (Brescia, Italija). HaCaT stanice uzgajane su u DMEM (Himedia Laboratories, Mumbai, Indija) koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma (Hazelton Product, Denver, PA, SAD) s 1 posto penicilin-streptomicina (Biological Indus-tries, Connecticut, NE , SAD), a HaCaT stanice su inkubirane u inkubatoru (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) uz uvjete postavljene na 37 stupnjeva s 5 posto COz. Za pripremu testnih uzoraka, OA i OAnf su otopljeni u DMSO i PBS, respektivno, a zatim je svaki uzorak razrijeđen u DMEM bez fetalnog goveđeg seruma za određivanje vitalnosti stanica. HaCaT stanice su nasađene u 96-pločice s jažicama u gustoći od 1 × 104 stanica/100 μL/jažici tijekom 24 sata. Medij kulture je zatim uklonjen, a stanice su tretirane različitim koncentracijama OA i OAnf u rasponu od 5 do 80 uM u DMEM bez seruma tijekom 24 sata. U vrijeme ispitivanja, medij za tretiranje je uklonjen, a 150 µL 0,5 mg/mL MTT otopine je dodano u svaku jažicu. Nakon 3 sata inkubacije, otopina MTT je uklonjena, a ljubičasti kristali formazana svake jažice otopljeni su u 100 uL DMSO. Apsorbancija na 550 nm svake jažice je zatim izmjerena pomoću spektrofotometra mikroploče (BioTek uQuant, Winoski, VT, SAD). Viabilnost stanica izračunata je sljedećom formulom:

2.3. Određivanje sadržaja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS).

PM (Standardni referentni materijal, SRMB1649b) kupljen je od Nacionalnog instituta za standarde i tehnologiju. Ovaj proizvod je prikupljen 1976. i 197. godine u Washingtonu, DC. Ukupno 10 mg/mL PM-a suspendirano je u PBS-u i zatim sonicirano 10 minuta prije upotrebe. Ukupno 1 × 10 plus HaCaT keratinocita uzgajano je u 96-pločama s jažicama 24 sata pod uvjetima od 37 stupnjeva i 5 posto CO2. Stanice su tretirane različitim koncentracijama OA u DMSO, OA u PBS, odnosno OAnf u PBS tijekom 24 sata. Zatim su inkubirane s otopinom 20 uM diklorodihidrofluorescein diacetata (DCFH-DA; Sigma, Tokio, Japan) 30 minuta. Zatim je u svaku jažicu dodano 50 ug/cm² PM i inkubirano 1 h. Nakon toga su stanice isprane dva puta s PBS-om, a intenzitet fluorescencije svakog uzorka analiziran je pomoću čitača fluorescentnih ploča (ekscitacija: 485 nm; emisija: 528 nm) (BioTek, Winooski, VI, SAD). Sljedeća jednadžba korištena je za izračunavanje postotka inhibicije Proizvodnja ROS-a:

2.4. Western Blot analiza

Ukupno 4 × 105 HaCaT keratinocita uzgajano je u 6-pločama s jažicama tijekom 24 sata. Stanice su zatim tretirane s OA ili OAnf u mediju bez seruma 24 sata nakon čega je uslijedio dodatak PM. Nakon različitih vremenskih točaka, stanice su lizirane puferom RIPAlysis (Merck Millipore, Burlington, MA, SAD), zatim centrifugirane na 12,000 okretaja u minuti tijekom 10 minuta. Za određivanje koncentracije proteina korišten je komplet za analizu BCA proteina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Zatim su proteini odvojeni elektroforezom na natrijevom dodecilsulfatu-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE), a zatim blotirani na membrane od poliviniliden difluorida (PVDF) (Merck Millipore). Membrane su blokirane 1 h i isprane s Tris-puferiranom fiziološkom otopinom ( TBS) s 1 posto Tween-20. Membrane su inkubirane s primarnim antitijelima na 4 stupnja preko noći. Primarna protutijela korištena u ovoj studiji uključivala su ciklooksigenazu-2 (COX-2), matričnu metaloproteinazu-9 (MMP-9), tkivni inhibitor metaloproteinaze-1 (TIMP-1), protein kinaza aktivirana stresom/Jun-amino-terminalna kinaza (SAPK/JNK) (Tehnologija stanične signalizacije, Danvers, MA, SAD), GAPDH (Santa Cruz Bi-otechnology, Dallas, TX, SAD), matrična metaloproteinaza-1 (MMP-1) (Proteintech Group, Rosemont, IL, SAD), p380, izvanstanično regulirane protein kinaze (ERK) i nuklearni faktor kapa-laki-lanac- pojačivač aktiviranih B stanica (NF-kB) (Merck Millipore, Burlington, MA, SAD). Zatim su dodana sekundarna protutijela tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi i reagirala s reagensima za poboljšanu kemilu-minescenciju (ECL; Thermo Fisher Scientific). Protutijela protiv GAPDH korištena su kao unutarnja kontrola. Ekspresija svakog proteina analizirana je pomoću uređaja Touch Imager (e-BLOT; Šangaj, Kina), a ekspresija je kvantificirana pomoću ImageJ.

2.5. Priprema nanovlakana oleanolne kiseline (OAnf)

OAnfs su elektropredeni s različitim omjerima OA:PVP:HBPCD (1:8:5, 1:8:10 i 1:8:20). Elektrospun otopina je pripremljena na sljedeći način: 25 mg OA je otopljeno u 5 mL metanola, te je dodan HPBCD i miješan magnetskom miješalicom da se dobije bistra otopina; zatim je odmah dodan PVPK90 i smjesa je miješana 1 sat.cistanche deserticola nuspojaveNanovlakna su tkana korištenjem FES-COS opreme za elektropredenje (Falco Tech Enterprise Co., Taipei, Tajvan) pod sljedećim uvjetima: štrcaljka od 10 mL s iglom unutarnjeg promjera 0. 22 mm korišteno je za elektropredenje; brzina protoka je podešena na 0,2 mL/h; primijenjeni napon postavljen je na 12 KV; udaljenost vrh-kolektor bila je 10 cm. Nakon procesa elektropredenja, nanovlakna su skupljena pomoću aluminijske folije. Novosintetizirana nanovlakna stavljena su u zapečaćenu plastičnu vrećicu i pohranjena u spremnik otporan na vlagu.

2.6. Analiza oleanolne kiseline visokoučinkovitom tekućinskom kromatografijom (HPLC)

Sustav HPLC analize (LaChrom Elite L{{0}}, Hitachi, Tokio, Japan) sastojao se od L-2130 pumpe, L-2200 autosamplera i L{{3 }} ultraljubičasto vidljiv (UV-vis) detektor. Kolona za analizu bila je kolona Mightysil RP-18 GP (250×4,6 mm id., 5 um). Mobilna faza bila je sastavljena od metanola i 0,1 postotne otopine ledene octene kiseline u fiksnom omjeru (95:5; w/v). Brzina protoka mobilne faze bila je 1 mL/min, a valna duljina detekcije UV detektora bila je postavljena na 215 nm. Vrhunac apsorpcije oleanolne kiseline pojavio se nakon 7,5 minuta. Kalibracijska krivulja oleanolne kiseline pokazala je dobar linearni （r =0.999） unutar raspona 0.01-100 ug/mL.

2.7. Morfologija, promjer vlakana i mjerenje veličine čestica OAnf

Različiti uzorci nanovlakana presvučeni su platinom s ionskim premazom (E{{0}}, HITACH, Tokio, Japan); uvjet je postavljen na 10 mA 120 s kasnije. Morfologija i oblik svakog uzorka promatrani su skenirajućim elektronskim mikroskopom (Hitachi S4700 Hitachi, Tokio, Japan). Promjer svakog uzorka izračunat je softverom image j. Za mjerenje veličine čestica OAnf korišten je analizator Zetasizer 3000HS (Malvern, Worcestershire, UK). Veličina čestica OA i OAnf izmjerena je pri koncentraciji od 1 mg/mL odnosno 0,1 mg/mL.cistanche dosage redditOsim toga, također smo promatrali ujednačenost morfologije OAnf nakon otapanja u vodi pomoću prijenosnog elektronskog mikroskopa (TEM, JEM{{0}}EXII instrument, JEOL Co., Tokio, Japan). Ispitni uzorak je podešen na 1 ug/mL OA u deioniziranoj vodi i zatim je ukapan u bakrenu mrežicu, a zatim je odmah ukapano 0,5 posto (w/v) fosfovolframove kiseline. Nakon sušenja, svaki uzorak je stavljen na TEM radi promatranja.

2.8. Punjenje lijekom i učinkovitost enkapsulacije OAnf

Vrlo je važno odrediti punjenje lijekom i učinkovitost enkapsulacije sustava za isporuku za procjenu izvedbe farmaceutskog procesa. Opterećenje lijekom izračunato je kao postotak utvrđenog sadržaja i teorijskog sadržaja OA sadržanog u OA nanovlaknima. Za određivanje punjenja lijekom 100 μL svakog uzorka dodano je u 900 μL metanola, a koncentracija OA je bila gdje je CoA koncentracija OA iz OAnf, WoA je teoretska količina dodanog OA, VoAnf je volumen otopine OAnf.

Učinkovitost inkapsulacije pokazuje jesu li nanovlakna uspješno inkapsulirala aktivne spojeve. Uzorci OAnf-a otopljeni su u deioniziranoj vodi i dodani u uređaje za centrifugalni filter (Microcon YM-10, Millipore, Billerica, MA, SAD), a zatim centrifugirani na 12,00 okretaja u minuti 10 minuta rashladna centrifuga (Centrifuge 5430R, Eppendorf, Hamburg, Njemačka). Inkapsulirani dio je zadržan u gornjoj epruveti, a nekapsulirani dio je skupljen iz donje epruvete zbog razlike u molekularnoj težini. Količina neinkapsuliranog OA detektirana je gore spomenutom HPLC metodom. Sljedeća jednadžba korištena je za izračunavanje učinkovitosti kapsuliranja:

gdje je AoA teoretska količina OA (dobivenog iz uvjeta hranjenja) ugrađenog u nanovlakna, a Aunentrapped OA je količina neinkapsuliranog OA.

2.9. Topljivost OAnf u vodi

Sirovi OA (1 mg) i formulacije OAnf u različitim omjerima (koje sadrže ekvivalent od 1 mg oleanolne kiseline) otopljene su u 1 mL deionizirane vode, redom, a zatim sonicirane pod ultrazvučnim uređajem (Branson 5510, Emerson Electric, St. Louis, MO, SAD) 20 min. Svaki uzorak je filtriran kroz membranu od 0,45 um (Pall Corporation, Washington, NY, SAD) i razrijeđen 10-puta. Razrijeđene otopine su analizirane HPLC-om, a standardna krivulja je korištena za određivanje količine oleanolne kiseline za usporedbu njihove topljivosti u vodi.

2.10. Određivanje kristalne u amorfnu transformaciju

Za analizu kristalnog oblika OA, pomoćnih tvari i OAnf korištena je rendgenska difraktometrija (Siemens D500, Karlsruhe, Njemačka). Analiza je provedena pomoću Cu-Ka zračenja filtriranog niklom, uz korištenje napona od 40 kV i struje od 25 mA. Brzina skeniranja bila je 1 stupanj/min, a raspon skeniranih kutova bio je od 5 stupnjeva do 50 stupnjeva. 2.11. Intermolekulska interakcija između OA i pomoćnih tvari

Fourierova transformacija infracrvene spektroskopije (FTIR) i 1H nuklearna magnetska rezonancija (1H NMR) obično se koriste za potvrdu intermolekularne interakcije između aktivnih sastojaka i pomoćnih tvari. Oleanolna kiselina, PVP, HPBCD i formulacije OAnf u različitim omjerima pomiješane su s kalijevim bromidom (KBr) u volumnom omjeru 1:9 pomoću tarionika i prešane u tablete. Svaki uzorak je zatim analiziran FTIR spektrofotometrom (Perkin-Elmer 200 spektrofotometar, Perkin-Elmer, Norwalk, CT SAD). Raspon skeniranja bio je 400-4000 cm-4. Osim toga , svaki uzorak je otopljen u 0,8 mL 99,8 posto DMSO-dg (Merck, St. Louis, MO, SAD) i analiziran JEOL Alpha 400 spektrometrom (Nihon Denshi Co., Tokyo, Japan).

2.12. Ex vivo prodiranje oleanolne kiseline i njezinih nanovlakana u kožu

Ovaj je eksperiment izveden u skladu sa standardnim protokolom smjernica Europske udruge za kozmetiku i parfumeriju (COLIPA). Franzov difuzijski stanični sustav može se podijeliti na staklene posude gornje donorske komore i donje receptorske komore. Ukupno 1,5 mL puferske otopine koja sadrži 0.14MNaCl,2mMK-HPO4, 0.4 mM KH2PO4 (pH7.4) stavljeno je u receptorsku komoru i miješano magnetskom šipkom pri 600 okretaja u minuti tijekom cijelog vremena eksperiment, pokus. Svježa koža bokova svinje dobivena je od lokalnog mesara na tržnici i ohlađena tijekom razdoblja eksperimenta. Svaki uzorak kože izrezan je na komade veličine 2 cm × 2 cm i stavljen između dvije komore, s rožnatim slojem okrenutim prema gore. Franzova difuzijska ćelija održavana je na 32 stupnja s cirkulirajućom vodenom kupelji.dobrobiti ekstrakta cistancheZatim je 200 µL 1 mg/mL OA ili OAnf dodano u komoru za donore tijekom 1, 2 ili 4 sata. Nakon toga je svinjska koža uklonjena iz Franzove difuzijske ćelije, a stratum corneum je dobiven skidanjem trake 15 puta. Svaki rezidualni uzorak kože zagrijan je na 95 stupnjeva toplinskom pločom, a epidermis i dermis odvojeni su skalpelom. Svaki uzorak je uronjen u metanol i sonikiran 1 sat da se ekstrahira OA, a sadržaj oleanolne kiseline u svakom uzorku određen je HPLC metodom. 2.13. Statistička analiza

Svi podaci prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Statistička značajnost između različitih skupina analizirana je analizom varijance (ANOVA) s Tukeyjevim post hoc testom.p<0.05 indicated="" statistical="" significance.="">

3.1. Oleanolna kiselina može suzbiti upalu, starenje i ROS/MAPKs signalne putove kod oštećenja keratinocita izazvanih PM-om

Kako bi se pronašao odgovarajući raspon koncentracija za procjenu biološke aktivnosti, citotoksičnost OA otopljenog u DMSO određena je u ljudskim HaCaT keratinocitnim stanicama pomoću MTT testa. Kao što je prikazano na slici 1A, 40 i 80 µM OA bili su povezani s 32 do 16 posto održivosti stanica. OA s manje od 20 µM i dalje je imala stopu preživljavanja stanica preko 85 posto. Ovi rezultati pokazuju da OA u koncentraciji od 5-20 μM nema citotoksične učinke na ljudske HaCaT keratinocite (Slika 1A). U skladu s tim, OA je proučavan u koncentraciji od 5-20 uM kako bi se istražilo njegovo antioksidativno i antipollucijsko djelovanje kod oštećenja keratinocita izazvanih PM-om. Nedavno su mnoge studije pokazale da je PM čest onečišćivač zraka koji uzrokuje prekomjernu proizvodnju ROS-a i naknadno oštećenje kožnog sustava kroz niz oksidativnog stresa, uključujući peroksidaciju lipida, karbonilaciju proteina i mutaciju DNA [14-16]Kao što je prikazano u Slika 1B, tretman PM-om značajno je povećao proizvodnju ROS-a u usporedbi s netretiranom skupinom (str<0.05).in contrast,="" pretreatment="" with="" oa="" effectively="" decreased="" pm-induced="" ros="" overproduction="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05).there-fore, these="" results="" suggested="" that="" oa="" possessed="" antioxidant="" activity="" to="" prevent="" pm-induced="" oxidative="" stress="" by="" reducing="" the="" ros="" overproduction.="" in="" addition,="" ros="" overproduction="" after="" pm="" exposure="" can="" activate="" the="" phosphorylation="" of="" mapks="" proteins,="" including="" p-erk,="" p-p38,="" and="" p-jnk,="" triggering="" the="" protein="" expressions="" of="" inflammation="" and="" aging[17,18]the="" present="" study="" also="" found="" that="" pm="" treatment="" can="" increase="" the="" expression="" of="" inflam-matory="" proteins="" (cox-2="" and="" nf-kb),skin="" aging-related="" proteins="" (mp-1,mmp-9="" and="" timp-1),and="" phosphorylation="" of="" erk,jnk,="" and="" p38=""><0.05). our="" present="" results="" also="" demonstrated="" that="" oa="" at="" 10="" and="" 20="" um="" significantly="" inhibited="" the="" protein="" expression="" of="" nf-kb="" and="" cox-2="" when="" compared="" with="" the="" pm="" treatment="" group="" (p=""><0.05)(figure 1c)furthermore,="" oa="" pretreatment="" also="" effectively="" reversed="" pm-induced="" alteration="" on="" mmp-1="" and="" timp-1="" expression=""><0.05) but="" had="" no="" effect="" on="" mmp-9(figure="" 1d).="" we="" further="" de-termined="" the="" effects="" of="" oa="" treatment="" on="" phosphorylation="" of="" mapks="" during="" pm="" exposure,="" and="" our="" results="" indicated="" that="" oa="" could="" inhibit="" the="" phosphorylation="" of="" jnk=""><05), but="" had="" no="" effect="" on="" erk="" or="" p38="" (figure="" 1e).="" according="" to="" the="" above="" results,="" when="" dissolved="" in="" dmso,="" oa="" displayed="" good="" skin-protective="" activity="" and="" could="" ameliorate="" pm-induced="" ros="" overproduction,="" jnk="" activation,="" and="" inflammatory="" and="" skin-aging="" protein="" expression="" in="">

3.2. Nanovlakna oleanolne kiseline povećala su topljivost u vodi i prodiranje sirove oleanolne kiseline u kožu poboljšanjem fizikalno-kemijskih svojstava

3.2.1. Morfologija površine oleanolne kiseline i njezinih nanovlakana

Pod SEM promatranjem, izgled HPBCD predstavljao je sferičnu i poroznu pomoćnu tvar, a njegova je veličina bila oko 20 do 50 μm（Slika 2A）. PVPK90 je pomoćna tvar s nepravilnim poligonalnim česticama i veličinom čestica većom od 60 um (Slika 2B) .Sirova oleanolna kiselina je nepravilno okrugli granulirani prah veličine 3-60 um. Slika 2D-F prikazuje srednji promjer vlakana različitih težinskih omjera oleanolne kiseline: HPBCD:PVPK90 iznosio je 174,83±19,53 nm, 219,23±18,93 nm i 403,17±32,99 nm, redom. Utvrđeno je da veći omjer HPBCD(18 :20) doveli su do toga da OAnf ima veći promjer vlakana (Tablica 1).

3.2.2. Veličina čestica i morfologija OAnf rekonstituiranog u vodi

Kako bismo promatrali oblik i veličinu čestica OAnf (OA:PVP:HPBCD, 1:8:20) otopljenog u vodi, slika OAnf pod transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) pokazala je da su čestice oleanolne kiseline bile sferične i jednoliko raspršene u vodi (Slika 3). Veličina čestica također je potvrđena laserskim analizatorom veličine čestica (Tablica 2). Veličine čestica OA i OAnf bile su 5079,50±384,87 nm odnosno 302,37±11,91 nm. Indeksi polidisperznosti (PDI) OA i OAnf bili su 1,63±0,21 odnosno 0,32±0,02. Ovi rezultati pokazuju da je proces elektropredenja učinkovito smanjio veličinu čestica OA s ravnomjernom distribucijom čestica i rezultirao povećanjem površine.

3.2.3. Punjenje lijekom, učinkovitost inkapsulacije i topljivost u vodi nanovlakana oleanolne kiseline

Kao što je prikazano u tablici 3, postoci punjenja OA u različitim omjerima pomoćnih tvari bili su 72,36±10,45 posto, 84,23±3,62 posto, odnosno 98,19±4,82 posto. Rezultati su pokazali da veći omjer HPBCD pokazuje bolji učinak punjenja lijekom. Učinkovitost inkapsulacije svih formulacija bila je veća od 95 posto, što je pokazalo da su PVPK90 i HPBCD učinkovito inkapsulirali OA. Osim toga, topljivost OAnf u vodi s različitim omjerima pomoćnih tvari bila je 296,14±57,75 ug/mL, 395,87±32,77 ug/mL , odnosno 998,7±58,32 ug/mL.cistanche Genghis KhanOvi rezultati su pokazali da povećanje HPBCD u formulaciji dramatično povećava topljivost u vodi sirovog OA. Nasuprot tome, topljivost u vodi sirovog OA nije se mogla odrediti jer je bila ispod granice detekcije (0,01 ug/mL) u HPLC metodi. Ovaj rezultat je pokazao da je 1:8:20 OAnf imao više nego 1000-struko poboljšanje topljivosti u vodi u usporedbi sa sirovim OA. Stoga je u sljedećim studijama 18:20 OAnf korišten za određivanje biološke aktivnosti u modelu oštećenja keratinocita izazvanog PM-om.

3.2.4. Kristalna promjena oleanolne kiseline i njezinih nanovlakana

Difrakcijski uzorci rendgenskih zraka (XRD) sirovog OA, pomoćnih tvari i njegovih nanovlakana prikazani su na slici 4. Sirovi OA pokazao je višestruke karakteristične difrakcijske vrhove visokog intenziteta pri kutu skeniranja od 5 stupnjeva -20 stupnjeva, što ukazuje da sirovi OA bio je kristalni spoj. S druge strane, difrakcijski uzorci PVPK90 i HPBCD nemaju očigledne karakteristične difrakcijske vrhove. Osim toga, za sirovi OA pod elektropredenje obradom, svi karakteristični difrakcijski vrhovi sirovog OA potpuno su nestali, što ukazuje da je priroda sirovog OA je transformiran iz kristalnog u amorfni (Slika 4). Prema ovim rezultatima, mogli bismo zaključiti da je sirova oleanolna kiselina uspješno inkapsulirana u HPBCD i inkapsulirana pomoću PVPK90 nakon procesa nanovlakna.

3.2.5. Stvaranje intermolekularne vodikove veze između oleanolne kiseline i pomoćnih tvari

Intermolekularna interakcija sirovog OA i HPBCD s PVPK90 određena je FTIR spektroskopijom, a rezultati su prikazani na slici 5. FTIR spektar jasno je pokazao apsorbanciju nekoliko kemijskih funkcionalnih skupina sirovog OA, uključujući apsorpcijsku vrpcu na 3463 cm{{ 3}} (——OH rastezljiva vibracija), 1696 cm-1 (——C=O rastezljiva vibracija) i 1462 cm-l (—CHz rastezljiva vibracija) (Slika 5). Kada su OA, PVPK90 i HPBCD kompleksirani u nanovlakna, apsorbancija ovih kemijskih funkcionalnih skupina očito se pomaknula na nižu apsorpciju. Ovi su nalazi bili indikativni za interakcije međumolekularnih vodikovih veza između OA i HPBCD s PVPK90. Osim toga, ova studija je također koristila 'H NMR za potvrdu intermolekularne interakcije OA i ekscipijenata. 1HNMR spektar neobrađenog OA (Slika 6C) pokazao je karboksilni signal na 812 ppm (H28), dvostruko vezane protone na 85,15 ppm (H12), signal hidroksi protona na 83,38 ppm (H3) i metilne protone (81 ppm). , HNMR spektar OA nanovlakana pokazao je da je karboksilni signal OA nestao, a kemijski pomaci dvostruko vezanih, hidroksi i metilnih protona očito su pomaknuti gore (Slika 6). Ovi rezultati pokazali su stvaranje intermolekularnih vodikovih veza između OA i ekscipijenata, što je poduprlo uspješnu inkapsulaciju OA pomoću HPBCD i PVPK90.

3.2.6. In vitro prodor sirove oleanolne kiseline i njezinih nanovlakana u kožu

Biološka aktivnost topikalne formulacije najviše ovisi o upijanju kožom. Prodori sirovog OA i njegovih nanovlakana u kožu određeni su u ex vivo svinjskoj koži. Kao što je prikazano na slici 7, manji sadržaj OA（<5 μg/cm2）was="" detected="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" after="" 1,2,="" and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" and="" these="" results="" also="" indicated="" that="" raw="" oa="" could="" not="" penetrate="" the="" skin="" in="" a="" time-dependent="" manner.="" the="" result="" showed="" that="" the="" skin="" absorption="" of="" raw="" oa="" was="" extremely="" poor.="" by="" contrast,="" the="" nanofiber="" formulation="" dramatically="" increased="" the="" content="" of="" oa="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" with="" 19.63="" ug/cm2,31.56="" ug/cm2,and="" 45.27="" ug/cm2="" after="" 1,2,and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" respectively.="" these="" results="" demonstrated="" that="" the="" oanf="" formulation="" significantly="" increased="" skin="" absorption="" when="" compared="" with="" the="" raw="" oa="" topical="" administration=""><>

3.3. Nanovlakna oleanolne kiseline u necitotoksičnim koncentracijama imaju bolju aktivnost protiv zagađivača poboljšavanjem antioksidativne, protuupalne aktivnosti i aktivnosti protiv starenja

Slično OA otopljenom u DMSO, OAnf otopljen u PBS pri 40 uM i 80 uM smanjio je održivost HaCaT stanica na 14,1 posto odnosno 5,6 posto (Slika 8A). Stoga je 10 uM OAnf procijenjeno na daljnje antioksidativno i antipollucijsko djelovanje kako bi se razumjelo imaju li OA i njegova nanovlakna sposobnost inhibicije prekomjerne proizvodnje ROS-a uzrokovane PM-om. Slika 8B pokazuje da je OAnf pri 10 uM značajno smanjio prekomjernu proizvodnju ROS-a izazvanu PM-om. Također smo izračunali stopu inhibicije proizvodnje ROS kako bismo usporedili antioksidacijsku aktivnost između OA otopljenog u PBS-u i OAnf. Deset mikromolarnih OA u PBS-u rezultiralo je 28,3-postotnom inhibicijom proizvodnje ROS-a, a OAnf je postigao 97,6-postotnu inhibiciju (Slika 8B). Ovi rezultati pokazuju da je OAnf imao bolju antioksidacijsku aktivnost od OA u PBS-u u PM-induciranom oksidativnom stresu u keratinocitima. Osim toga, usporedili smo i protuupalnu aktivnost oštećenja keratinocita izazvanih PM-om. Predtretman sa sirovim OA u PBS-u nije mogao inhibirati PM-induciranu ekspresiju proteina NF-KB i COX-2 Nasuprot tome, predtretman s OAnf u PBS-u značajno je smanjio ekspresiju NF. kB i COX-2 u stanicama tretiranim PM-om (str<0.05).these results="" supported="" that="" oanf="" in="" pbs="" had="" better="" anti-inflammatory="" activity="" than="" raw="" oa="" in="" pbs="" (figure="" 8c).then,="" we="" also="" compared="" their="" anti-skin-aging="" activity.="" pretreatment="" with="" oa="" in="" pbs="" had="" no="" effects="" on="" pm-induced="" mmp-1="" or="" timp-1="" alteration.="" however,="" oanf="" in="" pbs="" could="" reduce="" the="" expression="" of="" mmp-1="" and="" rescue="" the="" expression="" of="" timp-1="" when="" compared="" with="" the="" pm-induced="" keratinocytes="" damage="" group=""><0.05)(figure 8d).these="" findings="" indicated="" that="" oanf="" possessed="" better="" anti-skin-aging="" properties="" than="" raw="" oa="" in="" pbs.="" finally,="" we="" analyzed="" the="" phosphorylation="" of="" erk,="" jnk,="" and="" p38="" to="" confirm="" the="" regulation="" of="" mapks="" signaling.="" figure="" 8e="" showed="" that="" the="" treatment="" of="" raw="" oa="" in="" pbs="" could="" not="" downregulate="" pm-induced="" phosphorylation="" of="" these="" mapks="" protein.="" however,="" pretreatment="" with="" oanf="" only="" reduced="" pm-induced="" phospho-jnk="" (p-jnk)="" expression="" but="" had="" no="" effect="" on="" p-erk="" and="" p-p38="" (figure="" 8e).the="" percentage="" changes="" of="" protein="" expression="" induced="" by="" oa="" in="" dmso,="" oa="" in="" pbs,and="" oanf="" in="" pbs="" are="" summarized="" at="" table="" 4.="" oanf="" in="" pbs="" markedly="" reversed="" pm-induced="" protein="" alterations,="" which="" was="" barely="" observed="" in="" oa="" in="" the="" pbs="" group.="" in="" addition,="" the="" effects="" of="" oanf="" in="" pbs="" were="" comparable="" to="" the="" equivalent="" amount="" of="" oa="" in="" dmso,="" which="" indicated="" that="" the="" electrospinning="" process="" increased="" the="" water="" solubility="" of="" oa="" without="" altering="" its="" bioactivities.="" accordingly,="" oanf="" effectively="" inhibited="" the="" expressions="" of="" inflammatory="" proteins="" and="" skin-aging="" proteins="" and="" downregulated="" the="" mapks="" signaling="" pathway="" in="" pm-induced="" keratinocytes="">

4. Rasprava

U posljednje vrijeme praćenje koncentracije čestica u zraku postalo je jedan od najvažnijih pokazatelja za ocjenu indeksa kvalitete zraka. Koža je najveći imunološki organ ljudskih bića, a pretjerano izlaganje PM-u može oštetiti funkcije kože. Jin i sur. otkrili su da različite vrste PM-a ne samo da ostaju u vanjskom stratum corneumu epidermisa, već također prodiru u stratum spinosum i folikule dlake [14]. Ako se duže vrijeme izloži prekomjernoj PIA, to će uzrokovati disfunkciju kožne barijere i povezano je s mnogim kožnim bolestima, poput atopijskog dermatitisa, psorijaze, akni i starenja [19,20]. Dijkhoff i sur. jasno ilustrira da PM može potaknuti egzogeno i endogeno stvaranje ROS-a, što rezultira progresijom oksidativnog stresa, uključujući peroksidaciju lipida, oksidaciju proteina, disfunkciju mitohondrija, oštećenje DNA, aktivaciju upale i ubrzanje procesa starenja [15]. Sukladno tome, suzbijanje prekomjerne proizvodnje ROS-a izazvane česticama je dobra strategija i prvi izbor za sprječavanje oštećenja od oksidativnog stresa tijekom prekomjerne izloženosti česticama. Prethodne studije su također pokazale da tretmani antioksidansima, kao što su difloretohidroksikarmalol [21], dieckol [22], ekstrakt Opuntia humifusa [23] i ekstrakt trpke trešnje [24] mogu učinkovito ublažiti disfunkciju keratinocita izazvanu PM-om. Naši rezultati također su otkrili da OA u DMSO-u može smanjiti prekomjernu proizvodnju ROS-a izazvanu PM-om i spriječiti štetu od PM-a. Osim toga, NF-kB je sveprisutni i inducibilni faktor transkripcije koji regulira ekspresiju proupalnih proteina, kao što je COX-2, koji imaju ključnu ulogu u mnogim kožnim bolestima. Naši su rezultati spomenuli da OA može umanjiti aktivaciju NF-kB izazvanu PM-om za inhibiciju ekspresije upalnog proteina COX-2[25]. Štoviše, aktivacija signalizacije MAPK može pojačati ekspresiju AP-1 i dovodi do regulacije transkripcije MP[18]. U ovoj studiji, OA je uspio suzbiti ekspresiju proteina starenja kože MP-1 i povećati ekspresiju proteina TIMP-1 koji sprječava starenje kože kako bi se spriječilo starenje keratinocita izazvano PM-om. Naši su rezultati također pokazali da je OA učinkovito inhibirao fosforilaciju JNK. Stoga OA može inhibirati upalu kože izazvanu PM-om i starenje regulacijom signalnog puta ROS/JNK kod oštećenja keratinocita izazvanih PM-om.

Prema našim saznanjima, slaba topljivost aktivnih spojeva u vodi povezana je s niskom bioraspoloživošću, što ograničava njihovu primjenu u medicini, prehrambenoj i kozmetičkoj industriji [26,27]. Dobro je poznato da spojevi s slabom topljivošću u vodi imaju nekoliko zajedničkih fizikalno-kemijskih karakteristika, kao što su pretjerano velika veličina čestica, niža površina, lipofilna struktura i kristalni oblik [28]. Naši su rezultati također pokazali da sirovi OA ima ova fizikalno-kemijska svojstva, uključujući veliku veličinu čestica (5079,50±384,87 nm), 3-60 um nepravilan granulirani prah s nižom površinom (slika 2C) i očiti kristalni oblik. Ovi rezultati pokazuju da je topljivost OA u vodi niža od 0,01 ug/mL i da se može klasificirati kao praktički netopljivi aktivni spoj prema klasifikaciji topljivosti u vodi Farmakopeje Sjedinjenih Država (USP) [29]. Ako se ti nedostaci ne mogu riješiti, aktivnosti OA na koži bile bi uvelike ograničene. U ovoj studiji uspješno su korišteni PVPK90 i HPBCD kao nosači pomoću procesa elektropredenja za pripremu OAnf. Poboljšanje topljivosti u vodi glavni je indeks koji se koristi za potvrdu optimalne farmaceutske formulacije, a naši su rezultati pokazali da OA:PVPK90:HPBCD u omjeru 1:8:20 ima najbolju topljivost u vodi. To ukazuje da je OAnf učinkovito povećao topljivost u vodi sirovog OA ovisno o omjeru HPBCD. Slično tome, prethodne studije također su otkrile da viši omjer ciklodekstrina povećava kapacitet kapsulacije formulacije i rezultira značajnim povećanjem topljivosti u vodi i biološke aktivnosti kurkumina [30], resvera-trola [12], timola [31] i difenokonazol[32]. Štoviše, ova studija također je usporedila fizikalno-kemijska svojstva sirovog OA i njegovih nanovlakana kako bi se razjasnili mehanizmi poboljšanja topljivosti OA u vodi. Nanovlakna OA proizvedena u ovoj studiji bila su filamenti jednake nano veličine. Rezultati analize veličine čestica također navode da OAnf rekonstituiran u vodi ima čestice nano veličine s vrhunskom homogenošću distribucije. Ovi rezultati pokazuju da OAnf ima veću površinu od sirovog OA. Osim toga, stvaranje međumolekularnih vodikovih veza između aktivnih spojeva i nosača također može doprinijeti poboljšanju topljivosti u vodi. Spektar FTIR i HNMR OAnf-a pokazao je da je sirovi OA učinkovito inkapsuliran u HPBCD i formirao stabiliziranu strukturu nanovlakana s PVPK90 stvaranjem međumolekularne vodikove veze između OA i HPBCD/PVPK90. Kristalni oblik transformiran u amorfni oblik aktivnog spoja također je pokazatelj poboljšanja topljivosti u vodi. XRD uzorak OAnf pokazao je da je kristalna struktura sirovog OA transformirana u amorfnu strukturu nakon formiranja nanovlakana. Ovaj sličan rezultat također je primijećen u nekoliko aktivnih spojeva unesenih u nanovlakna [12,30]. Uzevši zajedno, formulacija nanovlakana učinkovito je poboljšala topljivost u vodi sirovog OA kroz poboljšanje fizikalno-kemijskih svojstava, uključujući smanjenje veličine čestica, povećanje površine, stvaranje vodikove veze s nosačima i amorfnu transformaciju.

Topikalne formulacije koje sadrže antioksidanse učinkovite su za isporuku epidermisu i dermisu kako bi se suprotstavile oksidativnom stresu izazvanom PM-om, upalama i starenju kože [33]. Na temelju znanja o apsorpciji kože, stratum corneum je čimbenik koji ograničava brzinu prodiranja u kožu i apsorpciju aktivnih spojeva, što rezultira smanjenjem biološke aktivnosti [34]. Rezultat in vitro prodiranja u kožu pokazao je da je OAnf prošao kroz stratum corneum lakše i brže od sirovog OA i ostao u epidermisu i dermisu u velikim količinama. Ovaj je rezultat potvrdio da OAnf može učinkovito poboljšati kožnu apsorpciju sirovog OA. Dalje, kako bi se utvrdilo ima li OAnf bolju aktivnost protiv zagađenja od sirovog OA, u ovoj studiji korišten je model oštećenja keratinocita izazvan PM-om za usporedbu njihovih bioloških aktivnosti. Naši su rezultati pokazali da OAnf u PBS-u ima bolje učinke protiv onečišćenja od sirovog OA, uključujući smanjenu prekomjernu proizvodnju ROS-a, smanjenu ekspresiju upalnih proteina (COX-2 i NF-kB) i proteina starenja kože (MP-1), povećana ekspresija proteina protiv starenja kože (TIMP-1) i smanjena fosforilacija JNK. Stoga bi OAnf mogao biti topikalna formulacija kao antioksidans za sprječavanje oštećenja keratinocita uzrokovanog PM-om.

Ukratko, OAnf je poboljšao svoja fizikalno-kemijska svojstva kako bi riješio problem slabe topljivosti sirovog OA u vodi, a također je značajno poboljšao upijanje sirovog OA kožom. OAnf je imao bolje antioksidativno, protuupalno i anti-starenje djelovanje kod oštećenja keratinocita izazvanih PM-om. Sukladno tome, predlažemo da bi se OAnf mogao koristiti kao proizvod za njegu kože ili kao farmaceutska formulacija za sprječavanje oštećenja kože izazvanih PM-om u budućnosti.

Ovaj je članak izvađen iz Antioxidants 2021, 10, 1411. https://doi.org/10.3390/antiox10091411 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants